掠食性粘细菌通过调节土壤微生物群落来控制黄瓜枯萎病

A predatory myxobacterium controls cucumber Fusarium wilt by regulating the soil microbial community

Microbiome

Impact Factor 10.465

DOI：https://doi.org/10.1186/s40168-020-00824-x

发表日期：2020-04-06

第一作者：叶现丰^1†,李周坤^1†

通讯作者： 崔中利^1,4，张瑞福⁵

合作作者：Xue Luo, Wenhui Wang, Yongkai Li, Rui Li, Bo Zhang, Yan Qiao, Jie Zhou, Jiaqin Fan,Hui Wang,Yan Huang,Hui Cao,

主要单位：

¹南京农业大学生命科学学院(Key Laboratory of Agricultural Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, College of Life Science of Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, People’s Republic of China)

⁴南京农业大学植物免疫重点实验室(Key Laboratory of plant immunity, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, People’s Republic of China)

⁵中国农业科学院农业资源与农业区划研究所(Key Laboratory of Microbial Resources Collection and Preservation, Ministry of Agriculture, Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, People’s Republic of China)

写在前面

分享标题：Microbiome：南农大团队在粘细菌捕食的生态学功能方面取得重要进展

关键字：粘细菌，微捕食者，珊瑚球菌EGB，黄瓜尖孢镰刀菌，土壤微生物组，根系分泌物，共现网络

新闻稿

• Microbiome：南农大崔中利团队在粘细菌捕食的生态学功能方面取得重要进展

摘要

背景

粘细菌是土壤生态系统中的微捕食者，具有协同移动和觅食的能力。一些粘细菌菌株已被用于控制土壤传播的真菌植物病原体。然而，粘细菌，植物病原体和土壤微生物组之间的相互作用在很大程度上尚未被探索。在这项研究中，我们旨在调查粘细菌珊瑚球菌菌株EGB在土壤中的行为及其对接种黄瓜后(以控制由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum(FOC))引起的黄瓜枯萎病)对土壤微生物组的影响。

结果

温室和两年的田间试验表明，固态发酵菌株EGB显著降低了黄瓜枯萎病，其中79.6％(温室)，66.0％(2015年，田间)和53.9％(2016年，田间)。EGB菌株很好地适应了土壤环境，有效降低了土传FOC的含量。对土壤微生物群落的时空分析表明，菌株EGB通过趋化作用向黄瓜植物的根和根分泌物迁移。对土壤微生物组的共现网络分析表明，施加菌株EGB后，模块数和群落数减少，但每个节点的连接数增加。几种捕食性细菌，如Lysobacter，Microvirga，和Cupriavidus表现为hubs 或indicators节点，显示与其他细菌的紧密连接。

结论

掠食性粘细菌Corallococcus sp. (珊瑚球菌)EGB菌株通过迁移到植物根部并调节土壤微生物群落来控制黄瓜枯萎病。该菌株有潜力被开发为土传枯萎病的新型生物防治剂。

结果

表 1 EGB菌种固体培养的应用对黄瓜枯萎病发病率以及黄瓜根系周围土壤中FOC和EGB菌种数量的影响

Effects of strain EGB solid culture application on the disease incidences of cucumber Fusarium wilt, and quantities of strains FOC and EGB in soil surrounding cucumber roots

在温室实验中，每种处理均重复3次，数据代表3次重复的均值和标准差(均值±标准差)。在同一列中，根据Duncan检验，用相同字母指定的值没有显着差异(p ≤ 0.05)。

NT，无FOC或菌株EGB固体培养；EGB，仅EGB菌株固体培养；EGBFOC，FOC和EGB固体培养； FOC，仅FOC

图1 EGB菌株在黄瓜枯萎病防治中的两年田间表现

Two-year field performance of strain EGB in the control of cucumber Fusarium wilt

EGB菌株在黄瓜枯萎病防治中的两年田间表现。2015年使用EGB菌株一个月后黄瓜的生长；a未经处理的对照，b EGB液体培养和c EGB固体培养。B，C 2015年(B)和2016年(C)的枯萎病发病率的统计分析。每种处理中的200个黄瓜随机分为四个块，误差棒表示四次重复的平均值的标准偏差。根据Duncan检验，用相同字母表示的值没有显着差异(p≤0.05)。

图2 取样策略和Corallococcus 和Fusarium 的相对时空丰度

Sampling strategy and relative spatiotemporal abundances of Corallococcus and Fusarium

取样策略(a)和(珊瑚球菌)Corallococcus(b)和镰刀菌(c)的相对时空丰度。I，菌株EGB接种部位； R，根部周围的采样点； M，黄瓜根与接种部位之间的部位；

NT，无FOC或菌株EGB固体培养；EGB，仅EGB菌株固体培养；EGBFOC，FOC和EGB固体培养； FOC，仅FOC

每个样品重复3次，误差棒代表三个重复试验的平均值的标准偏差。根据Duncan检验，用相同字母表示的值没有显著差异(p ≤ 0.05)

图3 EGB菌株对TPM板上黄瓜根分泌物的趋化性

Chemotaxis of strain EGB towards cucumber root exudates on TPM plates

EGB菌株对TPM板上黄瓜根分泌物的趋化性。aEGB对化学物质的趋化反应示意图。b用柠檬酸进行趋化性试验的可行性测试。c菌株EGB对黄瓜根分泌物的趋化性。RE，黄瓜的根分泌物；黑色箭头，出现不对称群集的位置；白色箭头，是滴落化学药品的位置；红色虚线，菌株EGB群集定殖的边缘。实验重复了四次，每次重复三遍。

表2 EGB菌株对黄瓜根分泌物中13种化合物的趋化反应

The chemotactic response of strain EGB to 13 compounds in cucumber root exudates

EGB菌株对黄瓜根分泌物中13种化合物的趋化反应。“+”，趋化反应阳性，多个+表示趋化反应强度；“-”，无趋化反应。重复三次实验，重复三个样品。

图4 EGB菌株对黄瓜根的定殖

Colonization of cucumber roots by strain EGB

EGB菌株对黄瓜根的定殖。a，c和e 黄瓜根的分生区。b，d和f 黄瓜根的伸长区。a，b 空白TPM缓冲对照。 c，d 大肠杆菌DH10B阴性对照。 e，f EGB处理。箭头，大肠杆菌DH10B或菌株EGB的细胞。

图5 土壤细菌和真菌群落的主成分分析

Principal component analysis of the soil bacterial and fungal communities

土壤细菌(a)和真菌(b)群落的主成分分析。NT，无FOC或菌株EGB固体培养；EGB，仅EGB菌株固体培养；EGBFOC，FOC和EGB固体培养； FOC，仅FOC。R，根部周围的采样点；M，接种部位和黄瓜根之间的部位；15，第15天取样的土壤； 27，第27天取样的土壤。

表3 微生物组网络的相关性和拓扑特性

Correlation and topological properties of the microbiome networks

R，黄瓜根周围土壤样品；M，从黄瓜根和接种部位之间的部位取样的土壤；15th day，第15天取样的土壤； 27th day, ，第27天取样的土壤；NT，无FOC或菌株EGB固体培养；EGB，仅EGB菌株固体培养；EGBFOC，FOC和EGB固体培养； FOC，仅FOC

^a微生物分类群（属水平）至少具有一种显着(p <0.001)和强相关性(r> 0.7或≤0.7)。R语言和corr.test()用于相关性分析。

^b通过R语言分析获得的连接数(R 2017, 4version 3.5.3)

^c两个微生物类群之间的正相关(> 0.7，p <0.01)

^d两个微生物类群之间的负相关(≥  0.7，p <0.01)

^e节点之间具有高密度连接的结构(由Gephi推断)

^f群落定义为内部紧密连接的一组节点(Gephi)

^g网络中节点之间的最长距离，以边数测量(Gephi)

^h所有节点对之间的平均网络距离或网络中所有边的平均长度(Gephi)

ⁱ网络中每个节点的平均连接数(Gephi)

^j平均聚类系数定义为各个系数的平均值(Gephi)

^k用于测量网络完成程度的密度。完整的图具有所有可能的边和密度等于1(Gephi)

图6 不同土壤样本中细菌群落的网络共现分析

Network cooccurrence analysis (Spearman |ρ| > 0.7 and p< 0.001)of bacterial communities from different soil samples

不同土壤样本中细菌群落的网络共现分析(Spearman |ρ| > 0.7 and p<
0.001)。每个结点代表属的分类水平(基于16S rRNA)，结点的大小与样品中属水平的相对丰度成正比。红线表示正相关，蓝线表示负相关。线宽代表相关程度。捕食性细菌用黄色框标记。R，根部周围的采样点；M，接种部位和黄瓜根之间的部位；NT，无FOC或菌株EGB固体培养；EGB，仅EGB菌株固体培养；EGBFOC，FOC和EGB固体培养；FOC，仅FOC；15^th day，第15天取样的土壤；27^th day，第27天取样的土壤。

讨论

温室实验表明，粘细菌是有望的潜在生物防治剂，可有效控制无菌泥炭或土壤中树苗的腐烂病，黄瓜枯萎病和辣椒中的炭疽病。但是，尚未进行田间试验来评估蔬菜作物的土传真菌病原体的粘细菌生物防治。在黄瓜田间试验中，菌株EGB固体培养物有效降低了青枯病的发病率。qPCR分析表明，EGB菌株非常适合土壤环境。在实验结束时，黄瓜根周围土壤中的菌株EGB数量保持在每克土壤中10⁵–10⁶个拷贝，这是BCAs保护植物的关键水平。观察到FOC对Corallococcus(珊瑚球菌)的诱导，表明粘细菌与FOC之间存在相互作用。但是，它的数量比菌株EGB处理的数量少1.1-1.6个数量级。有效的定殖和在植物根部形成生物膜样结构对于通过植物根际促生菌(PGPR)进行植物病害的生物防治至关重要。荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CHA0中增强的生物膜形成显著增强了胡萝卜根的定殖并导致混合接种物与根际之间更稳定的相互作用。在水培试验中，EGB菌株定殖在根部伸长区并显示出可见的生物膜状结构。粘细菌分泌大量胞外基质，可促进生物膜形成和根部定殖。粘细菌以其它土壤微生物为食的能力导致这些细菌的繁殖并减少了猎物的数量。但是，传统的BCAs必须与本地微生物群落竞争资源才能在土壤中生存，这降低了它们的适应能力。

细菌在土壤中的移动会严重影响其定殖效率，微生物适应性以及细菌介导的生物防治能力。鞭毛以趋化或群集的形式驱动主动运动。我们发现完整的趋化性和成群的运动机制对于PGPR到达和定殖于植物根部很重要。高能动性突变增强了荧光假单胞菌(P. fluorescens)F113对苜蓿根表面的定殖并提高了其生物防治活性。Gao等人进一步表明，群聚在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的根定殖中起着重要的作用。然而，鞭毛驱动的运动在潮湿的土壤中受到限制。时空高通量测序揭示了菌株EGB向黄瓜根的剧烈运动。对于菌株EGB，观察到从接种部位到根部移动了8cm。尽管粘细菌缺乏鞭毛并且不能在液体环境中游泳，但是这些生物在协调的细胞群中或作为独立个体在固体表面上滑动。由粘着斑复合物驱动的这种滑动运动使粘细菌细胞在相对干燥和坚硬的土壤基质上滑动。

我们推测黄瓜的根系分泌物吸引了土壤中EGB菌株的运动。许多研究表明，对根系分泌物的趋化性是根系细菌定殖的第一步。植物分泌的有机酸，氨基酸，糖，季铵盐和次生代谢产物都是有益细菌的潜在趋化因子。我们的结果表明，根系分泌物也可能吸引EGB菌株。详细分析表明，根系分泌物中的几种化合物诱导了EGB菌株的趋化运动。麦芽糖和麦芽糖醇是最有效的化学吸引剂，在低浓度(10μM)下能吸引菌株EGB。已确定麦芽糖是黄瓜和其他植物根系分泌物中的重要化合物。尽管粘细菌对小的可溶性化学物质的趋化性值得怀疑，但由菌毛为基础的单细胞“抽搐运动”驱动的趋化性已被证明对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的生物膜发育很重要。这项研究确定了黏细菌对根分泌液中的糖的趋化作用，这以前未见报道，可能在EGB菌株对黄瓜根的定殖中起重要作用。麦芽糖在粘细菌-根相互作用中的作用值得在未来的研究中进一步研究。

根际微生物组对植物生长，营养和健康至关重要。抑病型土壤为保护农作物免受土传病原体感染提供了最好的例子。抑病型土壤的发展可以通过长期的单一栽培或有机改良剂来诱导。在抑病型土壤中发现了独特的细菌群落。详细分析表明，特定的细菌菌株在土传疾病的抑制中起作用。从抑病型土壤中分离出的假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)可产生抑制马铃薯中的根瘤菌衰减和草莓中枯萎病的抗生素。但是，由于与本地土壤微生物组竞争，从抑制性土壤中分离出的许多微生物无法建立或存活于土壤中或植物根部。拮抗菌株的再引入轻微或短暂地改变了植物的微生物群并在大规模农业应用中取得了有限的成功。噬菌体的原生生物已被证明是土壤微生物组中的中心枢纽，并导致了该地区某些细菌类群的罕见。

作为一种掠食性细菌，EGB菌株能够捕食各种细菌。因此，我们推论出菌株EGB可能会影响土壤微生物。群落结构分析表明，菌株EGB能动态改变土壤细菌的多样性。共现网络分析表明，菌株EGB推动了微生物群落的改变。发现根部周围微生物群的高度连接降低了病原体的入侵成功率。观察到潜在的有益植物的细菌(如芽孢杆菌，假单胞菌，固氮菌和溶菌杆菌) (Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter, Lysobacter)与掠食性细菌之间存在显著的正相关。珊瑚球菌和其他潜在有益细菌属之间的正相关性可能有助于预防真菌感染，但需要进一步验证。

EGB固体培养应用后真菌群落的相互作用网络变得更加脆弱。尽管尚不清楚土壤真菌多样性的降低是否是抑制过程的指标，但许多研究表明，真菌多样性和真菌群落结构的复杂性与疾病抑制呈负相关。

已经详细研究了BCAs的各种作用方式。然而，成功的生物防治不仅取决于植物与微生物的相互作用，还取决于BCAs的生态适应性。人工引入的PGPR的细胞密度在几周内总是下降到一个较低的水平，而要实现生物防治功能，必须达到一个关键的定殖水平。但是，在低细胞密度下，BCAs很难积累足够的抗生素来对抗病原体，占据生态位或与土传病原体竞争营养。除了BCAs菌株对植物病原体的直接影响外，现在还考虑了BCAs驱动的微生物群落修饰对病原体发育的影响。我们认为，通过捕食进行的生物防治为土传植物病原体的管理提供了巨大的机会。直接捕食植物病原体和竞争性土壤细菌对于BCAs在土壤环境中的适应性也是理想的。粘细菌是生长缓慢的细菌，具有产生耐热孢子的能力，并且缓慢生长的耐热细菌家族在植物保护中具有潜在作用。虽然如此，由于其广泛的猎物范围，EGB菌株对土壤微生物的非靶向作用应在未来研究中给予更多关注。

结论

根际微生物组在植物对土传病原体抗性中的重要性已得到广泛认可，而掠食性微生物在植物病原体的生物防治方面受到的关注较少。在田间试验中，掠食性粘细菌珊瑚球菌(Corallococcus sp. )菌株EGB对枯萎病表现出强大的生物防治作用。我们的结果表明，菌株EGB通过捕食改变了土壤微生物群落结构，*并减少了土壤中FOC的含量。考虑到EGB菌株的捕食习性及其对土壤环境的良好适应性，EGB菌株作为一种新型的枯萎病生物防治药剂具有巨大的商业开发潜力。

Reference

Xianfeng Ye,Zhoukun Li,Xue Luo,Wenhui Wang,Yongkai Li,Rui Li,Bo Zhang,Yan Qiao,Jie Zhou,Jiaqin Fan,Hui Wang,Yan Huang,Hui Cao,Zhongli Cui,Ruifu Zhang. A predatory myxobacterium controls
cucumber Fusarium wilt by regulating the soil microbial community.Microbiom, (2020) 8:49 https://doi.org/10.1186/s40168-020-00824-x

Microbiome 南农发现土壤菌群中维持生态平衡的“狼群”竟然是它

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