Science | 朱世伟等揭示“战士”GBP蛋白家族的工作原理
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Science | 朱世伟等揭示“战士”GBP蛋白家族的工作原理
BioArt BioArt 2024-03-04 08:52 上海
细胞自主免疫（Cell-autonomous immunity）是单个细胞内部发生的固有免疫反应，旨在限制入侵细胞内的病原体（如细菌、病毒、寄生虫等）的复制与传播。在人体中，IFN-γ通过转录诱导数以千计的干扰素刺激基因（interferon stimulated genes, ISG）对抗病原体的侵染。2021年，来自耶鲁大学MacMicking团队发现了载脂蛋白APOL3和鸟苷酸结合蛋白（GBP）协同对入侵细胞的革兰氏阴性细菌双膜进行多管齐下的攻击，从而保护多种非免疫屏障细胞类型免受感染。（Science亮点 | 载脂蛋白能杀菌？人体“天然去污剂”APOL3可消灭胞内病原体）。鸟苷酸结合蛋白（GBP）是IFN-γ自我防御系统对抗病原微生物感染中的重要一员，还不清楚这一蛋白是如何参与有效的阻止微生物的侵染。2024年2月29日，耶鲁大学 MacMicking 团队（朱世伟 博士为本文的第一作者）在Science杂志在线发表了文章Native architecture of a human GBP defense complex for cell-autonomous immunity to infection。在这篇文章中，作者使用了模式细菌， 沙门氏菌直接侵染体外培养的HeLa细胞。在该实验体系中，作者鉴定了人类 GBP 家族的 4 个成员（GBP1、 GBP2、GBP3、GBP4）在沙门氏菌上组装成为多蛋白防御复合物。该复合物进一步诱导 caspase-4的活性，并通过 caspase-4 将 GSDMD 裂解成其成孔亚基，从而导致免疫细胞因子白介素 18 的 释放和细胞焦亡。
因为GBP1的基因敲除阻止了其它的免疫蛋白被招募到革兰氏阴性细菌表面，所以在整个信号级联反应中GBP1是上游信号通路的核心成员。然而GBP1是以什么样的形态被招募到革兰氏阴性细菌表面并未知晓。研究人员利用冷冻电镜断层成像（cryo-electron tomography， cryo-ET）技术首次捕捉GBP1与病原微生物表面的相互作用。GBP1采用 一种全新的“直立”的锚定构象并且以多聚的方式快速富集在细菌表面。这一富集导致了细菌 外膜的 破坏，释放了革兰氏阴性细胞外膜的脂多糖（LPS），来激活并诱导细胞焦亡。作者首先使用共聚焦荧光显微镜，作者发现了GBP1-4的整体复合物在细菌表面形成是严格依赖于GBP1与细菌表面的先行接触。GBP1 和Caspase-4 一样，都对细菌表面的脂多糖展现了敏感性。因此， GBP1与细菌表面结合或许导致LPS的释放，进而增强了Caspase-4的信号级联效应。为了验证这样一个假设，作者分别设计了体内和体外试验。体内试验表明，当不表达GBP1时候，宿主细胞内的沙门氏菌表面有清晰的LPS荧光信号，且该信号主要存在于细菌表面。然而，当宿主细胞正常表达GBP1的时候，不仅可以观察到包裹住沙门氏菌表面GBP1荧光信号，同时可以观察到散落在GBP1包裹层周围散落的 LPS信号。在体外试验上，1mM浓度的GBP1 纯化蛋白在GTP的存在下，可以有效的对沙门氏菌的进行包裹，同时导致了沙门氏菌本身LPS的释放。而LPS释放会使细菌外膜变得更加通透，进而变相的增强了其它抗菌效应蛋白的杀菌效力比如最近发现的ApoL3，具有去垢剂一样的功能，直接作用于细菌内膜。因此，体内与体外试验观察到的结果一致，即GBP1依赖于自身的GTPase 的酶活性形成了复合体包裹在细菌表面，并引起细菌表面LPS的释放。
尽管共聚焦显微镜和超分辨显微镜在细胞水平上观察到GBP1会形成对细菌的包裹，但是荧光显微镜的分辨率限制了对于识别细菌表面时的GBP1结构的了解。另一方面，虽然GBP1 在分子水平上晶体结构信息已知，但是缺乏与之对应的功能相关性。所以GBP1单一晶体结构并不能给予GBP1抗菌的功能的解释。更重要的是，需要一种更先进的观测技术去整合分子水平上得到的结构信息和细胞水平上的观测的功能信息。因此作者使用3D 冷冻电镜断层扫描技术对in situ 和ex situ进行全方位的调查。作者使用了光电关联冷冻荧光显微镜（cryo-CLEM）和冷冻聚焦离子束/扫描电子显微镜（cryo-FIB/SEM）以及冷冻电镜断层扫描技术研究GBP1 是如何在原位上形成对细菌的包裹。作者设计了一种能够变长沙门氏菌并进一步用此细菌感染了HeLa细胞， 这么做的目的之一是为了增大cryo-FIB/SEM处理过后的lamella中可观测到GBP1 包裹沙门氏菌的概率。作者捕捉到了vacuoled沙门氏菌表面光滑，并无其他蛋白coating的电子密度。相反，从vacuole膜里逃逸出来的沙门氏菌被GBP1 和其他相关免疫蛋白识别并在细菌表面形成了一层包裹。由于体内的沙门氏菌的免疫蛋白包裹层还含有其他的免疫蛋白的参与，并不能给予作者有效，精准的GBP1 包裹在细菌表面的构象信息。既然，体内与体外的荧光显微镜观察到了GBP1同样式的包裹现象。因此作者决定继续使用具有更高分辨率的冷冻电镜断层扫描技术对ex situ 的沙门氏菌细菌和GBP1相互作用进行进一步的观察。
与in situ 的情况相反的是，作者在ex situ试验时使用了哺乳动物细胞纯化的GBP1和一种迷你细胞的沙门氏菌作为ex situ cryo-ET观察的试验体系。使用了哺乳细胞纯化由来的GBP1免疫蛋白，这样做既保证了纯化得到的GBP1蛋白免于LPS的干扰，同时又确保了其本身翻译后的修饰。至于之所以选择迷你沙门氏菌是因为该迷你细胞有着更小的直径（大约300 纳米左右），这样的样品厚度适合cryo-ET 数据采集。补充说明的是作者通过共聚焦荧光显微镜和负染电子显微镜，在GBP1体外包裹试验中，发现变长的沙门氏菌，迷你沙门氏菌以及正常的沙门氏菌并无显著差别。通过冷冻电镜的三维重构，作者首先发现了GBP1包裹膜有着28nm左右的厚度，通过重构与平均化的图像处理，揭示GBP1采用了前所未有的结构变化，即C-terminal region伸展并以一种“直立”的构象像守卫的士兵一样“站立在”细菌的表面。作者进一步提供了三个强有力的证据去证实这一model。第一使用了1.8 nm的镍颗粒对这一构像的N端进行标记，而提供了topological的证据， 第二，设计了精巧的cross linking生化试验证明C端有一个非常大的结构变化。第三，进一步优化样品，即使用outer membrane vesical 代替迷你细菌，得到了更薄的样品（约150 nm样品厚度），并因此得到衬度更好的3D tomogram。总之，作者使用冷冻电镜断层扫描技术解析了数以千计复杂难懂的GBP免疫蛋白，在识别病原微生物细菌过程中，GBP1经历了戏剧性的构象开放，直接作用在革兰阴性细菌表面建立了宿主防御平台。这个平台促进了其他免疫伙伴的招募，包括GBP家族成员和炎症小体通路的组分，它们在干扰素-γ等激活细胞因子下启动保护性反应。阐明这一重要免疫蛋白在包围病原菌时的结构，不仅仅扩展了我们对人类细胞如何识别和对抗感染的理解，还可能对人类群体内的抗菌方法产生影响。值得注意的是，作者有机的整合了细胞水平上和分子上观察得到结果。进一步拓展了cryo-ET本身应用范围。即 cryo-ET不仅仅只用来观察核糖体，病毒以及微管的这样的模式样品，也可用于观察更小跟更灵活的蛋白复合物。
本文第一作者，朱世伟现已在凯斯西储大学医学院成立了实验室，欢迎对cryo-ET及在细胞生物学应用感兴趣的学生加入。诚招读取博士学位的学生1～2名和博士后若干名。目前实验室配备了cryo-FIB/SEM，cryo-CLEM，cryo-ET所需的所有相关设备。感兴趣的学生请投递简历。实验室的相关信息可浏览：https://www.shiweizhulab.org简历投递（有意者请将个人简历等材料发至）：https://jinshuju.net/f/ZqXwZt或扫描二维码投递简历
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http://doi.org/10.1126/science.abm9903
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