在生物实验室与生物制药车间，有一种看不见的"隐形杀手"——支原体。它们没有细胞壁，体积仅0.1-0.3μm，能轻松穿透常规的0.22μm除菌滤膜；它们生长缓慢，多数情况下不会引起明显的细胞病变，却能在不知不觉中改变细胞的代谢、基因表达与功能，导致实验结果无法重复，甚至使整批生物制品报废。

在所有支原体污染物中，精氨酸支原体（Mycoplasma arginini）是最常见、危害最广泛的物种之一。它不仅是细胞培养的头号污染源，还能感染多种动物，甚至对免疫低下人群构成潜在威胁。

一、精氨酸支原体

精氨酸支原体属于柔膜菌纲支原体属，是一类缺乏细胞壁的原核生物，这一特性使其对所有作用于细胞壁合成的抗生素（如青霉素、头孢类）天然耐药。它的防控难点主要体现在以下三个方面：

1. 极致的体积优势：直径仅0.3-0.8μm，可变形穿过常规的0.22μm除菌滤膜，这是培养基和血清等试剂发生"无菌"污染的主要原因。

2. 隐蔽的生长特性：代时为1-9小时，生长缓慢且多数情况下不引起细胞裂解，仅导致细胞生长速率下降、活力轻微降低，极易被实验人员忽视。

3. 广泛的传播途径：自然宿主包括牛、羊等反刍动物，主要通过污染的胎牛血清进入实验室；同时它也是人类口腔的常见共生菌，可通过操作人员的飞沫、不规范的无菌操作在细胞系间交叉传播。

二、精氨酸支原体的多维度危害

1. 基础研究：破坏实验可靠性

精氨酸支原体污染是导致基础研究结果不可重复的最重要原因之一，其危害体现在多个层面：

代谢系统全面干扰：通过精氨酸脱亚胺酶途径大量消耗培养基中的精氨酸，导致细胞周期阻滞、染色体畸变、凋亡通路异常，使细胞的基本生物学特性发生不可逆改变。

基因表达与信号通路紊乱：可通过膜融合进入宿主细胞，干扰细胞内信号转导，导致基因表达谱发生全局性改变。

测序数据的"隐形污染"：据统计，至少11%的NCBI公共RNA-seq数据集和7%的全基因组测序数据存在支原体DNA污染，精氨酸支原体是主要污染源之一。2023年一项研究发现，一株历史立克次体分离株的基因组中存在精氨酸支原体的嵌合rRNA序列，导致已发表的基因组数据需要修正。

受污染细胞，图片来自参考文献

2. 生物制药：威胁产品质量与安全

精氨酸支原体污染是生物制药行业的重大风险点，单次污染事件可造成数百万至数千万元的经济损失。美国FDA 2020年发表的里程碑研究系统证实了其对单克隆抗体质量的严重影响：

电荷变体异常：酸性电荷变体比例随污染时间延长持续升高，主峰比例从正常的65%降至50%以下，直接影响药物的稳定性与药效。

糖基化修饰改变：高甘露糖型糖链（Man6及以上）占比可达17.4%，显著增加药物的体内清除率与免疫原性风险。

纯度与完整性下降：抗体纯度从96%以上降至56.3%，出现大量片段化产物；同时核酸污染水平显著升高，增加了临床用药的安全风险。

3. 兽医领域：危害反刍动物健康

长期以来，精氨酸支原体被认为是动物呼吸道的共生菌，但2023年意大利一项涵盖202只绵羊和80只山羊的大规模研究首次证实，精氨酸支原体是引起小反刍动物非典型肺炎的独立病原体，其致病性与公认的绵羊肺炎支原体（M. ovipneumoniae）相当：

主要感染8月龄以下的幼龄动物，夏季发病率最高；

可引起支气管上皮增生、肺泡巨噬细胞浸润、多核巨细胞形成等特征性病变；

单独感染可导致轻度至中度肺炎，与巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌等混合感染时会引发重症肺炎，死亡率显著升高。

三、精准检测技术

由于精氨酸支原体的隐蔽性，传统的肉眼观察和细胞活力检测完全无法发现污染，必须采用专门的检测技术。目前主流的检测方法可分为以下几类：

1. 传统方法

培养法：金标准，将样本接种于专用支原体液体和固体培养基，培养28天后观察"煎蛋样"菌落。优点是能检测所有活的支原体，是各国药典认可的金标准；缺点是周期极长、操作复杂，部分精氨酸支原体菌株难以在人工培养基上生长，容易出现假阴性。

指示细胞染色法：将样本接种于Vero或MDCK指示细胞，培养3-7天后用荧光染料染色，观察细胞核外的荧光点。优点是比培养法快，能检测难培养的菌株；缺点是操作繁琐，主观性强，低浓度污染容易漏检。

2. 生化检测法

基于支原体特有的酶活性检测：利用支原体特有的酶催化底物产生ATP，通过荧光素-荧光素酶系统检测发光信号。优点是快速（30分钟）、操作简单；缺点是灵敏度较低，只能检测活的支原体，无法区分具体物种，容易出现假阳性。

3. 分子生物学检测法（当前主流技术）

实时荧光定量PCR（qPCR）：目前应用最广泛的检测技术，采用TaqMan探针法可实现精确定量，灵敏度可达10拷贝/反应。特异性高，且能在同一反应中区分物种。比如上海翼和生物的支原体qPCR检测试剂盒，一次检测覆盖120种支原体，操作方便快捷，灵敏度高。

反向线印迹杂交（RLB）：可同时检测10种以上常见支原体污染物，适合大规模筛查和混合污染的鉴定。

4. 生物富集联合分子检测

为了解决PCR无法区分死活和低浓度污染漏检的问题，美国FDA和欧洲药典推荐采用"细胞培养富集+分子检测"的方案。研究证实，MDCK细胞是支持精氨酸支原体生长的最佳细胞系，经过7天的富集培养后，可检测到低至0.05 CFU/ml的污染，灵敏度与培养法相当，而周期从28天缩短至10天左右。

该方法结合了培养法能检测活菌和分子法快速灵敏的优点，特别适用于生物制品的放行检测。

四、精氨酸支原体污染的防控要点

1. 源头控制：所有进入实验室的培养基、血清、胰酶等试剂都必须经过严格的支原体检测；优先选择经过γ射线辐照灭菌的胎牛血清。

2. 操作规范：严格遵守无菌操作，避免交叉污染；操作人员佩戴口罩，禁止用嘴吹吸移液器。

3. 定期监测：所有细胞系每3个月至少检测一次支原体；新引进的细胞系必须经过隔离培养和支原体检测，确认阴性后才能进入实验室。

4. 污染处理：一旦发现污染，最好的方法是丢弃污染的细胞；对于珍贵的细胞系，可采用达托霉素（64μg/ml）或克林霉素（32μg/ml）处理3周，然后连续3次检测确认阴性后才能继续使用。

精氨酸支原体的污染具有隐蔽性强、危害广泛、防控难度大的特点，从基础研究的细胞培养到生物制药的大规模生产，再到兽医临床的疾病防控，都需要高度重视。选择经过验证的高灵敏度检测方法，建立完善的定期监测体系，是防范精氨酸支原体威胁的核心措施。

参考文献

[1] Boslett B, Nag S, Resnick A. Detection and antibiotic treatment of Mycoplasma arginini contamination in a mouse epithelial cell line restore normal cell physiology. Biomed Res Int. 2014;2014:532105. doi: 10.1155/2014/532105. Epub 2014 Mar 20. PMID: 24772428; PMCID: PMC3977478.

[2] Allerdice MEJ, Shooter SL, Galletti MFBM, Hecht JA, Karpathy SE, Paddock CD. Molecular identification and antibiotic clearance of Mycoplasma arginini and Mycoplasma orale from cell cultures infected with Rickettsia or Ehrlichia species. Microbiol Spectr. 2025 Feb 4;13(2):e0174324. doi: 10.1128/spectrum.01743-24. Epub 2025 Jan 16. PMID: 39817787; PMCID: PMC11792515.

[3] Volokhov DV, Kong H, George J, Anderson C, Chizhikov VE. Biological enrichment of Mycoplasma agents by cocultivation with permissive cell cultures. Appl Environ Microbiol. 2008 Sep;74(17):5383-91. doi: 10.1128/AEM.00720-08. Epub 2008 Jul 7. PMID: 18606798; PMCID: PMC2546620.

[4] Fratz-Berilla EJ, Angart P, Graham RJ, Powers DN, Mohammad A, Kohnhorst C, Faison T, Velugula-Yellela SR, Trunfio N, Agarabi C. Impacts on product quality attributes of monoclonal antibodies produced in CHO cell bioreactor cultures during intentional mycoplasma contamination events. Biotechnol Bioeng. 2020 Sep;117(9):2802-2815. doi: 10.1002/bit.27436. Epub 2020 Jun 4. PMID: 32436993; PMCID: PMC7496122.

[5] Son YS, Hong HJ. Generation and characterization of a monoclonal antibody with specificity for Mycoplasma arginini. J Microbiol. 2007 Dec;45(6):547-52. PMID: 18176539.

[6] Wang H, Kong F, Jelfs P, James G, Gilbert GL. Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization. Appl Environ Microbiol. 2004 Mar;70(3):1483-6. doi: 10.1128/AEM.70.3.1483-1486.2004. PMID: 15006769; PMCID: PMC368316.

[7] Pavone S, Crotti S, D'Avino N, Gobbi P, Scoccia E, Pesca C, Gobbi M, Cambiotti V, Lepri E, Cruciani D. The role of Mycoplasma ovipneumoniae and Mycoplasma arginini in the respiratory mycoplasmosis of sheep and goats in Italy: Correlation of molecular data with histopathological features. Res Vet Sci. 2023 Oct;163:104983. doi: 10.1016/j.rvsc.2023.104983. Epub 2023 Aug 15. PMID: 37639802.

[8] Khodakaram-Tafti A, Derakhshandeh A, Daee A A, Seyedin M. Identification of Mycoplasma capricolum subspecies capripneumoniae and Mycoplasma arginini by culture, PCR, and histopathology in pneumonic lungs of slaughtered goats in Mashhad, Iran. Iran J Vet Res. 2023;24(2):96-101. doi: 10.22099/IJVR.2023.45321.6655. PMID: 37790116; PMCID: PMC10542871.

支持单位：