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[转载]李林:中药治疗阿尔茨海默病的作用特点

已有 604 次阅读 2021-11-29 18:34 |个人分类:思考中医|系统分类:论文交流|文章来源:转载

李林. 中药治疗阿尔茨海默病的作用特点. 生物化学与生物物理进展,2012,39(8):132-144

摘要:阿尔茨海默病(AD)是一种多因素相关的复杂性疾病,目前临床治疗效果不佳,仅针对单靶点或单致病途径的药物不易取得好的疗效。另一个重要原因是干预时机太晚,当诊断出痴呆时患者脑内已有大量神经元死亡。因此,应当针对多靶点、多途径治疗,同时将治疗时机提前到痴呆发生前,才有可能在 AD 的药物干预领域实现新的突破。本文综述了作者近十多年来在中药治疗 AD 方面的研究工作,包括中药新复方参乌胶囊、中药提取物何首乌二苯乙烯苷、山茱萸环烯醚萜苷、淫羊藿黄酮和淫羊藿苷对多种拟 AD 动物模型和细胞模型的影响及其作用机制。这些中药的特点是作用在 AD 复杂发病机制的多靶点和多途径,尤其是具有神经保护和神经营养 / 再生作用,且对线粒体和突触具有明显的保护作用,可望用于 AD 的早期干预或轻度认知障碍期(MCI)的治疗,从而阻止或延缓痴呆的发生与进程。

* 国家自然科学基金项目(90709011,30340090,30472184,30500664,30701092,30801526,30973513),北京市自然科学基金项目(7982006,7032013,7063079,7072033,7112061)和北京市科技计划项目(951890600,952601800,H01021013011,H020821390190,D0204003000031,D0206001043191)资助。

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是发生在老年及老年前期、以进行性认知功能障碍和行为损害为特征的中枢神经退行性病变。AD 患者脑组织有 3 种显著的病理变化:β- 淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积构成的老年斑(神经炎性斑),Tau 蛋白过度磷酸化为主要成分的神经原纤维缠结以及脑内基底核胆碱能神经元受损为主的神经元大量丢失。AD 的病因尚不清楚,发病机制非常复杂,发病过程涉及的环节较多,如基因变异[1]、表观遗传学[2-3]、内外环境因素[3-4]、蛋白质异常修饰[5-6]及在脑内的沉积[7]、神经营养减少及可塑性改变[8-9]、氧化应激[10-11]、离子通道[12]、金属离子代谢[13]及能量代谢紊乱[14]等,导致突触丢失、胆碱能神经元变性死亡。AD 的危险因素有老化、糖尿病、脑供血不足等。总体来说,AD 尚缺乏疗效满意的治疗药物。针对病因不清、多因素相关的复杂性疾病,中医药多靶点、多环节治疗的特点可能比单靶点治疗具有优势。因此,我们从 1995 年以来,致力于中药治疗 AD 的研究和新药开发。本文就十多年来我们的研究结果进行综述。

1  中药复方研究

我们从 1995 年开始,通过大量文献检索和查阅古方,从中医临床治疗老年期痴呆(包括 AD 和血管性痴呆等)或脑萎缩的60多个复方中选择使用频率较高的 6 类 33 味中药,包括补肾益智类 7 味、健脾补气类 6 味、祛痰开窍类 5 味、活血化瘀类 5味、清热解毒类 4 味、其他 6 味。在此基础上,结合中医理论和临床经验以及正交 t值法动物实验筛选结果[15],拟定了治疗 AD 的新复方,由制何首乌、淫羊藿、人参、石菖蒲、葛根、川芎 6 味中药组成,开发代号为 962 胶囊。中医理论认为老年性痴呆的病理机制为本虚标实,本虚主要为肾虚、脾虚,标实主要为痰浊、血瘀。新复方 962 胶囊的功能为补肾健脾、豁痰化瘀,符合中医理论。我们按照国家新药的要求,完成了该药的临床前药学、药理学和毒理学研究,于 2001 年获得国家药监局新药临床研究批件,并正式命名为参乌胶囊。目前已完成参乌胶囊治疗轻中度 AD、轻度认知障碍期(mild cognitive impairment,MCI)的 3 期临床试验.在临床前药效学研究中,我们根据 AD 复杂的发病机制,采用了多种拟 AD动物模型,观察了参乌胶囊治疗 AD 的药理作用及其机制。

a. 对 APP 转基因小鼠模型的影响。Aβ学说是AD发病机制的核心学说之一。应用淀粉样蛋白前体(amyloid protein precursor,APP)转基因小鼠模型可以了解药物是否能够干预 Aβ 的形成,作用在疾病的早期。本试验采用 3 月龄 APPV717I 转基因小鼠,发现该模型 4 月龄时开始出现学习记忆能力降低,10 月龄时脑内已有 Aβ含量和淀粉样斑块增多,早老素-1(presenilin-1,PS-1)表达增高,α-突触核蛋白(α-synuclein) mRNA 和蛋白质表达增多。参乌胶囊灌胃给药 6 个月(从 4 月龄至 10月龄)能够提高模型小鼠的学习记忆功能,减少颞叶皮层淀粉样斑块,减低海马区和大脑皮层 Aβ含量,抑制β- 分泌酶和 PS-1(部分代表 γ-分泌酶)表达,减低α-synuclein的 mRNA 表达和蛋白质表达[16-18]。

b. 对 Aβ 海马注射大鼠模型的影响。Aβ寡聚体增多对神经元的毒性作用是 AD发病的关键环节之一。将 Aβ 注射入大鼠海马,可模拟 AD 脑内Aβ形成以后的毒性作用过程,尤其是炎性反应和氧化应激。本试验结果显示,聚集态 Aβ25~35 注射入大鼠海马,引起海马区神经元损伤和丢失,小胶质细胞和星形胶质细胞激活,前炎性细胞因子白介素 1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)含量增多,一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性和一氧化氮(nitric oxide,NO)含量升高。参乌胶囊灌胃 3 周能够减低模型大鼠海马区神经元损伤和丢失,抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化,减少 IL-1β和TNF-α含量,抑制 NOS 活性,减少 NO 含量[19]。

c. 对胆碱能损伤拟 AD 大鼠模型的影响。AD 病人脑内胆碱能神经元大量丢失,胆碱乙酰基转移酶(choline acetyltransferase,ChAT)/ 乙酰胆碱酯酶(acetylcholine esterase,AchE)比值显著下降。鹅膏蕈氨酸是一种谷氨酸受体激动剂,通过与神经元胞体或树突上的 NMDA 受体结合导致神经元的毒性损伤和死亡。本试验结果显示,鹅膏蕈氨酸基底前脑注射模型大鼠学习记忆能力下降,大脑皮层和海马 ChAT 活性降低,ChAT/AchE 比值降低。参乌胶囊灌胃给药 1 个月能够改善模型大鼠学习记忆功能,增高大脑皮层和海马 ChAT/AChE 比值[20-21]。

此外,对东莨菪碱腹腔注射致记忆障碍大鼠模型,参乌胶囊灌胃给药能够提高模型大鼠学习记忆能力,提高大脑皮层和海马组织 ChAT 活性,降低AChE 活性,增强 M- 胆碱能受体结合力[22]。

d. 对线粒体功能障碍拟 AD 大鼠模型的影响。AD 病人脑内线粒体细胞色素 c 氧化酶(呼吸链复合体Ⅳ)减少。本实验应用线粒体复合体Ⅳ抑制剂叠氮钠皮下微泵恒速灌注 1 个月建立拟 AD 大鼠模型,发现模型大鼠学习记忆能力降低,海马和大脑皮层 ChAT 活性下降,M-胆碱能受体结合力降低,脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)及其受体 TrkB 含量减少。同时,模型组大鼠还一定程度地增高海马和大脑皮层 APP、Aβ、β-分泌酶、PS-1、磷酸化Tau蛋白、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)表达,减低蛋白磷酸酶 2A(protein phosphatase 2A,PP2A)含量[23-26]。提示线粒体功能障碍可能是 AD的早期始动因素,可引起 AD 多条途径的变化。参乌胶囊灌胃给药 1 个月能够改善模型大鼠的学习记忆功能,增高海马和大脑皮层 ChAT 活性,提高M- 胆碱能受体结合力,增高 BD酸化 Tau 蛋白的表达,增高 PP2A 含量。

e. 对自然衰老大鼠的影响。老化是 AD 的最大危险因素。自然衰老大鼠脑内多种改变与 AD 的病理变化类似,能够模拟 AD的慢性神经退行性病变的特点。本试验中,1、3、6、12、18、24 月龄大鼠的学习记忆能力、海马区突触素(synaptophysin,SYP)、ChAT、神经生长因子(nerve growth factor,NGF)及其受体 TrkA 表达随增龄变化,其中 6 月龄至 12 月龄(青壮年期)的各项指标最好,而 1 月龄(幼年期)和 24 月龄(老年期)大鼠的各项指标最差。与 6 月龄大鼠相比,24月龄大鼠神经元存活信号通路中胰岛素受体底物 -1(IRS-1)、磷脂酰肌醇 -3 激酶(PI3K)、70 ku 的S6 核糖体蛋白激酶(p70S6K)表达降低,星形胶质细胞增生[27-28]。参乌胶囊灌胃给药 3 个月(21 月龄至 24 月龄)能够改善老年大鼠学习记忆能力,增高海马区突触素、ChAT(胆碱能神经元的标志酶)、NGF 及其受体 TrkA 的表达,增强神经元存活信号通路中重要因子 IRS-1、PI3K、Akt、p-P70S6K 和p-CREB 表达,并且抑制胶质细胞增生[29-33]。

本试验同时还观察了药物对老年大鼠脊髓的影响,发现参乌胶囊灌胃给药 3 个月(21 月龄至 24月龄)能够增高老年大鼠脊髓腰节段神经营养因子NGF、BDNF 和 GDNF 含量,上调神经元存活信号转导通路中 p-CREB 表达,同时能够减低 Bax 表达,增强 Bcl-2 表达[34-37]。

f. 对 D- 半乳糖注射致脑老化小鼠模型的影响。氧化应激在 AD 的发病机制中起着重要作用。本试验应用 D- 半乳糖皮下注射小鼠模型,模型组脑内过氧化脂质含量升高,学习记忆功能下降。参乌胶囊灌胃给药 2 个月能够改善模型小鼠的学习记忆功能,减少脑组织过氧化脂质含量[38]。

g. 对慢性脑缺血致痴呆大鼠模型的影响。近年的研究发现,脑缺血、脑梗死等血管因素与 AD 的发病有密切关系,因此认为脑供血不足也是促进AD 发展的重要因素之一。本试验中,应用双侧颈总动脉永久性结扎 2 个月造成大鼠慢性脑灌注不足,模型大鼠出现学习记忆功能降低,海马区神经元数量减少,星形胶质细胞数量增多,神经营养因子 3(NT-3)表达降低[39-40]。参乌胶囊灌胃给药 2 个月能够改善模型大鼠空间及被动回避学习记忆功能,减少海马区神经元损伤和丢失,抑制星形胶质细胞增生,增强 NT-3 表达[41]。

h. 对糖尿病复合脑缺血致痴呆大鼠模型的影响。糖尿病是 AD 的危险因素之一,而且糖尿病患者多合并有血管性病变。本实验应用链脲佐菌素腹腔注射制备糖尿病模型,再应用双侧颈总动脉夹闭致全脑缺血再灌注,制备糖尿病复合脑缺血大鼠模型。参乌胶囊灌胃给药 1个月能够改善复合模型大鼠学习记忆能力,增高海马脑片长时程增强效应(表明突触可塑性增强),增高海马区神经营养因子NT-3 及其受体 TrkC 表达,增强神经元存活信号通路因子 Akt 表达,上调 Bcl-2 表达,下调 Bax 和caspase-3 表达,减少神经元损伤和丢失[42-44]。

i. 应用前景。参乌胶囊能够改善多种拟 AD 动物模型的学习记忆功能,在 AD 复杂发病机制的多个途径具有良好的药效学作用,尤其具有神经保护、神经营养作用,可能阻止或延缓神经元的变性和死亡。目前已经完成治疗轻中度 AD、MCI 的 3期临床试验,有良好的应用前景。此外,由于参乌胶囊对慢性脑缺血致痴呆大鼠模型也有明显疗效,因此还可能用于治疗血管性痴呆。

2 单味中药提取物的研究

2.1 何首乌二苯乙烯苷

为了了解参乌胶囊发挥药效作用的物质基础,我们应用参乌胶囊所含 6 味中药的 9 个主要标志成分,在体外试验和多种细胞模型中比较了它们的作用,初步明确了这些成分在 AD 发病机制不同靶点发挥的作用。同时还发现何首乌二苯乙烯苷的作用靶点最多,因此选择该药进行了新药的二次开发。

我们按照国家对新药的要求,完成了何首乌二苯乙烯苷(泰思胶囊)的临床前药学、药理学和毒理学研究,于 2007 年获得国家药监局新药临床研究批件,目前正在进行治疗轻中度 AD 的2期临床研究。在临床前药效学研究中,我们根据 AD复杂的发病机制,采用与参乌胶囊研究相似的多种拟AD动物模型和实验方法,观察了何首乌二苯乙烯苷(2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2 -O-β-D-glucoside,TSG)治疗 AD 的药理作用及其机制。

a. 对 APP 转基因小鼠模型的影响。4月龄APPV717I 转基因小鼠,给予 TSG 灌胃至10月龄,发现 TSG 能增高模型小鼠 Morris 水迷宫试验学习记忆能力,降低海马区神经元 APP 表达,减少脑颞叶皮层淀粉样斑块的数目和面积,减少皮层和海马 Aβ含量,抑制 PS-1 表达,抑制α-synuclein mRNA 和蛋白质表达,增高磷酸化 ERK1/2 表达。对 10 月龄已出现淀粉样斑块的 APP 转基因小鼠灌服 TSG 6 个月后,也可明显改善 16 月龄转基因小鼠的学习记忆能力[18, 45-48]。在体外试验中,TSG 能明显抑制 β-分泌酶活性。

b. 对 Aβ 脑室注射小鼠模型的影响。TSG 灌胃给药14 天,能提高 Aβ1~40 脑室注射模型小鼠学习记忆能力,改善海马区神经元线粒体和毛细血管超微结构的病理改变,降低大脑皮层和海马区炎性细胞因子 IL-1β和 IL-6含量,抑制环氧酶-2 表达,降低过氧化脂质含量和单胺氧化酶 B 活性,提高总抗氧化能力,增高 ChAT 活性[49-51]。在体外试验中,TSG 能够减轻Aβ1~40 诱导THP-1 单核细胞产生炎症反应后的上清液对 SK-NSH 神经细胞的损伤[52]。

c. 对基底前脑胆碱能神经元损毁大鼠模型的影响。应用鹅膏蕈氨酸基底前脑注射致胆碱能神经元损毁大鼠模型,发现 TSG 灌胃 1 个月能显著提高模型大鼠水迷宫试验和避暗试验学习记忆功能,增强大脑皮层和海马 ChAT 活力,提高 M- 胆碱能受体结合力[53-54]。

d. 对线粒体功能障碍拟 AD大鼠模型和细胞模型的影响。大鼠皮下微泵恒速灌注线粒体复合体Ⅳ抑制剂叠氮钠 28 天造模。TSG 灌胃给药能够提高叠氮钠模型大鼠脑内线粒体细胞色素 c 氧化酶活性,对线粒体具有直接保护作用;促进脑内 NGF、BDNF及其受体 TrkB 的表达;降低脑内胆碱酯酶活力;抑制海马区 β- 分泌酶、PS-1 的表达,减少 APP 和Aβ 在脑内的过度表达;抑制海马区 GSK-3β 表达,减低 Tau 蛋白过度磷酸化。表明 TSG 对线粒体具有保护作用,能在疾病早期环节对疾病进行干预。在体外试验中,应用叠氮钠与 SH-SY5Y 神经细胞孵育,导致模型细胞出现线粒体膜电位下降、细胞内 ATP 含量降低、活性氧增多、细胞凋亡增加等一系列变化。TSG 与模型细胞孵育,通过提高线粒体膜电位、增加胞内 ATP含量、抑制活性氧产生、降低促凋亡蛋白表达、提高抗凋亡蛋白表达,从而保护细胞免于凋亡。提示 TSG 具有直接的线粒体保护作用[55]。

e. 对自然衰老大鼠的影响。衰老大鼠灌胃给予TSG 3个月(21月龄至 24 月龄),明显提高学习记忆能力;增高海马突触素表达,保护突触超微结构,增高突触数量;减轻胆碱能神经元的丢失和死亡;增加 NGF 及其受体 TrkA 的表达;增强神经元信号转导通路中重要因子 IRS-1、PI3K、p70S6K和 p-CREB 的表达[33, 56-57]。

f. 对自然衰老小鼠脑内突触的影响。TSG 灌胃给药3个月(17月龄至20 月龄)能改善老年小鼠的学习记忆功能和运动功能;保护海马 CA1 区突触超微结构,增大纹状体突触后致密物质带,使海马、纹状体的突触连接区域个数增加,并使线粒体超微结构维持正常;增强海马、纹状体的 CaMKⅡ磷酸化活性,增强突触素和突触后致密物质 95(PSD-95)表达,提高突触蛋白Ⅰ(synapsin Ⅰ)磷酸化活性,从而有效提高突触可塑性;能够抑制海马、皮层及纹状体组织的α-突触核蛋白(α-synuclein)表达和聚集。

g. 对 D- 半乳糖致自由基增高脑老化小鼠模型的影响。TSG 灌胃 2 个月能够改善 D- 半乳糖模型小鼠学习记忆功能,减少大脑皮层和海马过氧化脂质含量,增强总抗氧化能力,增加谷胱甘肽含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,增加 NGF 及其受体 TrkA 表达;基因表达谱芯片结果显示,TSG能增强多种能量代谢酶的 mRNA 表达,减低炎性反应相关因子的 mRNA 表达[58-61]。

h. 对高胆固醇血症致 Aβ增高大鼠模型的影响。近年来的研究表明,胆固醇与Aβ相互作用,在AD 的发病机制中起着重要作用。本实验以高胆固醇饲料喂养大鼠 2 个月,建立高胆固醇血症模型,该模型也出现海马区 Aβ含量增高。TSG 灌胃2 个月,能够提高模型大鼠学习记忆功能,减少海马区 Aβ含量,降低血清胆固醇和低密度脂蛋白含量,降低红细胞聚集率和全血黏度[62-63]。

i. 对慢性脑缺血致痴呆模型大鼠的影响。TSG灌胃 10 周能改善双侧颈总动脉永久结扎致慢性脑缺血模型大鼠的学习记忆功能,减轻海马和大脑皮层神经元损伤和丢失,提高谷胱甘肽过氧化物酶活性,减少过氧化脂质含量,抑制 Aβ 表达和沉积,增强蛋白磷酸酶 PP2A 和微管相关蛋白 2(MAP-2)的表达[64-65]。

j. 对急性脑缺血动物模型的影响。对双侧颈总动脉夹闭致急性全脑缺血小鼠模型,TSG 灌胃给药能降低脑组织含水量,减少过氧化脂质含量,提高 SOD 活性,抑制神经细胞内钙离子超载[66]。对双侧颈总动脉夹闭致急性全脑缺血沙土鼠模型,TSG 能减低前脑组织 NMDA 受体结合力[67]。对三氯化铁致大脑中动脉阻断致急性脑缺血大鼠模型,TSG 能减小脑梗死范围,改善神经症状评分[68]。

k. 对神经细胞损伤模型的影响。对 Aβ、H2O2、谷氨酸、缺糖缺氧致神经细胞损伤 4 种细胞模型,TSG 能够提高细胞存活率,减低乳酸脱氢酶从细胞内漏出,抑制谷氨酸诱导的细胞内钙离子超载[69-72]。

l. 对 α-synuclein 基因转染细胞的影响。TSG与野生型α-synuclein 基因转染 PC12 细胞孵育,能够减少模型细胞α-synuclein mRNA表达,抑制α-synuclein 蛋白表达和聚集,增高泛素 - 蛋白酶体系统的 Parkin、UCH-L1 蛋白表达。提示 TSG 可能通过减少生成和增强降解两个机制抑制α-synuclein过表达和聚集[73]。

m. 对 MPP+致神经细胞损伤模型、MPP+ 损伤复合α-synuclein 基因转染细胞模型的影响。1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)是线粒体复合体Ⅰ抑制剂 MPTP 在体内的活性形式,可制备帕金森病细胞模型。本试验中,MPP+分别与空载体转染SH-SY5Y 细胞(正常细胞)和突变型 A53Tα-synuclein基因转染 SH-SY5Y 细胞孵育,均导致线粒体损伤,线粒体膜电位下降,活性氧自由基增高,Bax/Bcl-2 表达比值升高,caspase-3 激活,启动线粒体凋亡程序,最终导致细胞凋亡。过表达突变型 A53T α-synuclein基因使SH-SY5Y 细胞对MPP+造成的损伤更敏感。TSG 能明显增高上述 2种模型细胞的存活率,保护线粒体功能,增高线粒体膜电位,减低活性氧自由基水平,降低Bax/Bcl-2 表达比值,抑制 caspase-3 激活,抵抗MPP+ 诱导的细胞凋亡[74]。

同时,在复合模型中,MPP+ 促进 α-synuclein及 其 相 关 作 用 蛋 白 synphilin-1表达增多,α-synuclein 形成大量寡聚体,对神经细胞进一步造成损伤。TSG 对复合模型细胞的α-synuclein 过表达和聚集有明显的抑制作用,可减低 synphilin-1 表达,并提高 PSD-95 的表达,从而保护突触功能。

n. 应用前景。TSG 能够改善多种拟 AD 动物模型的学习记忆功能,在AD复杂发病机制的多个途径具有良好的药效学作用,尤其具有神经保护、神经营养作用,可能阻止或延缓神经元的变性和死亡。目前正在进行治疗轻中度 AD 的 2 期临床试验。由于 TSG 对慢性脑缺血致痴呆大鼠模型、急性脑缺血动物模型也有明显疗效,因此还可能用于治疗血管性痴呆。此外,TSG 在体外试验和体内试验中均具有抑制 α-synuclein 过表达和聚集的作用,而且在衰老小鼠中证明 TSG 能够改善学习记忆功能和运动功能,可作用在海马、皮层和纹状体多个脑区,因此,除了治疗 AD 以外,TSG 还具有治疗帕金森病痴呆、路易体痴呆的前景。

2.2 淫羊藿黄酮、淫羊藿苷

我们在参乌胶囊药效作用的物质基础研究中发现,淫羊藿黄酮在体外试验中能明显抑制 β- 分泌酶活性,减少 APP 基因转染细胞 Aβ生成和分泌,因此继续研究了淫羊藿黄酮(Epimedium flavanoids,EF)、淫羊藿苷(Icarrin,ICA)在体内试验中对动物模型的影响。ICA 为 EF 的主要有效成分。

a. 对 APP 转基因小鼠模型的影响。4月龄APPV717I 转基因小鼠,分别灌胃给予EF和ICA至10月龄,发现 EF和ICA 能增高模型小鼠学习记忆能力,减低海马和大脑皮层Aβ含量和淀粉样斑块数量,抑制APP、β-分泌酶和 α-synuclein 表达,增高泛素 - 蛋白酶体系统的 Parkin 和 UCH-L1表达,增高热休克蛋白 70(HSP 70)含量,改善海马和皮层突触超微结构的损伤,增高突触素(SYP)和PSD-95 表达[75-76]。在体外试验中,EF对β-分泌酶活性有明显抑制作用[77]。EF与 APP695 基因转染 SH-SY5Y 神经细胞孵育后,能够减少模型细胞 Aβ生成和分泌[77]。

b. 对 Aβ脑室注射小鼠模型的影响。EF 灌胃给药14天能够提高侧脑室注射 Aβ1~40 模型小鼠的学习记忆能力,抑制海马小胶质细胞和星形胶质细胞活化,减少炎性细胞因子IL-1β和 TNF-α含量,抑制环加氧酶-2表达,抑制 Bax 蛋白表达,增高大脑皮层 GSH 含量和 SOD 活性[78-79]。

c. 对线粒体功能障碍拟 AD 大鼠模型的影响。大鼠皮下微泵恒速灌注线粒体复合体Ⅳ抑制剂叠氮钠 28 天造模。ICA 灌胃给药能够提高叠氮钠模型大鼠脑内线粒体细胞色素c氧化酶活性,对线粒体具有直接保护作用,促进脑内神经营养因子 NGF、BDNF及其受体 TrkB 的表达,降低海马区β-分泌酶、PS-1 的表达,减少APP和Aβ在脑内的过度表达,抑制海马区 Tau 蛋白过度磷酸化。表明 ICA对线粒体具有保护作用,能在疾病早期环节对疾病进行干预。

d. 对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型的影响。使用豚鼠脊髓和大脑灰质匀浆液,与完全弗氏佐剂乳化后于尾根部皮下免疫雌性 Lewis 大鼠制作 EAE 模型。EF 灌胃给药 3 周能够延迟模型大鼠神经功能损伤的发病进程,缓解其发病症状,减轻脊髓腰膨大和脑实质炎性侵润和髓鞘脱失的病理变化,保护神经元、少突胶质细胞的正常结构,抑制星形胶质细胞的活化,减少脑和脊髓中炎性因子 TNF-α 和 IL-1β 含量,降低 NOS 活性,减少NO 含量,增高 SOD 活性,减少过氧化脂质含量;增加神经生长因子含量[80-81]。

e. 对原代培养神经干细胞的影响。从新生 1 天大鼠海马中分离神经干细胞进行培养,在无生长因子 EGF 和 bFGF 的条件下,EF 和 ICA 能促进神经干细胞增殖;在无胎牛血清的条件下,EF 和 ICA能促进神经干细胞向神经元分化[82]。

f. 对 α-synuclein 基因转染细胞的影响。ICA与野生型α-synuclein 基因转染 PC12 细胞孵育,能够减少模型细胞α-synuclein mRNA表达,抑制α-synuclein 蛋白表达和聚集,增高泛素-蛋白酶体系统的 Parkin、UCH-L1 蛋白表达。提示 ICA 可能通过减少生成和增强降解两个机制抑制α-synuclein过表达和聚集[83]。

g. 应用前景。EF 和 ICA 能够抑制 β- 分泌酶活性,减少 Aβ 含量,抗炎、抗氧化应激,同时能够促进神经干细胞增殖和向神经元分化,这些特点使得 EF和ICA 可能具有治疗AD的应用前景。此外,EF和ICA 对EAE大鼠模型有较好的疗效,可能用于治疗脱髓鞘疾病(如多发性硬化),该药特点为具有抗炎、促神经营养 / 再生的双重作用,使之可能促进髓鞘再生和修复。

3 中药筛选研究

除了对中药复方及其物质基础进行研究以外,从 1998 年开始,我们研究的另一条思路是应用细胞模型对多种单味中药进行筛选,以期发现最为有效的中药及其成分。首先根据 AD 的发病机制特点,从 Tau 蛋白磷酸化的角度应用了蛋白磷酸酶PP2A 抑制剂冈田酸(Okadaic acid,OA)致细胞损伤模型[84],从 Aβ25~35 引起氧化应激的角度应用了过氧化氢(H2O2)致细胞损伤模型,从早期干预的角度建立了线粒体呼吸链复合体Ⅳ抑制剂叠氮钠(NaN3)致细胞损伤模型[85-88]。

应用这 3 种细胞模型对我们从文献检索和古方查阅中选出的中医治疗老年期痴呆或脑萎缩最常用的6类 33 味中药进行筛选。结果显示,在这 33 味中药中,只有山茱萸对3种细胞模型均有良好的拮抗作用,并可促进正常神经细胞轴突伸长和提高线粒体活性[89-90]。进一步体内研究发现,山茱萸灌胃给药对 D- 半乳糖致痴呆小鼠模型、光化学诱导的脑梗塞大鼠模型有改善作用,表明体内给药有效。从治疗 AD 需要多靶点药物的主导思想出发,同时山茱萸为补肾中药,从中医“肾生髓,脑为髓海”和“补肾填髓”的理论出发,我们选择对山茱萸继续进行研究。

从药效学导向进行植物化学的思路出发,并且为了提高效率,我们应用了高速逆流层析的新方法,将分离出的各峰收集起来,应用上述 3 种细胞模型(OA、H2O2、NaN3 致细胞损伤模型)进行筛选。通过两轮分离和筛选,选出了对 3 种细胞模型均有效的成分:5- 羟甲基糠醛和环烯醚萜苷。我们对其继续进行了药理学研究。

3.1 5-羟甲基糠醛

3.1.1 体外试验。

a. 5-羟甲基糠醛 (5-hydroxymethyl-2-furfural,5-HMF)与神经细胞孵育,能够拮抗 PP2A 抑制剂OA 诱导的微管和微丝损伤,保护细胞骨架结构[91].

b. 5-HNF 能够拮抗线粒体复合体Ⅳ抑制剂叠氮钠引起的神经细胞线粒体膜电位降低、Aβ量增高、微管和微丝损伤[92]。

c. 对于转AD患者线粒体DNA融合细胞,5-HMF 能够增高线粒体膜电位,减少活性氧的产生,抑制细胞内钙离子超载,并拮抗由叠氮钠、H2O2 诱导的转 AD 患者线粒体融合细胞存活率降低[93-94]。

3.1.2 体内试验。

a. 皮下注射 5-HMF 6 周能够改善线粒体复合体Ⅱ/Ⅲ抑制剂 3- 硝基丙酸(3-NPA)大鼠模型的学习记忆能力[95]。

b. 对双侧颈总动脉反复夹闭再通致脑缺血再灌小鼠模型,5-HMF 灌胃给药 14 天能够改善模型小鼠的学习记忆能力,降低脑组织过氧化脂类含量,增高 SOD 活性,提高 GSH 含量和 GSH 过氧化物酶活性,抑制脑片海马区神经细胞胞浆内钙离子超载[96]。

c. 对双侧颈总动脉结扎致急性脑缺血小鼠模型,缺血前30min或缺血后5min腹腔注射5-HMF 均能延长小鼠的存活时间,双侧颈总动脉夹闭后 25 min(再灌前 5 min)给药能降低脑内过氧化脂质含量,增高 SOD 活性[97]。

3.2 山茱萸环烯醚萜苷

我们按照国家新药研制的要求,进行了山茱萸环烯醚萜苷(cornel iridoid glycoside,CIG)临床前药学、药理学和毒理学研究。药理学研究发现,CIG对多种细胞模型和动物模型具有良好的药效作用。

3.2.1 体外试验。

a. 对蛋白磷酸酶 PP2A 抑制剂 OA 细胞模型,CIG 能够抑制模型细胞的 Tau 蛋白过度磷酸化和神经丝过度磷酸化,保护细胞骨架结构,增高 Bcl-2表达,抑制 Bax 和 caspase-3 表达,减低细胞凋亡率[98-99]。

b. CIG 能够减轻Aβ1~40 诱导THP-1单核细胞产生炎症反应后的上清液对 SK-N-SH 神经细胞的损伤。

c. 对缺糖/缺氧细胞模型,CIG 可保护细胞膜的完整性,降低细胞内钙离子浓度,减少凋亡细胞数量。

d. 对原代培养神经干细胞的影响。从新生 1天大鼠海马中分离神经干细胞进行培养,在无生长因子 EGF 和 bFGF 的条件下,CIG 有促进神经干细胞存活和增殖的作用。在无胎牛血清的条件下,CIG 有促进神经干细胞向神经元分化的作用。

3.2.2 体内试验。

a. 对穹隆-海马伞切断拟AD大鼠模型的影响。穹隆-海马伞切断损伤基底前脑内侧隔核和斜角带核胆碱能神经纤维至海马和大脑皮质的投射,导致海马和基底前脑胆碱能神经元大量丢失,模拟AD 的病理变化。本试验中,CIG 灌胃给药 28 天能够明显改善穹隆-海马伞切断模型大鼠的学习记忆能力,增加大脑皮层、海马区存活神经元数量和突触素表达,增强神经营养因子 NGF 及其受体TrkA、BDNF 及其受体 TrkB 的表达,增高神经生长相关蛋白 GAP-43 含量,减少轴突生长抑制因子Nogo A 和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)含量,增强Bcl-2 表达,抑制 Bax 和细胞色素 c 表达[100-102]。表明 CIG 具有促进神经营养、改善神经再生微环境的作用。

在最近的试验中,将培养的神经干细胞移植入穹隆-海马伞切断模型大鼠基底前脑,CIG 灌胃给药能够促进外源性神经干细胞的存活、向神经元和星形胶质细胞分化,并使基底前脑的胆碱能神经元增多。

b. 对全脑缺血沙土鼠模型的影响。夹闭双侧颈总动脉造成全脑缺血沙土鼠模型。术后 7 天检测,CIG 灌胃给药能增加海马区 Bcl-2 表达,降低 Bax和 caspase-3 表达,减少神经元凋亡。术后 28 天检测,CIG 能改善模型鼠学习记忆功能,增多海马区神经元数量,增强神经营养因子 BDNF、bFGF、VEGF、信号转导效应分子 PI3K 和 Akt 表达[103-104].

c. 对脑缺血大鼠脑内神经发生和血管新生的影响. 用线栓法制作大脑中动脉阻塞致脑缺血大鼠模型,术后 3 h 开始灌胃给予 CIG,分别于术后 7、14、28 天进行各项检测。结果发现:CIG能够改善模型大鼠的神经损伤症状;与模型大鼠相比,CIG 能够增加脑室下层(SVZ)内源性增殖细胞数量,增高大脑皮层和纹状体神经前体细胞数量;促进神经前体细胞向神经元分化,减少向星形胶质细胞分化;增加梗死灶周围新生血管数量;增强大脑皮层血管内皮生长因子(VEGF)及其受体 Flt-1 的 mRNA和蛋白质表达, 增高 BDNF 及其受体 TrkB 表达[105-107].

d. 对脑梗死大鼠模型的影响。采用线栓法致大脑中动脉阻塞(MCAO)制作局灶性脑缺血大鼠模型。CIG 灌胃给药7天后造模,缺血2h,再灌24h。结果显示:CIG 能够减轻模型大鼠的神经损伤症状,减少脑梗死体积,增加梗死区神经细胞存活数量,抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化,减少大脑皮层炎性因子 IL-1β 和 TNF-α 含量;减少梗死区神经细胞凋亡数量,增强 Bcl-2 表达,抑制Bax、caspase-3 和细胞色素 c 表达[108-109]。在最近的试验中,大鼠 MCAO 缺血 90 min 后再灌注,在缺血 6 h 后灌胃给予 CIG,应用磁共振技术动态观察脑缺血后 2 天、7 天、14 天、28 天梗死灶的变化。影像学结果显示,CIG 能够显著减小模型大鼠的脑梗死灶体积。术后 28 天行 TTC 染色也见 CIG给药组大鼠的脑梗死体积比模型组明显缩小,与影像学一致。术后 28 天统计,CIG 组大鼠的死亡率(37.5%)明显低于模型组(65.0%)。

e. 对创伤性脑损伤模型大鼠的影响。用自由落体打击(Feeney 法)造成大鼠创伤性脑损伤模型,造模后开始行为学检测,分别于伤后 24 h 和72h 取脑。结果显示 CIG 能够改善模型大鼠的行为学评分,减少大脑皮层损伤区周围神经细胞死亡,降低TNF-α 和 IL-1β 表达,增高 BCl-2/Bax 比值,减低caspase-3 含量,减少脑内和血清 s100β含量[110]。

f. 对脊髓损伤大鼠模型的影响。在最近的试验中,大鼠行完全性压迫性脊髓损伤术造模,CIG 灌胃给药 1 个月能够改善模型大鼠的运动行为能力,维持受损脊髓节段灰白质相对比例,保护受损脊髓解剖结构完整性及残余神经元数量,保证更多有生理功能的神经纤维通过脊髓受损节段,促进神经纤维新生并保护新生纤维的生长,能够干预Nogo-A 启动的髓鞘再生抑制过程,抑制 p75NTR和 ROCK Ⅱ的表达,为轴突及神经纤维再生提供更适合的微环境。

g. 应用前景。CIG 能够抑制 Tau 蛋白过度磷酸化,促进神经干细胞增殖和向神经元分化,对多种细胞模型和动物模型均有明显疗效,表明 CIG可作用于多种疾病的复杂发病机制的多靶点、多途径,尤其是具有神经保护和神经营养/再生的双重作用,提示 CIG 可能用于治疗 AD、缺血性脑损伤、创伤性脑损伤和脊髓损伤等多种疾病,具有良好的应用前景。

4  中医药理论的现代生物学基础

中医学认为“肾生髓,脑为髓海”,“肾”与脑功能存在密切的联系。肾虚证是导致“髓海不足”的重要原因,通过“补肾填髓”可以防治衰老引起的记忆力下降,起到“益脑髓”作用。在该理论指导下,中医临床应用补肾中药防治痴呆和提高记忆力已有数千年的历史。然而,这一理论的现代生物学基础尚未有系统的论述,“补肾”与“益脑髓”之间的现代生物学关系尚不清楚。

基于我们近十多年来应用中药防治 AD 的研究结果,从实验研究角度证实补肾中药(何首乌、山茱萸、淫羊藿)在治疗 AD 中处于非常重要的地位,这与中医治疗 AD 的主要治则“补肾填髓”不谋而合。

经过总结和凝练,我们于 2006 年提出新的观点:中医所指的“脑髓”,其现代生物学基础是脑内神经元和神经营养因子等活性物质;脑内神经营养因子减少、神经元大量萎缩和丢失而造成 “髓海不足”,可引起认知功能下降,进而可发生痴呆;中药 “补肾填髓”与脑相关的现代生物学基础包括促进神经元能量代谢和利用,激活内源性神经营养因子等活性物质生成增多,同时抑制神经毒素的生成,从而减少神经元死亡,促进神经元存活与再生。这可以说是“治本”。中药参乌胶囊、何首乌二苯乙烯苷、山茱萸环烯醚萜苷、淫羊藿苷等可以起到这种作用,体现出明显的特点和优势[111]。

在补肾中药具有神经保护和神经营养 / 再生作用新认识的指导下,我们将补肾中药(山茱萸环烯醚萜苷、淫羊藿苷)的研究从治疗 AD 延伸到治疗缺血性脑损伤、创伤性脑损伤、脊髓损伤和脱髓鞘病,在实验研究中取得了可喜的进展。

5 小 结

阿尔茨海默病(AD)是一种多因素相关的复杂性疾病。近年来,研发的一些 AD 治疗药物在临床试验中不成功,重要原因是药物仅针对单靶点或单致病途径,因此目前国际上许多学者提出,应当转换思路,应用多靶点、多途径的治疗策略来研发治疗 AD 的药物。在这方面我国的中药具有优势。我们的研究表明,中药复方和单味中药提取物都可作用在 AD 复杂发病机制的多靶点和多途径,尤其是部分补肾中药(如何首乌二苯乙烯苷、山茱萸环烯醚萜苷、淫羊藿苷)具有神经保护和神经营养/再生作用,对于治疗 AD 具有明显的特点和优势。

目前临床上 AD 治疗效果不佳,重要原因之一是干预时机太晚,在诊断出痴呆时已有大量神经元死亡。因此目前国际上一些学者提出,应当把干预提前到痴呆发生之前,即 MCI 阶段。近年的研究认为,线粒体功能障碍和突触丢失发生在神经元死亡之前,突触丢失与认知功能障碍密切相关,因此将线粒体和突触作为早期治疗靶点,可望阻止或延缓痴呆的发生。我们的研究表明,中药参乌胶囊、何首乌二苯乙烯苷、淫羊藿苷、山茱萸环烯醚萜苷对线粒体和突触具有明显的保护作用,可望用于AD 的早期干预或 MCI 的治疗。

参考文献(略)



https://blog.sciencenet.cn/blog-279293-1314404.html

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