Trinity无比强大，但是在组装结果还是太零散，此外内存占用也是硬伤。如果你有一个土豪机器，能一次运行几百G的程序，那建议将所有样本的PE reads清理后R1，R2相应合到一起，再用Trinity 进行PE组装。没有强大机器的人们一般会将多个样本分开组装，再通过一些手段对contig再组装，最后生成所有样本共同的Unigene，得到所有样本统一的reference，来比对计算差异表达。

这里推荐一款老牌的聚类组装软件——TGICL (TGI Clustering tools)，完成这个contig再组装的过程。它先使用mageblast对输入的fasta文件进行比对后聚类成cluster，再使用CAP3对每个cluster进行组装。此外因为聚类后各cluster间相互独立无交集，程序提供多线程的选项（来弥补CAP3这一步计算速度慢的缺陷）。

1. 下载安装

到https://sourceforge.net/projects/tgicl/files/?source=navbar下载最新版的TGICL (以最新版v2.1版为例)。建议下载TGICL-2.1.tar.gz原程序，貌似rpm/deb二进制的安装会有报错，具体没有深究，感兴趣的朋友可以使用rpm/deb格式的安装包进行安装，欢迎将过程分享到此博文下，谢谢。

tar -zxvf TGICL-2.1.tar.gz

cd TGICL-2.1

perl Build.PL
./Build
./Build test
./Build install

＃如果哪一步有permission denied的提示，则需要在命令前加sudo

如果在终端中输入

perldoc -F /usr/local/bin/tgicl

出现TGICL的help页面（如下图）则表示安装完成！

2. TGICL的使用

以某处为工作目录，将需去冗余和组装的fasta序列(例如Trinity组装结果中大于500bp的序列文件trinity_gt500.fasta)放到工作目录下，运行

tgicl -F trinity_gt500.fasta -c 3

这时可能会出现如下提示，可以不用理会：

Use of :locked is deprecated at /usr/local/share/perl/5.18.2/TGI/DBDrv.pm line 36.

运行完结果如下

err_tgicl_trinity_gt500.fasta.log和tgicl_trinity_gt500.fasta.log分别是标准错误输出和标准输出的记录文件，如果运行中无报错，两者应该是一样的。文件中记录了建立索引、聚类和组装三个过程的一些信息。

重点来了：

Q1：工作目录下trinity_gt500.fasta, trinity_gt500.fasta_cl_clusters, trinity_gt500.fasta.singletons和masked.lst这四个文件之间是什么关系？

为了清晰起见，这里既作了后三个文件中序列的韦恩图，又作了四个文件中序列的韦恩图。

结果显示

A. trinity_gt500.fasta_cl_clusters和trinity_gt500.fasta.singletons文件中的序列居然有交集！

B. trinity_gt500.fasta_cl_clusters和trinity_gt500.fasta.singletons的并集就是trinity_gt500.fasta中全体序列

C. masked.lst里的序列既有 trinity_gt500.fasta_cl_clusters里的，又有trinity_gt500.fasta.singletons里的序列

Q2：asm文件夹下的文件与cluster是什么关系？

因为-c指定用3个CPU，这里会生成3个文件夹asm_1,asm_2,asm_3。从这3个文件中的log_std发现这些log_std里的CL没有重复，而且加在一起正好是trinity_gt500.fasta_cl_clusters里的结果，表明程序先将trinity_gt500.fasta_cl_clusters中的cluster分给N个CPU（在N个文件夹中）来做的。然后，CAP3组装每个asm文件夹下log_std中的clusters，然而并不是每个cluster里的序列都能用上，组装没有用上的序列就写进了每个asm文件夹下的singletons文件里。

Q3：在第1个问题里rinity_gt500.fasta_cl_clusters和trinity_gt500.fasta.singletons为什么会有交集，交集又是什么？

Bingo! 想必大家也猜到了，这个交集就是所有asm文件夹下singlets文件中序列的并集。为了验证这个猜想，先检查一下所有asm文件夹下singlets文件是否有交集，发现没有，不出所料。所有asm文件夹下singlets文件里的序列的并集就是trinity_gt500.fasta.singletons和trinity_gt500.fasta_cl_clusters序列里的交集。发现正好是的，有猜想一致！

综上所述，最终的结构图是

因此只需要将trinity_gt500.fasta.singletons里的序列提出来，再将各asm文件夹下的contigs合并到一起换个Unigene的ID号即可。

vim collect_tgicl_result.py

将以下代码复制到collect_tgicl_result.py中

#!/usr/bin/env python
import sys, os
from Bio import SeqIO

'''collect_tgicl_result.py'''

def main(tgicl, singleton, fasta, *asm_dirs):
   unigene = 1
   with open('result.fasta', 'w') as result:
       for i in asm_dirs:
           for x in SeqIO.parse(os.path.join(i, 'contigs'), 'fasta'):
               print >> result, '>cluster_contig%sn%s' %(unigene, x.seq)
               unigene += 1

       fa_dic = {fa.id:fa.seq for fa in SeqIO.parse(fasta, 'fasta')}
       for i in open(singleton):
           print >> result, '>%sn%s' %(i.strip(), fa_dic[i.strip()])

if __name__ == '__main__':
   if len(sys.argv) == 1:
       print ('[prog] collect TGICL resultn'
       '[usage] python %s <singletons> <fasta> <asm*>n'
       '   <singletons> is located in workspacen'
       '   <fasta> is fasta file which was used to be clustered and assembledn'
       "   <asm*> are asm directories, `contigs' file must be in those dirsn"
       ) %(sys.argv[0])
       sys.exit(1)
   main(*sys.argv)

在工作目录下运行如下：

python collect_tgicl_result.py trinity_gt500.fasta.singletons trinity_gt500.fasta asm_*

运行完会生成一个tgicl_result.fasta文件，即TGICL聚类组装后最终的Unigene。

参考材料

［1］ Geo Pertea1, Xiaoqiu Huang, Feng Liang, et al. TIGR Gene Indices clustering tools (TGICL):a software system for fast clustering of large EST datasets. Bioinformatics. 2003, 19(5):651-652

［2］ http://bioinformation.cn/?p=563