一篇有关个体生命起始的论文的诞生：由假想到实验历经20年

傅新元

科学工作者的人生，往往有着某种悲剧性或喜剧性：他／她可以由于实验的失败极度失望，也可以因为一个长久追寻的“假说”得到证明而欢喜若狂。由于失败总是远远多于成功，因此，要做真正的原创性科学研究，不仅需要智力和体力，更需要坚强的意志和百折不饶的信心。以承担科学工作做为谋生手段，大概是不可靠的。追寻科学发现的人生，从来不会是世俗人士的选择。真正科学“家”的生涯，是 passion－driven 的遥远的理想之途：只有开始和进取，却没有终结。

不论有多少挫折和诅丧，你必须 “eat it”。或许，你有时可以喘口气，那是当你的假说获得初步的证明，苛刻的科学同仁的对你有所认可。 这时，你属于幸运的极少数。所谓的 All's well that ends well. 然而，对于科学家，这里的“end”，仍是“another beginning“。“幸运”就是意味着更多的新问题在等待着你。

在此时此刻，我大概属于此类短暂的幸运之人士。我的幸运， 都归功于数年来勤奋工作的，聪明能干的, 了不起的年轻学子。

这幸运的最初征兆，发生在两年多前的一个阳光明媚的日子：光明不是来自外面的烈日，而是出于一个优异的越南学生，DangVinh Do，展现给我的实验结果：STAT3（我们研究经年的，重要的调控基因表达的蛋白）在受精卵两次分裂后，于四个细胞的小鼠胚胎时期，奇迹般地从细胞质进入细胞核：STAT3 被激活了 (Activated)。这令人惊讶的现象，在我的眼中，如同神迹的出现。 为什么我会如此激动？ 在个体生命起始时期，STAT3的激活又有何意义呢？

插图：Expression of STAT3 during preimplantation mouse development. (A) Immunodetectionwith pan-STAT3 antibody indicates nuclear localization of STAT3 starting fromthe 4-cell stage. (B) Immunodetection with antibody specific to phosphorylatedtyrosine (pY705)-STAT3 and to OCT4 show nuclear STAT3 is tyrosinephosphorylated and correlates with re-expression of OCT4 in the 4-cell embryos.(Scale bar: 20 µm).

From ¹GENES& DEVELOPMENT 27:1378–1390，June 15th，2013

（http://genesdev.cshlp.org/content/27/12/1378?top=1）

故事的源头要进一步追溯到二十年前。

那是1993年的一个晚间，纽约西奈山医学院生化系的实验室。我在分析一位学生刚刚获得的DNA序列的信息：从非洲蟾蜍 （Xenopus  laevis ）卵母细胞的cDNA里，我们发现了一个新的STAT （SignalTransducer & Activator of Transcription) ²基因 。稍后我们发现此卵母细胞里表达的STAT基因和我的同事Zhong Zhong 克隆的哺乳动物的STAT3同源 ³。

当时 STAT1和 STAT2 的基因已被克隆 ⁴。JAK-STAT 介导的分子信号通路刚被发现 ^5,6。 这些成果来自对干扰素 （高等生物产生的抗病毒的细胞因子）的信号通路的综合的研究 ²。 在随后的许多年里，领域内的科学家大都认为 JAK－STAT 的主要功能是调控细胞因子 （cytokines）引发的基因表达，特别是在免疫及炎症系统里起关键作用。 过去二十年里的大量的实验已证明 JAK-STAT 参与了免疫系统的演化和各个层次的免疫反应的调控 ⁷。

为什么早在1993年，我们却异乎寻常的选择了卵母细胞来研究STAT？

这是基于对生命起始过程的一个近乎疯狂的猜想。 按现在流行的说法，一个重大科学问题开启了一个科学工作者的梦想。

当时我初出茅庐，建立自己实验室不久，生气勃勃，信心满满， 希望向生命科学里最重大问题发起冲击。

生命科学的一个引人入胜的基本问题是受精后， 融合的受精卵 （Zygote）如何启动最早的胚胎形成 （embryogenesis），即所谓的个体生命如何起始和发育的问题。 可以预期，在卵母细胞表达，已存于卵子里的（maternallyexpressed）某些活性分子，特别是基因转录因子 （transcription factor）在受精后，胚胎形成中应该有重要的功能。可以推论，从受精卵发育成胚胎，必须遵循一个系统的，规则的，严格控制的基因表达程序 （program）。 由推论到证明，需要切实的实验。 遗憾的是，在当时以至现在，有关这一关键步骤的调控的分子机制仍不清楚。

最早引起我注意的一个有趣的现象是在受精的瞬间，酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）的活化。 我们较早的研究已证明 STAT 蛋白最显著的特异性表现在已预存于细胞质，受酪氨酸激酶专一性修饰后，转变为具有活性的基因转录因子，进入细胞核，调控特定的基因表达⁶。我常常把这讯号通路称之为 PTK－STAT Pathway。

我由此设想， 受精后的酪氨酸激酶 PTK 是否会引起 Maternal STAT活化，然后活化的STAT 进而成为引导最初胚胎形成的关键的基因转录因子？

当时我的小小的实验室，以极为有限的研究经费，破例购入一百多只非洲蟾蜍，和我当时在西奈山医学院的一位同事合作，希望解析这 Maternal STAT 在胚胎发育中的功能。 实验才开始，我的人生轨迹就发生了一个变化。

1994年，耶鲁大学向我发出工作邀请。 我在西奈山医学院的实验室当时才建立不到三年，搬家将影响到正在进行的项目。我迟疑了一段时间，最终决定去耶鲁建立一个新的实验室。当时耶鲁没有专长 Xenopus 的胚胎发育研究的实验室，我无法发现合作者，也没有有关设施。我所属的系科是病理和免疫，和胚胎发育大都无关。这些不利的条件迫使我中断 Maternal STAT 及胚胎发育的项目。一百多只非洲蟾蜍转送给了我在西奈山医学院的同事。此项目可谓先兴师动众，然而立即出师不利。

在1996-1997期间, 我的实验室先后获得NIH 三个 RO1 研究基金支持，于是再次决定要系统的建立研究STAT的 in vivo 动物体系，改变我已适应和精通的，限于生化和细胞水平上的研究方向。我预期到，作为一位生化研究者，转向我生疏的方向去建立STAT突变体的动物模型可能会遇到的困境。 开始的办法很简单： 鼓动一个来自日本的博士后， Yoshiki Iwamoto，一个极为优秀的生化专家 （毕业于PKC 发现者 Y. Nishizuka实验室），到耶鲁同事 Richard Flavell 的实验室去学习如何做小鼠的 STAT3 基因敲除 （knockout， KO）。

我们要开始做 mouse genetics !

最初的进展和实验室的转型是缓慢的，有时是痛苦的和令人失望的。

在我们刚刚起步，日本大阪大学的 Shizuo Akira （他是STAT3的发现者之一，现在主要研究 innate immunity）实验室，就发表了STAT3整体敲除的论文 ⁸。值得侃调的是，他的论文证实了我猜测到的, 试图我们自己来证明的一个现象：STAT3在胚胎发育中是必需的。没有STAT3，小鼠胚胎早期死亡。 但是 Akira研究组并没有继续探讨由于 STAT3 缺失导致死亡的分子和遗传机制。

Akira 实验的结果，促使我们从头开始，建立由Cre-LoxP驱使的，有条件的，不同组织的 STAT3 专向敲除，而不是 Akira 已做的整体敲除。 幸运地是，在Dr Iwamoto 就要离开我的实验室，去建立他自己独立的实验室之前，在我的朋友，当时在哈佛大学的李恩的大力帮助下，在1999-2000年，我们成功的获得了 Floxed STAT3 小鼠品系，从而可以进一步产生组织特异的STAT3被敲除的小鼠。 数年后，我的实验室利用 STAT3 组织特异敲除小鼠作为研究体系，发表了一系列论文，阐述了 STAT3 在炎症，心脏衰死，到肥胖症等病理发展中的关键功能。

但是，有关STAT3在发育，特别是在胚胎早期发育里的功能的研究项目，仍遇到不断的挫折。

实验室的谢兵同学，在博士毕业后，仍用一年多的时间试图建立一个 Inducible STAT3KO 胚胎干细胞体系。 他观察到一个颇为有趣的现象：敲除STAT3后的胚胎干细胞似乎自动的 （by default）变成类似神经细胞样的分化细胞， 显示了STAT3 或许控制，或抑制胚胎干细胞的分化。 在我们试图进一步分析其中的分子机理时， 英国的 Austin Smith 实验室 已捷足先登， 利用一快速和简单的生化方法，即通过对 STAT3 显性抑制 （dominant negative ）突变蛋白作用的分析，首先提出STAT3在体外的胚胎干细胞里， 维持着干细胞多功能性 （pluripotency）的论点。

感谢 Smith 的先走一步，谢兵的这部分工作和发现，只能保留在我的抽屉里了 。

在2001-2002年，在耶鲁实验室里两位足智多谋，干劲十足的博士后，高谦和Michael Wolfgang，开始建立卵母细胞 STAT3 的敲除系统。大约一年后，他们失望的发现，已获得的卵母细胞 STAT3敲除的小鼠，并没有表现出可见的异常。 他们渐渐失去了对此课题的兴趣。稍后继续他们有关STAT3和肥胖症的课题。

 在经历了一系列的挫折后，我在耶鲁的实验室几乎放弃了有关STAT3在胚胎发育里的作用的课题。

在我们搁置此项目的同时，从分子水平上分析具有多功能的胚胎干细胞的形成, 逐渐成为现代生物学的一个研究热点。

2003年，重要的Nanog基因被发现。 Oct4-Nanog Circuitry 是维持胚胎干细胞的关键因子。 在石破天惊的Yamanaka 2006年的 iPS cell 实验 ⁹，就是利用Oct4 在内的四个基因转录因子 （transcription factor）在体外将体细胞转化为类似胚胎干细胞的细胞。 他的实验， 使人进一步认识到，具有远见的 John Gurdon 四十多年前的发现的现代意义。John Gurdon利用核转移这一技术，将蛙的体细胞核移植到无核的卵子里¹⁰，促使向胚胎干细胞的转变，最终成功实现“克隆”动物。这两例实验用“非自然（artificial）”的方法取得了不可思议的成功，证明了分化细胞是可逆性的原理，这是现代生命科学认识和技术上的重大进步。

问题是，什么是“自然”的，真正在发育中的内在的关键机制？什么内在 （intrinsic）信号导致生成胚胎干细胞的？在JohnGurdon 实验里，起决定性作用的因子，四十年后仍是一个迷。可以推测，卵子的细胞质里，必有重要的 Gene Programming 因子，可以推动 “自然”的机制起功用，实现向多功能胚胎干细胞的转变，进而导致克隆的实现。同此，Yamanaka 的实验之所以成功， 也正是因 Oct4，Nanog circuitry 是“自然”的，内在作用于胚胎干细胞发育的关键因子。

因此，最关键的问题是揭示内在的分子机制。我们应该设计实验，发现在正常的胚胎干细胞发育中，必需什么分子信号和调节原理， 从而导致哺乳动物胚胎发育阶段的 Oct4-Nanog Circuitry 产生。但是，若要在 in vivo （活体）研究哺乳类早期胚胎发育的分子机理，由于细胞数量极少，分离困难， 技术难度很大，长期以来阻碍了精细的，分子机制上的研究。

思考着这些基本问题， 从2009年起，我重新鼓起了在新加坡进行胚胎发育和干细胞机制研究的梦想。

幸运地是，我在新加坡遇上了Barbara Knowles 和 Davor Solter 科学家夫妇， Huck Hui Ng和其他在胚胎发育和干细胞研究专家。Barbara Knowles 和 Davor Solter 低调实干，是在胚胎发育研究领域里作出了卓越贡献的科学家。 值得一提的是， Davor 被公认为 genome imprinting 的最早发现者之一。 当我的学生Vinh 表示要学习早期胚胎操作技巧，Davor手把手的亲自示范。并和我们共同开组会，帮助我们设计和解析实验结果。 我的实验室当时几乎没有任何有关胚胎干细胞研究的分子试剂。Huck打开他的冰箱，说：只要我有的，你尽可拿去。 我们先后从他的实验室获得近百种基因表达质粒，学会如何高效做iPScell的方法，等等，大大省略了我们准备实验的时间。 我们可爱的弹唱歌手，小郭同学，帮助我们进行微量细胞的分子表达分析。

可贵的科学朋友和同事的支持，历来是我们能够跨领域进行研究的关键。

我们的工作就是试图解答“在正常的胚胎干细胞发育中， 需要什么内在的，自然的，正常发育中的分子信号和调节机制，来引导胚胎干细胞的形成”。我相信, 只有切实了解胚胎发育中的分子过程，我们才能真正理解Yamanaka和 Gurdon实验里隐藏的分子机制。

在过去的数年里，Vinh 同学大约分析了成百上千的，不同阶段的小鼠胚胎。这些实验使用了五种不同的小鼠基因敲除（mouse knockout）的品系，最终用遗传学和分子生物学的方法，清晰的证明了STAT3决定性的调控 Oct4-Nanog Circuitry， 从而控制胚胎干细胞的生成。 有关论文已于最近发表 ¹。(see： http://genesdev.cshlp.org/content/27/12/1378?top=1）。

这次是值得庆幸的。我和朋友之间的通信里说到，这篇论文含有深深的“personal feeling”。

用个人的二十年的跨度来证明一个科学的假想，这不是很有意义和值得记忆的么？这不是体现了做科学的无比乐趣么？

如前所述，科学无止境。 我们当前新的迫切问题是：STAT 讯号是如何控制胚胎发育中的表观遗传的机理。 在新的实验里，不知幸运之神是否会再次降临。

不论如何，我是有信心的：这次绝不会再需20年 。

文献：

1   Do, D. V. et al. Agenetic and developmentalpathway from STAT3 to the OCT4-NANOG circuit is           essential for maintenance ofICM lineages in vivo. Genes &development27,1378-1390,doi:10.1101/gad.221176.113 (2013).

2   Darnell, J.E., Jr.,Kerr, I. M. & Stark, G. R. Jak-STAT pathways and transcriptional activationin response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science264,1415-1421 (1994).

3    Zhong, Z.,Wen, Z.& Darnell, J. E., Jr. Stat3: a STAT family member activated by tyrosine-phosphorylation in response to epidermal growth factor andinterleukin-6.Science264, 95-98 (1994).

4   Fu, X. Y.,Schindler,C., Improta, T., Aebersold, R. & Darnell, J. E., Jr. Theproteins of ISGF-3,the interferon alpha－induced transcriptional activator,define a gene familyinvolved in signal transduction. Proc Natl Acad Sci U S A89,7840-7843 (1992).

5   Velazquez, L.,Fellous,M., Stark, G. R. & Pellegrini, S. A protein tyrosine kinase intheinterferon α/β signaling pathway. Cell70, 313-322 (1992).

6   Fu, X. Y.Atranscription factor with SH2 and SH3 domains is directly activated byaninterferon alpha-induced cytoplasmic protein tyrosine kinase(s). Cell70,323-335 (1992).

7   O'Shea, J. J.,Gadina,M. & Schreiber, R. D. Cytokine signaling in 2002: new surprises intheJak/Stat pathway. Cell109, S121-131 (2002).

8   Takeda, K. et al.Targeted disruption of the mouseStat3 gene leads to early embryonic lethality.Proc Natl Acad Sci U S A94,3801-3804 (1997).

9   Takahashi, K.&Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic andadultfibroblast cultures by defined factors. Cell126,663-676,doi:10.1016/j.cell.2006.07.024 (2006).

10   Gurdon, J. B.&Uehlinger, V. "Fertile" intestine nuclei. Nature210, 1240-1241(1966).