82.生物机体的生物钟是如何同步的?

What synchronizes an organism’s circadian clocks？

题记：在所有的生物体内都存在生物钟基因(Circadian clock genes)，它分布于生物体的各个组织和器官的细胞中。目前的问题和挑战是弄清楚所有的这些生物钟齿轮是如何同步在一起的，以及是什么让生物钟能够设定同一时间节律。

我们不难发现生物机体存在生物活动的周期性节律，即生物钟。宏观最常见的周期性节律表现就是睡眠和饮食。如果睡眠不足白天人就会感到疲惫，生物节律不仅控制着人体的睡眠、饮食和免疫反应等行为，还会影响人的情绪、精神状态、血压、饥饿感、新陈代谢、内分泌、免疫、消化、心脏功能等各个组织器官的各个方面。那到底什么是生物节律?本质上，它就是生命活动的节奏。地球上所有形式的生命都会对太阳、月亮和季节的规律做出周期性有节奏的反应，即被称为生物体的昼夜节律(或生物钟)。

图1 昼夜更替和睡眠/清醒生物节律

生物体的周期节律存在于整体到器官、组织到细胞的各个层次，也就是生物体小到每一个组织细胞的生理活动都呈现周期性节律现象，即每一个细胞都是一个生物钟。现在的问题是：生物细胞的生物钟如何产生并被同步为器官的周期节律，继而又进一步同步为生物体的生物节律，这就是生物钟的同步问题。

在科学问题73青春期的产生之中我们已经揭示：生物体和时间有关的周期性现象在分子层次上是来源于体内激素水平的生理化学调节，而激素水平则决定于和环境关联的相关基因的表达。为了说清楚生物周期节律问题，首先在细胞水平上来解释生物钟是如何形成的？答案就是：生物钟基因的周期表达(J Mol Endocrinol. 2019, 63(4): R93–R102)。也就是在细胞水平上，生物钟的出现依赖于核心时钟基因转录的调控过程。显然如果细胞生物钟是在基因的水平上体现的节律振荡，那么这个节律就必然是一种可以跨物种并能够遗传的生理活动规律，当然能它的存在体现了生物钟是生物在地球环境下长期进化的结果。

第一个时钟基因的发现源于对行为周期异常的突变果蝇的研究，该基因被称为period基因(简称如per1、per2和per3)，这个研究从分子层次上为理解生物钟振荡现象奠定了理论基础。per基因表达活性具有典型的昼夜节律特征，PER蛋白的水平呈现24小时(24h)的振荡现象，per基因活性是通过PER蛋白的核心反馈回路来调节的。然而无法独立进入细胞核的PER蛋白是怎样调节per基因表达的？这就导致了另一种时钟基因timeless基因(简称tim基因)的发现，它的表达物是TIM蛋白，随着PER和TIM蛋白浓度上升，二者会结合为二聚体进入细胞核从而抑制时钟基因的表达，形成反馈闭环。2017年三位独立研究果蝇时钟基因的科学家被授予诺贝尔生理学及医学奖，以表彰他们在生物节律研究方面所做出的开创性贡献。

图2 2017年诺贝尔生理和医学奖

对果蝇时钟基因的研究启发了对具有异常昼夜行为模式小鼠节律基因的研究，从而发现了第一个哺乳动物的核心时钟基因，称为clock基因，其表达为CLOCK蛋白。小鼠体内的CLOCK蛋白与果蝇的PER蛋白高度相似(当然高等动物和人类也存在per基因)，它也必须通过它的聚合体BMAL1形成二聚物CLOCK/BMAL1结合到节律基因per等的调控因子上去调节节律基因的转录表达(如图2所示）。然而科学家们在哺乳动物生物钟核心基因调控回路之外又发现了多个反馈回路(如和隐色素基因cryptochrome相关的负反馈调节)，揭示了生物节律调控一个复杂的微观反馈调节网络(如图3所示）。当然除了细胞内各种基因和蛋白的微观调控外，生物体外部生存环境对于机体组织内和组织细胞间同步节律的影响在本质上却起着主导作用。虽然生物体的昼夜节律在没有外部刺激的情况依然能够持续存在，但外部刺激对于同步或节律引导从长期或进化的意义上讲应该是决定性的。

图3 TIM蛋白和PER蛋白的反馈调节和复杂的调控网络

我们生存的地球自转约24h是大多数物种内在生物钟发展的主要进化力量，哺乳动物的生物钟已经进化为适应地球上24h的光照周期。对植物而言它需要光照来产生能量，显然昼夜循环与植物代谢紧密相关；对动物来说，它们也必须适应与光照和温度周期相相关的行为变化，除了睡眠静息和清醒活动的周期节律外，哺乳动物还有许多其他方面的24h生理节律，如体温的波动、激素水平和新陈代谢等等。保持机体活动(如进食和睡眠)和细胞活动(如激素表达)的同步有助于不同组织器官的系统性协调和功能优化。虽然对细胞水平维持生物钟完整机制的认识还在不断发展，但通过一组核心生物钟基因的转录激活或抑制，以及更广泛地通过募集修饰染色质状态的蛋白来调节大型基因转录网络，是生物体保持生物钟节律的基础模式。然而从细胞水平的生物钟节律到底是如何同步到整体生物钟节律，或者整体的生物钟节律是如何从细胞水平节律基因的表达同步到整体节律的？是什么同步了这些不同生理过程，生物节律具体是通过什么机制或过程形成的？

最初大多数研究者认为昼夜节律的产生是由光驱动引起的同步，比如最初发现的per基因的表达过程；然而，研究发现光线仅仅是影响生物钟同步的众多信号之一。虽然长期以来对哺乳动物生物钟的研究主要集中在以下丘脑视交叉上核(SCN: suprachiasmatic nucleus)为中心的反馈机制上，但我们现在知道生物钟本身实际上是不同组织细胞内在核心节律特性的表现，而SCN的功能主要是用于同步“外围”的时钟。生物钟的具体机制因生物而异，但在细胞水平上，它们都依赖于核心时钟基因组的转录调节，这是一种基于基因遗传的核心跨物种时钟机制，是一种细胞内因上的进化保护机制，而SCN从这个意义上讲只是同步的外因而已。

图4 核心时钟和外围时钟的同步关系示意图

对哺乳动物昼夜节律的早期研究揭示大脑会对光线信号做出反应，以同步调节睡眠/觉醒周期以及日常行为和神经内分泌节律。在对视网膜向下丘脑SCN轴突的研究中发现了光介导的中枢通路，针对这些通路的损伤和移植进一步证实了：SCN似乎是昼夜节律的主调节器，称为中央时钟。多年以后人们才发现一种特殊的内在视网膜神经节细胞群(ipRGCs：Intrinsically photosensitive retinal ganglion cells)，这些细胞含有光色素黑视素，ipRGCs通过视网膜下丘脑束传递的光信息能够设定SCN的主节律的相位，而不同相位的SCN产生不同的动作电位，从而对昼夜节律做出不同响应。

SCN是由下丘脑腹侧大约1万个神经元组成的异质性细胞群。根据SCN神经元表达的激素功能类型，SCN神经元主要分为两个激素表达分支：神经肽精氨酸抗利尿素(AVP：arginine vasopressin，精氨酸抗利尿素，主要调节肾脏对水分的吸收和血管的收缩)和血管活性肠肽(VIP：vasoactive intestinal peptide，一种在肠道中具有血管活性的肽激素，它是一种有效的血管扩张剂，可以调节平滑肌活动、上皮细胞分泌和胃肠道血流量)。然而，所有的SCN神经元都能表达抑制性神经递质GABA(伽马氨基丁酸,是哺乳动物枢神经系统最主要的抑制性神经递质)，并且后来还发现了其他几种神经肽激素也在SCN中表达，从而增加了SCN区域激素表达的复杂性。SCN腹外侧“核心”表达VIP的神经元能接受来自ipRGCs的突触输入，这些神经元的反应被认为对维持SCN内细胞同步表达非常重要。然而，最近又有证据表明，SCN内的星形胶质细胞对于维持同步也很重要，所以生物学上的任何事情都没有当初想象的那么简单。

图5 光驱同步中大脑SCN主时钟和外围组织时钟的关系

SCN神经元对入射光信号的反应具有很好的响应特征，内在过程涉及到SCN神经元上NMDA受体的激活、CAMKII的钙激活和基因转录的激活等等。在中央主时钟组件中，Per1和Per2基因对光线特别敏感，已被用作昼夜节律振荡的分子标记。此外，SCN中许多其他相关基因的表达，也都是由光驱动诱导的。

除了下丘脑中的SCN的中央时钟同步信号，生物钟本身就存在于其他组织的细胞内，这已在分离细胞实验中得到证实(当单个细胞从组织中移出分裂培养时，它们都能长期保持自己的时钟节律，但周期会发生改变，可延长如28h或缩短如21.5h)，不同组织细胞的节律性基因表达能对由SCN协调的信号作出同步反应，但也能对光以外的信号做出反应。所以，尽管SCN中央时钟用于同步这些“外围”时钟，但在外围某些组织中维持昼夜节律并不需要SCN的输入。生物钟与代谢之间的联系可以不受中央SCN时钟的影响，比如肝脏组织的生物钟可以被饮食时间所左右。当食物摄入的类型或时间被控制时，外周一些组织中的昼夜节律基因表达也会发生改变，包括肝脏、骨骼肌和胰腺在内的几个外周组织，其生物钟对激素信号和葡萄糖水平敏感。然而有趣的是肝脏细胞生物钟也依赖于光同步，因此，认为肝时钟只受食物影响，而SCN只受光线影响的简单观点并没有充分考虑外周时钟同步的复杂性。对婴儿生物钟的研究进一步确定了细胞同步不仅仅由SCN直接主导，婴儿生物钟与母体生物钟的同步显然是通过激素如褪黑激素的信号建立的，而婴儿出生后随着其大脑和视觉的建立，婴儿生物钟会从激素同步逐渐向自己的SCN光照同步转变，这期间必然会经历一个生物节律同步转变的调整过程。

图6 生物时钟的同步和生物生理活动的节律同步

中央时钟和外围时钟的同步对机体健康很重要，而昼夜节律同步的最重要表现之一似乎是食物摄入的时间。值得注意的是，虽然热量限制模式在改善整体健康和延长寿命方面取得了成功，但这些模式对食物摄入施加了时间限制。通过调节食物摄入量的动物研究表明，为了获得最佳的代谢表现，食物摄入的时间必须与其他昼夜节律(如活动、激素分泌、温度波动)保持同步或一致。

基因表达的昼夜节律调控是生物界普遍存在的生物钟模式，其远远超出了CLOCK/BMAL1在基因启动子上的结合调节，它还包括RNA聚合酶募集、染色质状态的调节、染色质结构和核定位等。其次生物钟基因及其调控的途径无疑嵌入了代谢途径，这既体现在食物摄入时间的影响上，也体现在与代谢基因网络的内在联系上。因此，昼夜节律基因转录的多级调控允许生物体同步代谢需求，通过将基因表达整合到一天中的特定时间来优化能量利用。显然调节饮食起居的昼夜节律可能对维持身心健康和延长寿命至关重要，人体生物钟的紊乱和同步异常会对人类的健康产生巨大影响。

图7 人体生理活动的周期节律

生物体昼夜节律是影响我们健康的一个关键因素。人体的昼夜节律根据地球24小时周期调节身体的各种生理过程，正常身体的功能都遵循昼夜节律一致的活动模式，即加速和减慢，增强和减弱。就连许多慢性疾病的症状也是如此，比如过敏症状、哮喘、心脏病、中风、心血管疾病、关节炎、溃疡、癫痫、代谢和内分泌紊乱等，这些疾病的症状强弱已被证实是基于一天中的不同时间。昼夜节律系统或生物钟的故障会导致昼夜节律紊乱，所有昼夜节律紊乱都有一个共同点，那就是正常的睡眠/觉醒周期被打乱，可见规律的饮食起居对健康的意义比食物的质量和睡眠的长短更加地重要。

时间生物学家(致力于研究医学健康和生物节律的关系)研究的各种生物节律周期中，24h的昼/夜或活动/休息周期被认为是医学诊断和治疗的关键生物学因素。当黑夜结束白天开始，人体重要的器官机能，包括心率和血压，都将会进一步加速和提升，这将导致身体功能的周期波动，反应了生物体的生物节律，而这些生物节律都由位于大脑中的生物钟机制进行调节和同步。医学时间生物学家发现生物节律也可以影响疾病症状的严重程度、诊断测试结果，甚至身体对药物治疗的反应。现在研究人员正致力于发现如何利用生命的节奏同步来改善医学实践和人体的健康。