诺贝尔奖获奖技术的关键改进

诸平

A series of cryo-EM images. The greyscale photos represent 2D projections of multiple views of the imaging scaffold attached to a target protein; the color image illustrates the 3D reconstruction derived from 2D projections. Roger Castells-Graells/UCLA

据美国加州大学洛杉矶分校（University of California Los Angeles简称UCLA）2023年9月26日提供的消息，来自美国、英国以及加拿大的科学家组成的研究团队，对曾经获得诺贝尔奖的技术进行了关键性的改进（Key improvement to Nobel Prize-winning technology）。

获得 2017 年诺贝尔化学奖（2017 Nobel Prize in chemistry）的科学家们，因开发了一种称为冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 的技术而获奖。这项技术是革命性的，因为它使科学家能够以高分辨率看到生物分子的原子结构。但冷冻电镜仍然有一个问题：它只对大分子成像有效。上述图片是一系列冷冻电镜图像（cryo-EM images）。灰度照片代表附着于目标蛋白的成像支架的多个视图的二维投影；彩色图像说明了从2D投影导出的3D重建。冷冻电镜的进步可能会为潜在癌症疗法的研究带来重大福音。

要点（Key takeaways）

l         一种称为冷冻电子显微镜（cryo-electron microscopy简称cryo-EM）的技术使科学家能够以高分辨率观察生物分子的原子结构。但迄今为止，它对于所谓的小分子成像尚无效。

l         美国加州大学洛杉矶分校领导的生物化学家团队，设计了一种解决方案，可以在成像时将小蛋白质分子固定在适当的位置，这将使冷冻电镜能够生成此类分子的更清晰的图像。

l         这一进展意义重大，因为中小型蛋白质分子是治疗癌症和其他疾病的潜在新药研究的重点领域。

现在，加州大学洛杉矶分校的生物化学家与制药行业科学家合作开发了一种解决方案，使冷冻电镜也能够获取较小蛋白质分子的高质量图像。科学家们设计了一种20 nm的立方体蛋白质结构，称为支架(scaffold)，具有刚性的三脚架状突起，可将小蛋白质固定到位。

在处理成像时，可以通过数字方式从图片中移除支架，只留下科学家正在分析的小蛋白质的复合3D图像。

中小型蛋白质是潜在新药研究的热点，这些新药有一天可能会被用来对抗一些最棘手的人类疾病。这一进展已经在一种蛋白质上进行了测试，科学家们正在研究这种蛋白质在癌症治疗中的可能用途，并且可以针对几乎任何小蛋白质进行定制。研究人员预计，扩大冷冻电镜的成像能力将帮助他们识别蛋白质上的特定位置，以达到治疗目的。

关于这项新研究的论文,2023年9月5日已经在《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences)网站发表——Roger Castells-Graells, Kyle Meador, Mark A. Arbing, Roger Castells-Graells, Kyle Meador, Mark A. Arbing, Michael R. Sawaya, Morgan Gee, Duilio Cascio, Emma Gleave, Judit é. Debreczeni, Jason Breed, Karoline Leopold, Ankoor Patel, Dushyant Jahagirdar , Bronwyn Lyons, Sriram Subramaniam, Chris Phillips, Todd O. Yeates. Cryo-EM structure determination of small therapeutic protein targets at 3 Å-resolution using a rigid imaging scaffold. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2023, 120(37): e2305494120. DOI: 10.1073/pnas.2305494120. September 5, 2023. https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2305494120

参与此项研究的除了来自UCLA的研究人员之外，还有来自英国阿斯利康（AstraZeneca, Cambridge CB2 0AA, United Kingdom）、加拿大英属哥伦比亚大学（The University of British Columbia, Vancouver, BC V6T 1Z3, Canada）以及加拿大Gandeeva治疗公司（Gandeeva Therapeutics, Inc., Burnaby, British Columbia V5C 6N5, Canada）的研究人员。

在冷冻电镜中，科学家使用冷冻电子显微镜将电子束发送穿过冷冻的材料样本，留下样本中数千个分子（例如蛋白质）的图像。分子的成像与样品中的分子完全相同，从而生成数千张从不同角度拍摄的分子二维照片。计算机处理协调所有这些照片以形成正确的3D图像-分离背景，将具有相似方向的图像分组在一起，并生成单个分子的高分辨率3D图像。

但在对最小的蛋白质分子进行成像时，它们的微小尺寸使得无法确定它们在之前的研究中的方向。在之前的研究中，科学家试图通过将小分子附着到较大的支架上来解决这个问题，但这些实验表明，如果小分子如果附着得太灵活，它们会以不同的角度和方向从支架上突出——这仍然会产生模糊的效果。在这项新研究中，科学家们创建的支架具有三脚架状的突起，可以捕获蛋白质并将它们牢固地固定在适当的位置，这产生了他们想要的更高分辨率的图像。

上述研究成果的通讯作者托德·耶茨（Todd O. Yeates）说：“将小分子牢固地附着在较大的支架上，会产生足够大的颗粒以进行成像，并且它们都具有完全相同的3D形状。从那里开始，该过程将像往常一样构建高分辨率的3D图像。”

加州大学洛杉矶分校博士后研究者、该研究的主要作者罗杰·卡斯特尔-格雷尔斯 (Roger Castells-Graells) 表示，科学家们首先尝试了另一种形状的支架，然后才选择了带有三脚架形状突起的支架。罗杰·卡斯特尔-格雷尔斯说：“一开始我们用一根指向外面的‘棍子’，但效果不太好。新的支架具有三联体（triplets）中彼此指向的突起，就像三脚架一样，可以牢固地固定蛋白质。”

研究人员通过尝试创建一种名为KRAS的蛋白质图像来测试他们的支架。KRAS促进细胞增殖，与约25%的人类癌症有关；它引起了药物研究人员的特别兴趣，因为确定蛋白质上与其致癌能力相关的特定位置可以帮助科学家设计出中和这些位置活性的药物，这可能是治疗癌症的一种途径。

使用冷冻电镜和他们开发的支架，加州大学洛杉矶分校领导的研究团队能够观察附着在药物分子上的KRAS原子结构，该药物分子正在研究作为肺癌潜在治疗的一部分。他们的工作证明，新的支架式冷冻电镜方法可以阐明药物分子如何与KRAS等细胞蛋白结合并抑制，这有助于指导更有效药物的开发。

罗杰·卡斯特尔-格雷尔斯表示，这项新进展的潜在应用并不仅限于抗癌药物。他说：“我们的支架是模块化的，可以以任何配置组装，以捕获和容纳各种小蛋白质分子。”

加州大学洛杉矶分校已为这项新技术申请了专利，托德·耶茨、罗杰·卡斯特尔-格雷尔斯及其同事成立了一家新公司——AvimerBio，与领先的制药公司合作，帮助使用新方法开发新的商业应用。

本研究得到了美国国立卫生研究院基金（NIH grant R01GM129854）和美国能源部（DOE grant DE-FC02-02ER63421）的资助。

上述介绍，仅供参考。欲了解更多信息，敬请注意浏览原文或者相关报道。

Significance

Cryoelectron microscopy (cryo-EM) is emerging as a major method for elucidating the structures of proteins in atomic detail. A key limitation, however, is that cryo-EM is applicable only to sufficiently large macromolecular complexes. This places a great many important proteins of smaller size, especially those of interest for therapeutic drug development, outside the reach of cryo-EM. We describe a protein engineering effort that overcomes the lower mass limit through the development of a modular imaging scaffold able to rigidly bind and display practically any small protein of interest, greatly increasing its effective mass. We show this technology can be used to visualize molecules, such as a key cancer protein, with important implications for drug design and biomedical research.

Abstract

Cryoelectron microscopy (Cryo-EM) has enabled structural determination of proteins larger than about 50 kDa, including many intractable by any other method, but it has largely failed for smaller proteins. Here, we obtain structures of small proteins by binding them to a rigid molecular scaffold based on a designed protein cage, revealing atomic details at resolutions reaching 2.9 Å. We apply this system to the key cancer signaling protein KRAS (19 kDa in size), obtaining four structures of oncogenic mutational variants by cryo-EM. Importantly, a structure for the key G12C mutant bound to an inhibitor drug (AMG510) reveals significant conformational differences compared to prior data in the crystalline state. The findings highlight the promise of cryo-EM scaffolds for advancing the design of drug molecules against small therapeutic protein targets in cancer and other human diseases.