卵母细胞凋亡信号检测（JC-1标记法）

实验目的：卵母细胞线粒体极性检测，是为凋亡的早期标志。凋亡细胞中异常线粒体，JC-1为单体，绿色；正常线粒体JC-1为聚体，红色。正常细胞之凋亡与否，以红比绿的比值做评估。

试剂耗材：

          （1）细胞培养液：M2或M16等，可以加入米力农（Milrinone）。

          （2）JC-1试剂（5mg/mL，分装为小管，避光，-20度保存）。如果有CCCP，可按说明书操作，设计阳性对照。

          （3）口吸管、台式镜等设备。

实验样品：ICR品系小鼠。

实验步骤：

          （1）JC-1的准备：将JC-1按照1:200比例，用培养液或操作液稀释，避光，做滴，覆盖石蜡油，37度平衡。如需染核，可在JC-1中加入Hoechst，工作浓度100nM。如需要CCCP处理，或者其它处理，在活细胞观察之前30-60分钟内加入Hoechst。

          （2）分离裸卵。移入JC-1滴中，37度30分钟。 

          （3）将卵取出，操作液清洗2次。

          （4）将卵母细胞放入玻璃底培养皿中，在激光共聚焦上观察。

          （5）注意，JC-1的染色结果，可能受到米力农的影响，待确认。

问题分析：

          （1）JC-1标记SN期卵母细胞，似乎细胞之间差异甚大，思考其中原因。

          （2）哪种因素能使卵母细胞凋亡。

          （3）自卵母细胞发生凋亡，至于卵母细胞之死，需要多长时间。

          （4）卵母细胞如何抵抗胁迫，哪一信号是导致卵母细胞进入凋亡的终极信号。