近期，由上海市农科院生物所农业生物安全评价研究卓越团队和瑞金医院血管外科合作研发的首例基因编辑猪——“马凡猪”顺利从湖北猪场运抵上海，有望推动相关医疗器械、药物和手术技术的研发，使我国近百万马凡氏综合征及其他主动脉疾病患者受益。

4种基因编辑方案用于建构马凡猪模型

马凡氏综合征（Marfan syndrome，简称MFS）是一种常染色体显性遗传疾病，由半个世纪前发现的主要致病基因发生突变引起，因累及骨骼可使手指细长呈蜘蛛指（趾）样，故又被称为“蜘蛛指（趾）综合征”（Arachnodactyly Syndrome）。1896年，法国儿科医师安东宁·马凡首次描述了该病以骨骼、眼及心血管三大系统的缺陷为代表的主要特征，疾病也由此得名。历史上，俄罗斯钢琴演奏家谢尔盖·拉赫玛尼诺夫、意大利小提琴手尼科罗·帕格尼尼、美国女子排球运动员海曼等一些在音乐和体育领域取得非凡成就的名人罹患此病，则使该病又有了“天才病”的别称。除了涉及心血管系统、骨骼系统和眼部等结缔组织临床表型的异常，MFS也涉及基因突变及其编码的蛋白功能异常。目前已发现的MFS致病性基因突变有700多种，患病率为1/5000-1/10000。患者通常表现为无症状升主动脉瘤、主动脉夹层、眼晶状体脱位和以长骨过度生长为特征的骨骼异常。其中，对患者生命构成最大威胁的是无症状升主动脉瘤，以及未经治疗的升主动脉瘤可能进展为危及生命的急性主动脉夹层，急性期死亡率达到20%-60%。据保守估计，我国目前约有100万马凡氏综合征患者。如果算上其他一些基因突变引起的主动脉疾病，则有望受益的患病人群更大。

通过瑞金医院提供的临床病例，上海市农科院科研团队预测了猪的同源基因发生主动脉病变的区域，有针对性地设计了4种基因编辑方案，使猪的基因发生不同严重程度的致病突变。合作团队将通过评估每头基因编辑猪的主动脉病变情况，筛选编辑位点准确的最佳马凡猪模型，用于推进疾病研究。

模型将用于相关医疗器械开发、药物研制和验证

心血管疾病是全球主要致死病因之一。升主动脉瘤作为一种在没发病的时候没有症状，一旦发病就会产生夹层或者破裂进而导致猝死的高危疾病，对其病理机制和治疗方法的研究高度依赖动物模型。猪的心血管系统与人类高度相似，因此常被选作疾病模型，尤其是用于主动脉瘤研究。目前，全球心血管器械研发投入不断增加，如主动脉支架、人工瓣膜等很多新型腔内医疗器械需要在临床应用前进行安全性和有效性验证，缺乏主动脉病变的大动物模型成为研发和应用的瓶颈。此外，经导管主动脉瓣置换术等微创手术技术也需通过动物模型进一步验证安全性和有效性。“马凡猪”模型的建立，可以用于主动脉病变的手术培训、药物研发、主动脉介入医疗器械的验证等。

“引发猪的主动脉瘤和主动脉夹层的原因不只是马凡氏综合征，我们想做的事是用马凡氏综合征的主效基因在猪身上构造一个主动脉瘤，或者说主动脉扩张的通用模型，由此进行相关医疗器械开发、药物研制和验证。”上海市农科院生物所研究员吴潇告诉记者，基于基因编辑技术目前已经成熟，这项工作的关键难点是选择编辑位点。主效基因很庞大，有65个外显子，所以不可能把整个基因都编辑了，那样的话，猪可能根本就存活不了。科研人员需要选择编辑这个主效基因的某些区域、确定去掉哪些部分后猪不会死且还能出现理想的症状。当时上海市农科院团队考虑了很多因素，通过用软件分析猪的基因组序列、蛋白组序列，根据蛋白里决定蛋白功能的结构域分析蛋白的结构，使蛋白既能保留一部分功能继续存在，又在某些结构上发生变化，失去某些功能。此外，他们也比较了人的基因组和猪的基因组，最终确定了实验方案，确保猪能够作为实验动物活到其主动脉发生病变的时刻。这个马凡氏综合征模型猪在国内是首例。目前看来，无症状升主动脉瘤在马凡猪身上已经产生，主动脉夹层还没有发现。

“因为猪自然交配的成本比克隆猪低很多，而产生的幼猪的成活率比克隆猪高很多，我希望能够培育一个猪的家系，有固定的母本和固定的父本，它们能够通过自然交配生产出符合要求的模型猪。这样，成本是比较低的。另外，如何建家系本身也是一个研究课题。”吴潇说。

从基因编辑小鼠到基因编辑猪：动物模型的进阶之路

上海交通大学医学院附属瑞金医院普外科-血管外科主任冯家烜教授是上海市农科院团队开展这项研究的合作伙伴。此前，冯家烜教授曾与中国科学院研究人员合作在发生了基因突变的小鼠身上进行基因编辑，探索马凡氏综合征的病理建模。当时那些小鼠主要被用于研究骨骼和晶状体方面的基因突变问题，还没有关于其主动脉表型的分析。冯家烜与合作伙伴观察小鼠后发现，当它们长到约10个月大的时候，会自发出现许多主动脉表型，甚至发生主动脉破裂导致的死亡。但这一方面需要经过较长的时间；另一方面，表型率比较低，仅百分之三四十左右。研究人员经过探索，得到了诱导马凡氏综合征小鼠主动脉瘤表型所需的关键因素——血管紧张素的最佳添加剂量，也探索了给药方式，发现局部给药和从静脉给药，对小鼠主动脉的感染效率完全不一样。从静脉给药，99%以上的药物都回流到了肝脏，能够感染主动脉的很少；而局部给药的干预强度对于药物剂量的需求就非常小，药物对全身的干预相应也小。此外，冯家烜还与合作伙伴尝试了一种名为“CRISPR Activation”（CRISPR A）的基因修复方法，主要通过激活等位基因的正常链，由正常链的表达代偿异常链表达的不足，从中发现这种基因修复方法能够降低小鼠主动脉瘤的发生和死亡率。

但由于小鼠与人在体型上的巨大差异，在小鼠身上得到验证的基因编辑效应虽然很容易发表论文，要实现临床转化却不太可能。原因之一是基因编辑小鼠的心率、血压、血流动力学都与人这个大动物不一样，在小鼠身上能够发挥的基因修复效应，在人的血流动力学环境下是否能实现同等发挥，还是个问号；其次，基因编辑药物能够在人身上发挥作用的干预剂量需要在接近人体血流动力学的环境中进行试验，体型与人相差悬殊的小鼠显然不能胜任这个使命，而这次冯家烜与上海市农科院研究团队的合作实验选用的体重80斤左右的猪的无疑要理想得多。

首批基因编辑猪已达到理想建模要求

据冯家烜教授介绍，没有疾病模型时，医生们做实验和熟悉操作流程都在正常的猪身上进行。这比之使用马凡猪进行操作，就如同在岩石里面打桩和在稀松的泥巴地里打桩的区别——会在岩石里面打桩的人不一定会在泥巴地里打桩。如果拿正常的猪做实验，就好比是在岩石内部打桩，无论是缝的针还是放的支架，感觉好像都很牢固，但真到发生病变的动物或人的身体里开刀或放支架，定位的位置，包括支架尺寸的选择，可能都是完全不一样的。

“因此，无论是在研发器具还是在推广器具、对医务人员进行培训的过程中，带有突变主效基因的马凡猪模型对于医生模拟在临床操作中的手感、整个操作流程和可能遇到的各种真实情况，都非常有帮助。如果我们要为一位由马凡氏综合征引起主动脉瓣反流的患者研发一个能够治疗他（她）的带瓣支架，我们就需要有马凡猪这样的动物模型。”冯家烜向记者表示。据他所知，现在每年新发的主动脉夹层患者能够接触到手术的大约在30万例左右，相关报道显示，这30万例中有60%属于由遗传因素引起的主动脉夹层。

记者从上海市农科院获悉，基于首批基因编辑猪所表现的症状已经达到理想的建模要求，市农科院研究团队后续还计划克隆3批基因编辑猪。