代谢学人

Nature Metabolism: 烟花易冷，脂肪“忆”热

撰文 | 程诗淼 高铭远 生茂正 郭盈盈 于剑 

编辑 | 孟美瑶

校对 | 于剑

背景介绍

哺乳动物是一类恒温动物，该类动物能够通过调节自身体温，在外界环境温度变化的情况下保持自身体温相对稳定，以满足机体高效率新陈代谢。机体的脂肪组织主要通过依赖于UCP1的质子泄漏、肌酸无效循环、钙依赖的三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)水解和脂质循环来进行产热。棕色脂肪(Brown adipose tissue,BAT）是哺乳动物重要的产热组织，BAT中含有高密度的线粒体，能特异性表达UCP1，以提高非颤抖性产热能力，进而维持体温恒定。当机体受到寒冷刺激时，交感神经释放大量去甲肾上腺素，通过β3-肾上腺素受体激活下游肾上腺素能信号通路，上调产热基因表达并促进机体产热。此外，成年人具有功能性BAT，并且该组织在肥胖人群中的活性降低。

目前的研究发现急性或慢性寒冷暴露会刺激BAT产热，然而在自然环境中，哺乳动物经常处在反复的间歇性寒冷暴露环境中，在重复冷暴露的条件下进行研究能够更加真实的反映在生物进化过程中BAT的产热机制。已有研究发现寒冷刺激或β3-肾上腺素能处理会引发初次产热反应，促进白色脂肪细胞转化为米色脂肪细胞。而在温度重新上升后，米色脂肪细胞经历染色质重塑向白色状态转化，同时米色脂肪细胞保留表观遗传记忆，当其再次暴露在寒冷中时，会重新激活产热程序，该程序也被称之为二次产热反应。然而尚不清楚BAT在多次短暂寒冷刺激后的反应机制，为了解释这一问题，宾夕法尼亚大学的Christoph A. Thaiss团队进行相关研究，其成果“A subpopulation of lipogenic brown adipocytes drives thermogenic memory”近期发表在Nature Metabolism上，该研究发现棕色脂肪具有储存产热记忆的功能，当再次经历寒冷暴露时，BAT能够快速做出产热响应，并且BAT的产热记忆最少可以储存16天。

敲黑板啦！

1、急性冷暴露后二次产热反应被增强。

2、急性冷暴露后BAT中脂质生物合成程序发生组织特异性延迟上调。

3、初次产热反应后，BAT诱导成脂棕色脂肪细胞亚群形成以促进二次产热。

4、BAT中的酰基肉碱生成有助于二次产热反应

研究结果

1. 急性冷暴露条件下的初次和二次产热反应

为了研究初次和二次产热反应背景下小鼠的冷耐受能力，研究人员首先将小鼠置于热中性环境中(30℃)，随后将小鼠分为三组进行实验，第一组小鼠始终处于热中性环境中(TN组），第二组小鼠从热中性环境中转移到冷暴露环境中(4℃)处理8h(1cyc组），第三组小鼠从热中性环境中转移到冷暴露环境中处理8h，接着回到热中性环境中处理4天，然后再次暴露于寒冷环境中处理8h(2cyc组）(图1A)。研究人员将TN组和1cyc组作为对照，发现在第一次暴露于寒冷环境后，三组小鼠体温迅速下降(图1B、C)，但在热中性恢复4天后再次暴露于寒冷环境会导致2cyc组小鼠的冷耐受能力显著增强。同时与初次冷暴露相比，二次冷暴露会伴随着小鼠能量消耗的增加(图S1A、B)。

为了确定急性冷暴露带来的代谢效益所能持续的时间，研究人员在初次和二次冷暴露之间分别设置8天(图1D)、16天(图1E)、32天(图1F)的热中性恢复时间，结果发现初次冷暴露带来的代谢效益在热中性恢复8天和16天后仍能发挥作用，但在热中性恢复32天后，初次冷暴露带来的代谢效益几乎被全部消除。为了进一步探究初次冷暴露带来的代谢效益是否依赖于BAT和UCP1，研究人员分别对手术切除BAT的小鼠和UCP1敲除小鼠进行急性冷暴露处理(图1G、H)，热中性处理4天后再次进行冷暴露处理，结果发现与WT小鼠相比，BAT切除小鼠和UCP1敲除小鼠在初次冷暴露中的冷耐受能力较差，并且BAT切除小鼠和UCP1敲除小鼠的二次产热反应与WT小鼠之间没有显著差异(图1G、H)，这表明急性寒冷状态下二次产热反应的增强依赖于BAT和UCP1。基于此，研究人员将BAT作为研究对象探究短暂寒冷暴露对二次产热反应分子、细胞和代谢进程产生的影响。

图1.增强急性冷暴露的二次产热反应

图S1.小鼠的能量消耗在初次冷暴露后4天的二次冷暴露中增加

2. 初次产热反应的转录变化

为了探究初次冷暴露对二次产热反应过程的影响，研究人员对急性冷暴露处理和热中性处理的小鼠的BAT进行了时序RNA-Seq差异表达分析（小编注：研究人员分别取急性冷暴露处理后恢复1、2、3、4、8、16、32天的小鼠BAT组织以及热中性处理的小鼠BAT组织进行时序RNA-Seq差异表达分析）(图2A)。无偏聚类分析表明，急性冷暴露处理促使转录组延迟恢复到基线水平(图2B)，并且BAT中差异基因表达分成了四种变化模式：(1)冷暴露后迅速上调；(2)冷暴露后迅速下调；(3)冷暴露后延迟上调；(4)冷暴露后持续上调数周 (图2C)。研究人员发现在产热过程中发挥显著作用的基因如Ucp1和Dio2在冷暴露后迅速上调(图2D-F)，令人惊讶的是，仅在恢复热中性后才能被诱导表达并且即使没有冷暴露也能持续表达的基因中，作者发现了参与脂肪酸从头合成途径(De novo lipogenesis, DNL)相关的基因例如ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase, Acly)、乙酰辅酶A羧化酶а(Acetyl-CoA carboxylase alpha, Acaca)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase, Fasn)、超长链脂肪酸延长酶6(Elongase of very long chain fatty acids 6, Elovl6)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Stearoyl-CoA desaturase 1, Scd1)(图2D-F)。这些发现表明先前发现的轻度和慢性寒冷刺激后脂质生物合成基因的表达不需要持续的寒冷暴露，甚至在短暂的寒冷刺激停止后仍会表达。接下来研究人员以热中性处理作为对照，确定了急性冷暴露处理后2天(图2G)和急性冷暴露处理后4天(图2G)BAT中表达水平发生变化的基因，结果发现与DNL途径相关的基因表达水平上调最多。与Fasn相比，Scd1的上调时间被延迟的更久，表明短暂冷暴露后BAT随时间依次延迟诱导了脂质生物合成与饱和脂肪去饱和(图2F)。在iWAT、肝脏或肌肉中脂质生物合成基因没有发生类似的变化(图S2A-C)，因此这些转录变化为BAT特有。与未经过冷暴露处理的小鼠相比，急性冷暴露处理后4天小鼠BAT中FASN蛋白水平上调(图S2D、E)，而UCP1蛋白水平没有显著变化(图S2D、E)。组织学分析显示，未经过冷暴露处理的小鼠和冷暴露处理小鼠的BAT组织结构无明显差异(图S2F)。综上，这些结果表明，急性冷暴露刺激产生的初次产热反应导致BAT中脂质生物合成程序被延迟以及组织特异性上调，BAT中转录程序变化情况与初次产热反应带来的代谢效益持续时间相关(图1B-F)。

图2.初次产热反应导致褐色脂肪组织中脂质生物合成程序的延迟诱导，而不依赖于持续的冷暴露

图S2.初次产热反应后脂质生物合成的转录诱导为BAT特有

3. 脂肪的从头合成促进棕色脂肪二次产热

接下来研究人员探究二次产热反应背景下脂质生物合成延迟诱导的重要性。研究人员将Scap^fl/fl小鼠与Ucp1-Cre小鼠杂交获得棕色脂肪特异性敲除Scap的小鼠(Scap^ΔUcp1) （小编注：Scap是脂肪从头合成的关键调节因子(SREBP cleavage-activating protein,Scap)，冷暴露后BAT中成脂基因表达所必须的因子，目前对甾醇调节元件结合蛋白（Sterol-regulatory element binding proteins, SREBPs）家族体内作用的研究表明，SREBP-2对胆固醇生成基因表达更具特异性，而SREBP-1靶向成脂基因。此处作者引用19年发表的PNAS中的研究结果，特异性敲除BAT中的Scap后会导致Srebp1c基因表达水平显著下调，进而抑制下游成脂基因而非胆固醇生成基因）。研究发现BAT中Scap的缺失会减弱初次冷暴露后第4天对Fasn和Scd1的转录刺激(图3A)，但不影响Ucp1的表达(图3B)。接下来，研究人员使用如图1A的实验处理来探究脂肪细胞合成脂肪的功能作用。与WT小鼠相比，Scap^ΔUcp1小鼠在初次寒冷刺激下的冷耐受力没有显著差异(图3C)，但WT小鼠的二次产热反应强于Scap^ΔUcp1小鼠，说明Scap能够增强二次产热反应(图3C、D)。为了进一步证实BAT中DNL途径在二次产热反应中的作用，研究人员还使用了棕色脂肪特异性敲除Fasn的小鼠(Fasn^ΔUcp1)，同样发现BAT敲除Fasn的小鼠与WT小鼠在初次寒冷刺激下的寒冷耐受力没有显著差异，但Fasn的缺失会抑制小鼠的二次产热反应(图3E、F)。然而，Scap和Fasn基因的缺失并不能完全解释初次和二次冷暴露处理对BAT脂肪生成的影响。因此，研究人员使用特异性抑制FASN活性的药理学抑制剂特异性阻断初次和二次冷暴露间的DNL过程，结果发现药物处理会减弱二次产热反应(图3G、H)。

二次产热依赖于棕色脂肪细胞的脂肪生成过程，基于此研究人员探究了脂肪生成过程和二次产热对全身代谢的影响。为了确定Scap敲除对BAT二次产热的贡献，研究人员在Scap^ΔUcp1小鼠初次产热反应4天后用去甲肾上腺素处理小鼠，测量小鼠全身耗氧量变化，发现与对照组相比Scap^ΔUcp1小鼠耗氧量降低(图3I、J)。此外，研究人员还探究了初次产热反应后第4天小鼠BAT中Scap敲除对葡萄糖耐量的贡献，发现急性冷暴露改善了对照小鼠的葡萄糖耐量，而Scap^ΔUcp1小鼠的葡萄糖耐量降低(图3K、L)。上述实验数据表明棕色脂肪细胞脂肪生成可改善小鼠的二次产热反应，并强调了在寒冷刺激消除后，棕色脂肪细胞脂肪生成仍能给机体带来代谢益处。

图3.棕色脂肪细胞脂肪生成促进急性冷暴露后二次产热反应的改善

4. 棕色脂肪组织对初次产热反应的响应

在面对短暂的寒冷暴露时，机体会对产热和脂肪合成时间进行分配。为了评估产热和脂肪合成基因的表达模式是否反映了BAT中细胞成分的变化，研究人员在热中性环境下对冷暴露和未冷暴露处理的小鼠BAT进行单细胞核测序(Single nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）(图S3A-C)，研究人员对2360个细胞核进行测序并根据不同的细胞标志物对脂肪细胞群进行亚聚类分析(图4A、B、图S4A)，鉴定出五个亚群：A1：Slc7a10⁺/Cyp2e1⁺(溶质载体家族7成员10(Solute carrier family 7 member 10, Slc7a10);细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,Cyp2e1))脂肪细胞；A2：中间脂肪细胞；A3：Ucp1^lo 脂肪细胞；A4：Ucp1^hi脂肪细胞；A5：成脂棕色脂肪细胞(图4C)。研究人员对每个亚群的标志基因进行分析，发现A1亚群与最近报道的脂肪细胞通过乙酸盐调节邻近脂肪细胞的亚群相同（小编注：此处作者引用20年发表的Nature文章，该研究通过单细胞核测序鉴定出一类表达高水平Cyp2e1和Aldh1a1的新脂肪细胞亚型，当在机体所处环境温度升高时，Cyp2e1⁺脂肪细胞丰度增加，并通过Aldh1a1产生抑制棕色脂肪细胞产热的旁分泌因子—乙酸盐），其中Slc7a10、Cyp2e1和Aldh1a1的表达水平较高(图4D)。A2亚群分别具有A1亚群和A3亚群的部分特征，包括Gulp1、Slc27a1和Negr1的表达水平升高(与A1相同而与A3不同)以及Tusc3、Prkag2和Gnas的表达水平升高(与A3相同而与A1不同）(图4D)，因此A2亚群被定义为介于A1和A3之间的中间脂肪细胞状态。此外，A3和A4亚群非常相似，但A4中Ucp1和Gnas表达水平显著高于A3亚群(图4D)，因此A3亚群被命名为Ucp1^lo 棕色脂肪细胞，A4亚群被命名为Ucp1^hi棕色脂肪细胞。GNAS（小编注：GNAS(GNAS Complex Locus)该基因编码G蛋白偶联受体的α亚基， 突变后会影响G蛋白活性。GNAS通过激活腺苷酸环化酶（AC）和β-肾上腺素能受体，上调cAMP水平，介导G蛋白偶联受体（GPCR）信号传导，导致PKA的下游激活）激活β-肾上腺素能受体进而上调下游的cAMP水平，在脂肪产热和激活UCP1的过程中发挥重要作用，这与Ucp1和Gnas为强共表达基因一致。值得注意的是，与其他脂肪细胞亚群(A1-A4)相比，A5亚群的高表达基因(Top ranked genes)与DNL基因Fasn、Scd1、Acaca和Acly相一致(图4D)，这表明BAT中的脂质生物合成是由棕色脂肪细胞的成脂亚群介导的。为了证实这一结论，研究人员对脂肪细胞亚群间差异表达基因进行分析，进一步确定了A5中脂肪生成基因特异性表达(图4E-G)。

随后研究人员分离出冷暴露和未经冷暴露处理的脂肪细胞核(图S4B-D)。冷暴露处理后BAT中的脂肪细胞亚群的分布发生显著变化(图4H、I)。在热中性条件下A5细胞亚群几乎完全不存在，而在短暂冷暴露后第4天A5细胞亚群比例迅速上调(图4H、I)，在初次冷暴露处理4天后，BAT中A4细胞亚群即Ucp1^hi脂肪细胞比例上调，而A1细胞亚群比例下调(图4H、I)，先前也有研究发现A1细胞群体在热中性条件下比例上调。在A4和A5细胞亚群中，Fasn和Ucp1的表达呈现强烈的负相关关系，即成脂棕色脂肪细胞亚群表达高水平的Fasn和低水平的Ucp1(图4J、K、图S4E、F)。Ucp1^hi和DNL亚群之间脂肪酸氧化相关基因如肉碱棕榈酰转移酶2(Carnitine palmitoyltransferase 2, Cpt2)转录水平没有差异(图S4E)。这些数据进一步表明短暂急性寒冷引起的初次产热反应能够持续诱导BAT中脂质生物合成程序持续转录，该过程主要由BAT中专门合成脂肪的成脂棕色脂肪细胞亚群诱导。

为了确定人类BAT中是否具有类似的棕色脂肪细胞亚群，研究人员又对人类棕色脂肪转录组数据集进行分析，通过整合脂肪细胞亚群并进行无偏聚类分析，研究人员发现了一类基于Fasn表达的成脂棕色脂肪细胞亚群，该亚群与Ucp1^hi棕色脂肪细胞亚群存在差异(图4I-O)。这些发现进一步证实BAT中存在一种特殊的合成脂肪的细胞，同时也表明Fasn是该脂肪细胞亚群的标志基因，在小鼠和人类中高度保守。

图4.初次产热反应诱导成脂棕色脂肪细胞亚群

图S3.BAT核分离的工作流程及验证实验

图S4.单核RNA测序分离BAT中的细胞类型和脂肪细胞亚群

5. 初次产热刺激后棕色脂肪组织的空间模式变化

棕色脂肪组织在短暂寒冷刺激后转录组发生强烈的变化，接下来研究人员探究了不同脂肪细胞亚群的空间模式。研究人员在热中性环境下对冷暴露和未冷暴露处理的小鼠BAT切片进行空间转录组学分析，应用SpaDecon(一种结合了细胞类型能够以反卷积的方式对基因表达、空间位置、组织学信息进行分析的方法），将snRNA-seq与空间转录组数据进行整合，以确定不同细胞类型对每个数据点的贡献，并计算BAT组织切片间不同细胞类型的分布差异(图5A、B)。研究人员发现所有数据点上细胞类型的平均比例与snRNA-seq数据中观察到的比例基本一致(图S5A、B)。

接下来，研究人员使用不同种类细胞的比例估计值来计算不同种类细胞的空间相关性，由组织切片中所有数据点上每对细胞类型比例之间的相关性进行定义(图5A、B)。在热中性条件下，研究人员发现Slc7a10⁺/Cyp2e1⁺A1脂肪细胞亚群与包括内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞、骨骼肌细胞和平滑肌细胞在内的非脂肪细胞存在显著的共定位(图5A)。脂肪细胞亚群A2、A3和A4之间具有显著的空间相关性，非脂肪细胞彼此之间具有最高的空间相关性，这表明脂肪细胞和非脂肪细胞在热中性条件下的BAT组织空间中彼此分隔(图5A)。短暂急性冷暴露后第4天，BAT中A5亚群(成脂棕色脂肪细胞)开始出现(图S5C)，该亚群与A1亚群和非脂肪细胞的空间相关性更强(图S5B)，这表明A1和A5脂肪细胞亚群位于棕色脂肪库的特定区域，可能比其他脂肪细胞亚群更容易对BAT中非脂肪细胞发出的旁分泌或近分泌信号做出反应。为了更详细地评估脂肪细胞亚群A1-A5的空间分布，研究人员重点关注关键标记基因Ucp1、Fasn、Scd1、Gnas和Cyp2e1在热中性和短暂急性寒冷暴露后第4天的情况(图5 C、D)。研究发现Fasn和Scd1 (A5脂肪细胞亚群标志物)以及Cyp2e1 (A1脂肪细胞亚群标志物)的表达水平的升高局限于组织外围，以Ucp1和Gnas表达升高的细胞亚群(A4细胞亚群）为核心。在Ucp1表达量超过50%的数据点中，Scd1、Cyp2e1与Ucp1基因表达水平呈负相关(图5C-F）。

接下来为了在蛋白水平上进行进一步验证，研究人员对冷暴露处理和未经冷暴露处理小鼠BAT切片中的UCP1和FASN进行了免疫荧光染色，发现初次产热反应后第4天FASN⁺脂肪细胞数量显著增加(图5G、H)。并在单个细胞水平上证实了FASN蛋白表达与UCP1蛋白表达之间的具有强烈的负相关性，同时FASN⁺脂肪细胞包围Ucp1^hi脂肪细胞(图5G-I)，这与空间转录组学数据的结果相似(图5D)。总之，这些实验数据证明了BAT在初次产热反应后的空间格局的动态重构，并强调了短暂寒冷刺激后的成脂棕色脂肪细胞的状态相对于Ucp1^hi脂肪细胞发生了显著的分布变化。

图5.在初次产热反应后，棕色脂肪细胞在棕色脂肪组织中显示出明显的空间组织模式

图S5.空间转录组学数据和snRNAseq数据中的细胞类型分布

6. 酰基肉碱有助于二次产热

最后研究人员试图探究BAT中脂肪生成的下游机制，这些机制有助于增强二次产热反应，研究人员推测BAT中脂质代谢物水平的持续重编程可能介导了二次产热反应的改善，因此，研究人员对热中性处理、急性冷暴露后热中性恢复不同时间的小鼠的棕色脂肪进行了非靶向脂质组学研究，发现脂质代谢物在恢复热中性后的几天到几周时间内急剧升高(图6A-C)。在所有分析的脂类物质中，长链酰基肉碱在数天内持续上调(图6A、B)，并在恢复热中性后32天回到基线水平(图6C)，因此，BAT中酰基肉碱的丰度与脂肪组织增强二次产热反应的能力相关(图1)。在总体范围内，研究人员根据冷暴露后的代谢物时间变化模式，对不同种类的代谢物进行无偏分类，共分为3种模式：(1)迅速增加、(2)迅速抑制、(3)持续增加(图6D)，在冷暴露后，酰基肉碱类物质持续增加(图6E)，而总游离脂肪酸、甘油脂、磷脂或鞘脂等其他主要脂质代谢物，在短暂的冷暴露中没有出现增加的情况(图S6A-C)。研究人员进一步分析了特定的长链酰基肉碱，探索其丰度如何随着时间的推移而变化，发现棕榈酰肉碱(C16)、棕榈油基肉碱(C16:1)、硬脂酰肉碱(C18)、油基肉碱(C18:1)等大多数长链酰基肉碱的丰度都是迅速增加，接着仍持续高表达(图6F)。

鉴于DNL通路在促进冷暴露小鼠产热能力过程中的重要性，研究人员试图确定冷暴露后酰基肉碱的增加是否依赖于SCAP和FASN。使用药物抑制FASN后会在初次冷暴露后第4天降低酰基肉碱的丰度(图6G、H)，并使其游离脂肪酸升高，而其他代谢物不受影响(图S6D)。全身给药FASN抑制剂会间接影响BAT酰基肉碱水平，而Scap^ΔUcp1小鼠只有BAT中脂肪合成过程受到影响，因此研究人员还测量了Scap^ΔUcp1小鼠的酰基肉碱。研究人员发现Scap^ΔUcp1小鼠在初次冷暴露后第4天C16肉毒碱丰度显著下降，C16:1肉毒碱也有下降的趋势(图6I)。值得注意的是，敲除BAT中的Scap后参与酰基肉碱运输或脂肪酸氧化的基因表达没有差异，例如肉毒碱酯酰转移酶(Carnitine-acylcarnitine translocase, Slc25a20/Cact)、长链酰基辅酶a脱氢酶(Long-chain acyl-CoA dehydrogenase, Acadl/Lcad)和中链酰基辅酶a脱氢酶(Medium-chain acyl-CoA dehydrogena, Acadm/Mcad)(图S7A-C)。

基于上述研究，研究人员探究初次冷暴露诱导的酰基肉碱是否足以增强二次产热反应。研究人员在二次冷暴露开始时向Scap^ΔUcp1小鼠补充200μL的100μM C16肉毒碱、C16:1肉毒碱和C18:1肉毒碱的混合物，并测定Scap^ΔUcp1小鼠在二次产热反应中的冷耐受能力。值得注意的是，虽然初次产热反应没有受到影响，但补充酰基肉碱可以部分恢复Scap^ΔUcp1小鼠的二次产热反应(图6J)。这些数据表明BAT的内在脂肪合成通过上调急性冷暴露后酰基肉碱，从而持续改善二次产热反应。（小编注：酰基肉碱由肉碱和酰基辅酶A经过催化反应形成，主要在脂肪酸代谢通路中发挥作用，在脂肪酸氧化代谢中，酰基肉碱与脂肪酸结合形成酰基肉碱脂肪酸，接着进入线粒体内参与氧化放能。在本研究中，作者发现初次冷暴露后BAT中DNL通路上调，导致酰基肉碱水平上调，酰基肉碱促进下游脂肪酸分解代谢发生，增加线粒体产热，最终改善二次产热反应）。

图6.初次产热反应导致脂肪生成驱动的棕色脂肪组织中酰基肉碱的持续升高

图S6.初次产热反应后BAT中游离脂肪酸、甘油脂或磷脂和鞘脂的总量

图S7.敲除BAT中的Scap后不影响参与酰基肉碱运输或脂肪酸氧化相关基因的表达

总结

在本研究中，研究人员证实棕色脂肪具有储存产热记忆的功能，并且棕色脂肪的产热记忆最少可以储存16天，研究人员发现短暂的寒冷暴露可导致棕色脂肪组织持续转录和代谢适应，初次产热反应即使在寒冷停止后仍会触发脂质生物合成程序的延迟诱导，进而增强二次冷暴露时的二次产热反应。在机制上，研究人员发现初次产热反应带来的代谢效益由A5成脂细胞亚群驱动，这种成脂程序与酰基肉碱的产生有关，补充酰基肉碱能够增强二次产热反应。总之，本研究强调了异质性棕色脂肪细胞群对“产热记忆”的重要性，这对利用短期产热以治疗肥胖和代谢性疾病具有重要意义。

文章链接:https://www.nature.com/articles/s42255-023-00893-w