初稿 | 王蕊 陈瑶瑶

校对 | 朱丽君 

小编注 |夏志蕊 王颖雯

排版 | 陈瑶瑶

编辑 | 孟美瑶

背景介绍 

线粒体作为代谢枢纽，为包括细胞核、内质网和脂滴在内的各种亚细胞区室提供ATP以及必需的代谢产物。与线粒体活性相关的一个主要例子是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。PEP拥有细胞中能量最高的磷酸酯键之一，其水解生成丙酮酸和无机磷酸的标准吉布斯自由能变(ΔGo’)约为-61.9 kJ·mol-1，远高于ATP水解生成ADP的-30.5 kJ·mol-1，从而使得PEP在多种代谢过程中成为多功能的能量供体（小编注：自由能是热力学中描述系统在恒温恒压条件下能量状态的重要参数。在电化学和催化反应中，通常使用吉布斯自由能（Gibbs Free Energy, G）来描述反应的热力学可行性。其计算公式为：△G=△H-T△S。其中△H（焓变）主要通过键能估算，即△H=∑（反应物键能）-∑（生成物键能）；△S（熵变）反映了前后体系的混乱度的变化，可通过分子复杂程度、气体分子数变化、相态变化或实验数据、理论模型进行估算。实际计算中，可通过量子化学计算软件（如Gaussian、ORCA等）或热力学数据库获取各物质的自由能数据。在PEP中，磷酸基团连在烯醇式结构的氧上。烯醇式（C=C-OH）本身是不稳定的、高能的异构体。在水解后，磷酸基团离开，烯醇式丙酮酸会几乎瞬间自发地异构化为酮式丙酮酸（CH₃-CO-COOH）。这个互变异构过程是高度放能的（ΔG≈-46 kJ/mol），这部分额外释放的自由能叠加在磷酸键断裂获取的自由能上上，使得总ΔG°’高达-61.9 kJ/mol。即PEP水解释放的自由能，大部分并非来自磷酸键本身，而是来自其烯醇式产物异构化为更稳定的酮式丙酮酸时释放的“结构张力”。ATP水解则没有这个额外的强力驱动步骤）。在糖酵解中，PEP通过丙酮酸激酶驱动ATP的产生；在糖异生过程中，PEP是肝脏中必不可少的底物；在甘油异生过程中，PEP转化为甘油-3-磷酸(G3P)，G3P是脂肪组织和肝脏中脂肪酸酯化成甘油酯(包括甘油三酯和磷脂)所必需的甘油骨架。此外，PEP还参与胰岛β细胞中ATP依赖的胰岛素分泌以及活化T细胞中Ca2+信号通路的调节。然而，这种高能分子如何产生、传递和满足细胞类型特异性需求，目前尚不清楚。

为了利用丙酮酸生成这种高能的PEP，细胞必须通过两步反应来克服能量障碍：第一步是丙酮酸羧化酶(PCX)将丙酮酸转化为草酰乙酸(OAA)的ATP消耗反应，第二步是磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)将OAA转化为PEP的鸟苷三磷酸(GTP)消耗反应。值得注意的是，PEP可以由OAA在细胞质中通过PEPCK(C-PEPCK或PCK1)合成，也可以由PCK2(又称M-PEPCK)在线粒体中合成。根据过往报道，PCK1在糖异生的研究中备受关注，因为(1)PCK1在啮齿类动物的肝脏中比PCK2更丰富(注:人类PCK2约占50%)；(2)PCK1的表达和活性受到营养和激素线索的动态调节，包括禁食。(3)肝脏PCK1过表达引起高血糖；(4)虽然肝脏特异性PCK1敲除(KO)小鼠由于代偿性肾脏糖异生而维持了正常血糖，但是抑制PCK1可减弱乳酸/丙酮酸诱导的肝脏糖异生（小编注：肾脏可以利用乳酸/丙酮酸进行糖异生，但效率远低于肝脏，并且在PCK1被抑制的情况下，这种代偿能力不足以完全替代肝脏的功能。在肝脏中，PCK1是这条途径的限速酶之一，肾脏虽然也有PCK1，但其总量和最大催化速率（Vmax）远低于肝脏。当肝脏PCK1被敲除后，肾脏的PCK1虽然可能轻微上调，但仍不足以处理大量乳酸/丙酮酸堆积）。因此，可合理认为PEP主要在细胞质中产生。

然而，从生物能量学的角度来看，考虑到线粒体GTP的可用性以及需要较少的酶促步骤和代谢物运输（小编注：线粒体基质通过三羧酸循环（TCA 循环）中的琥珀酰CoA合成酶反应原位产生GTP，可以直接为PCK2供能；而胞质中GTP主要用于翻译、信号通路，不专门为糖异生富集，因此可利用性更低。胞质PEP途径需要经历天冬氨酸穿梭，即比线粒体途径多出了OAA与天冬氨酸的相互转换以及额外跨膜运输，因此效率更低），在线粒体中合成PEP似乎比细胞质途径更加高效。此外，线粒体中还含有大量浓度为10μM或更高的PEP。值得注意的是，当研究人员在分离的白色脂肪细胞线粒体中进行¹³C₃标记的丙酮酸示踪实验时，相对于M+1或M+2 PEP，M+3 PEP才是主要存在形式(图1B) (小编注：M+3 PEP比值高意味着丙酮酸到OAA再到PEP的过程中保留完整碳骨架，并未进入TCA循环。M+1/M+2比值高意味着丙酮酸先进入了TCA循环，碳骨架被打散稀释后再生成PEP) 。此外，棕色脂肪细胞线粒体产生的M+3 PEP水平显著高于M+1或M+2 PEP(图1C)。此外，白色脂肪前体细胞线粒体主要由¹³C₃标记的丙酮酸生成M+3 PEP(图S1A)。棕色脂肪细胞的线粒体中氧化三羧酸(TCA)循环较为活跃，但在白色脂肪细胞和前脂肪细胞中活性较低(图S1、图S10B-D)。这些结果表明，无论脂肪细胞线粒体的氧化TCA循环活性如何，从丙酮酸→OAA→PEP的转化——即丙酮酸-PEP的旁路（小编注：这里的旁路主要指丙酮酸-PEP途径不经过TCA循环的主路线，而是以分支的形式直接把丙酮酸转为PEP，目前已知的PEP合成途径包括：在细胞质糖酵解中，2-磷酸甘油酸通过烯醇化酶脱水生成PEP；在糖异生中，OAA在PCK2作用下消耗GTP生成PEP），是脂肪细胞线粒体中PEP合成的主要途径。相反，来自C2C12成肌细胞和HEK293T细胞的线粒体通过TCA循环中的¹³C-丙酮酸氧化生成M+1或M+2 PEP，其水平高于M+3 PEP(图S1、图S10E、F)，表明线粒体以细胞类型选择性的方式再生PEP。

这些发现提出了一个关键的问题：线粒体生成的PEP是如何被转运到细胞质中的?由于线粒体内膜(IMM)对代谢产物不具有通透性，PEP从线粒体基质向细胞质的输出需要特定的线粒体载体蛋白。该研究是发表于Cell的文章“Mitochondrial control of glycerolipid synthesis by a PEP shuttle”，该研究鉴定了一种介导PEP跨IMM转运的线粒体载体SLC25A35，发现它在利用丙酮酸盐-PEP通路的脂肪生成细胞中调控线粒体PEP的外排以及甘油异生过程，且以pH梯度依赖的方式转运PEP，提示线粒体调控脂肪生成过程可作为肝脂肪变性和2型糖尿病发病机制中限制甘油酯合成的关键靶点。

拓展阅读:连接糖代谢与脂代谢的关键高能分子PEP

糖酵解过程中，2-磷酸甘油酸在烯醇化酶的催化下发生脱水反应，生成高能代谢中间产物PEP，PEP分子中所携带的高能磷酸键在丙酮酸激酶的催化作用下发生转移，将ADP磷酸化生成ATP，而PEP自身则转化为丙酮酸，完成糖酵解途径中关键的底物水平磷酸化反应，为细胞提供快速可利用的能量。

糖异生途径以丙酮酸等非糖物质为起始底物，丙酮酸进入线粒体后，在丙酮酸羧化酶的催化下生成草酰乙酸，草酰乙酸在线粒体内磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）的作用下直接生成PEP，PEP跨越线粒体内膜进入细胞质后，沿逆糖酵解途径逐步完成多步酶促反应，最终合成葡萄糖，从而在空腹或饥饿状态下维持机体血糖稳态。甘油异生过程主要发生于脂肪细胞与肝细胞中，丙酮酸在线粒体内经线粒体型PCK2催化生成PEP，线粒体内生成的PEP依赖线粒体内膜特异性转运蛋白SLC25A35完成跨膜转运至细胞质，胞质中的PEP进一步代谢转化为甘油醛-3-磷酸与二羟丙酮磷酸，二者经还原反应生成甘油-3-磷酸（G3P），G3P作为甘油骨架与游离脂肪酸发生酯化反应，最终生成甘油三酯、磷脂等甘油酯类物质，调控脂质合成与脂滴储存，参与脂肪肝、肥胖及胰岛素抵抗等代谢过程的调控。

参考文献：

[1] Abudukadier A , et al. Cell Metabolism,2020,32(5):751-766.e11.

[2] L. S L, et al. Cell Metabolism,2020,32(5):736-750.e5.

[3] Grasmann G, et al. BBA - Reviews on Cancer,2019,1872(1):24-36.

拓展阅读:PEP调控胰岛素分泌与T细胞Ca2+信号的机制

PEP除了作为糖异生、甘油脂质合成的关键中间体外，还以代谢信号分子的身份精准调控胰岛β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌与活化T细胞的钙离子信号通路，将细胞能量代谢与核心生理功能紧密耦联。在胰岛β细胞中，葡萄糖摄取后经糖酵解生成丙酮酸，丙酮酸进入线粒体由丙酮酸羧化酶催化为草酰乙酸，再经线粒体PEPCK（PCK2）利用线粒体GTP高效生成PEP，这一过程独立于胞质PCK1主导的糖异生，是β细胞内PEP的重要来源，生成的PEP经SLC25A35转运至胞质后，在丙酮酸激酶作用下将高能磷酸基团转移给ADP生成ATP，该过程产生的ATP并非单纯供能，而是在细胞膜下形成局部高ATP/ADP比值的微环境，直接作用于由Kir6.2与SUR1组成的KATP通道使其关闭，触发细胞膜去极化，进而激活电压门控钙离子通道引发胞外钙离子内流，钙离子作为第二信使启动胰岛素囊泡的胞吐释放，构成葡萄糖依赖的胰岛素分泌核心开关，同时PEP循环还能通过调控胞质ADP水平微调KATP通道活性，保障胰岛素分泌的节律性与敏感性。

在T细胞受体激活后的活化T细胞中，PEP通过直接靶向内质网膜上的肌浆网-内质网钙离子ATP酶（SERCA）发挥调控作用，SERCA负责将胞质钙离子主动泵回内质网以维持胞质低钙稳态，PEP可特异性抑制SERCA的转运活性，减少内质网对钙离子的重摄取，协同TCR信号激活后PLCγ水解PIP2生成的IP3所介导的内质网钙释放，共同提升胞质游离钙离子浓度，升高的钙离子结合钙调蛋白后激活钙调磷酸酶，催化转录因子NFAT去磷酸化并转位入核，启动IL-2等效应因子的转录表达，这一机制让T细胞能根据胞内糖酵解强度与PEP水平感知营养状态，实现代谢状态与免疫活化强度的动态匹配，无论是β细胞中PEP介导的代谢-电信号-分泌耦联，还是T细胞中PEP对钙信号的代谢性微调，都体现了PEP作为高能代谢中间物兼信号分子的双重身份，也揭示了线粒体代谢物输出与细胞功能调控的高度整合性。

1.脂肪细胞线粒体PEP主要经丙酮酸→OAA→PEP旁路合成，依赖PCK2而非胞质PCK1；

2.线粒体内膜载体SLC25A35是PEP外排关键，缺失导致PEP在线粒体积累；

3.SLC25A35依赖pH梯度特异性转运PEP，保守残基Y124/R175/R276调控转运功能；

4.SLC25A35介导PEP转运支撑脂肪组织糖异生，为甘油酯合成提供G3P；

5.肝脏SLC25A35与MASLD相关，特异性敲除可改善肝脏脂肪变性与胰岛素抵抗。

 研究结果  

1.与PEP合成相关的线粒体载体蛋白

胞质PCK1是目前公认的主要PEPCK；然而，先前的研究报道，大鼠肝脏中PCK2的缺失减少了乳酸、丙酮酸和氨基酸的糖异生。(小编注：PCK2定位于线粒体内膜内侧 /基质，直接在线粒体基质生成PEP，无需OAA转运出线粒体，减少跨膜运输与胞质再加工，是糖异生的“线粒体捷径”)此外，PCK2在胰岛中高表达，其中由PCK2利用线粒体GTP生成的PEP对总PEP池有显著贡献，并控制葡萄糖刺激的胰岛素分泌。有趣的是，在腹股沟白色脂肪组织(WAT)来源的脂肪细胞中，PCK2是主要的PEPCK，而PCK1的表达量很低(图1D和S2A)，同样，棕色脂肪细胞中Pck2转录本的表达高于Pck1。接下来，研究人员通过CRISPR-Cas9系统敲除Pck1或Pck2，并检测其在脂肪生成中的功能(图S2B)。为了评估脂肪细胞中甘油酯的合成，研究人员使用1-¹⁴C丙酮酸作为示踪剂，该示踪剂可绕过葡萄糖通过糖酵解直接标记甘油醛3-磷酸(GA3P)和G3P（小编注：1-14C丙酮酸（标记的C1是羧基碳）在线粒体或细胞质中，被丙酮酸羧化酶（PC）催化，固定一个CO2，生成草酰乙酸（OAA）。在该步骤中，原始的14C标记从丙酮酸的羧基转移到了OAA的末端羧基上，而OAA又反应生成PEP，将末端羧基上带标记的14C转移到了PEP的C3上，随后的PEP则通过一系列的糖酵解反应生成GA3P和G3P，使它们的C1带上同位素标记）。此外，在第一个碳上进行标记可以确保¹⁴C在丙酮酸脱羧过程中以CO₂的形式释放，从而最大限度地减少¹⁴C进入线粒体乙酰辅酶A(CoA)和下游脂肪酸合成的结合(图S2C)。为了验证这一假设，研究人员从1-¹⁴C丙酮酸孵育的脂肪细胞中提取总脂质并皂化脂质，随后通过薄层色谱(TLC)对脂肪酸部分中的¹⁴C进行定量(小编注：皂化反应的本质是碱性水解反应，甘油三酯会被彻底水解成甘油和脂肪酸盐，从而利用它们在不同pH值和有机溶剂中溶解性的差异，通过液-液萃取将二者实现分离，因此可分别测定14C在脂肪酸与甘油骨架中的掺入量)。结果显示，脂肪酸部分中的¹⁴C信号与背景水平无法区分，表明未检测到¹⁴C掺入甘油酯的脂肪酰基部分中(图S2D)。因此，本实验主要测量了¹⁴C在甘油脂质骨架中的掺入。胰岛素可促进1-¹⁴C掺入脂肪细胞脂质部分，研究人员发现，与对照组相比，缺失Pck2的脂肪细胞在两种不同的gRNA诱导下，其甘油脂合成显著降低(图1E)。与此一致的是，在缺乏Pck2的脂肪细胞中，¹⁴C标记的葡萄糖掺入脂质部分的量显著减少，从而反映了PCK2对脂肪生成的贡献，但是这种方法并不能区分示踪剂是掺入甘油骨架还是掺入甘油脂质的脂肪酰基部分(图S2E)。另一方面，sgPck1处理的脂肪细胞仍具有从¹⁴C标记葡萄糖合成脂质的能力。这些结果表明，通过PCK2产生的线粒体PEP有助于脂肪细胞中甘油酯的合成。该结果也提示在这些细胞中存在一个尚未鉴定的介导PEP输出的线粒体载体。

为了鉴定这种线粒体载体，研究人员进行了以下分析：首先，由于与其他细胞类型相比，棕色和白色脂肪细胞主要产生M+3 PEP，因此研究人员在棕色和白色脂肪细胞中寻找了编码线粒体载体蛋白的富集基因。结果显示该分析鉴定到多个线粒体载体蛋白，包括线粒体柠檬酸转运体(Slc25a1)、解偶联蛋白3(Slc25a9，又称UCP3)、硫胺素载体(Slc25a19)和Slc25a35(图1F)。其次，研究人员寻找了与乙酰辅酶A羧化酶α(Acaca)和脂肪酸合成酶(Fasn)这两个控制脂肪生成的代表性基因呈正相关的基因，并分析鉴定了多个线粒体载体蛋白，包括Slc25a1、鸟氨酸载体(Slc25a15)、Slc25a19、肉碱/酰基肉碱载体(Slc25a20)、Slc25a35和NAD载体(Slc25a51)(图1G)。随后，研究人员在大鼠脂肪组织中寻找由脂肪生成刺激因子(特别是过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPARγ)的合成激动剂，如曲格列酮、罗格列酮、吡格列酮和AG035029)所诱导的基因(图S2F)。这些分析确定了符合上述3个标准的SLC25A1和SLC25A35(图1H)。虽然已知SLC25A1可以输出柠檬酸，但SLC25A35目前是一个孤儿载体，在脂肪组织的脂肪细胞群中大量表达(图S2G)。在单细胞水平上，Slc25a35在所有脂肪细胞群中与Acaca和Fasn共表达，并且在具有高脂肪生成能力的群体(mAd5)中富集(图S2H)。这些观察促使研究人员进一步研究SLC25A35的功能。

虽然SLC25家族的许多成员定位于IMM，但SLC25A17定位于过氧化物酶体，而SLC25A46、SLC25A49和SLC25A50定位于线粒体外膜(OMM)。因此，研究人员接下来检测了SLC25A35在前体脂肪细胞中的亚细胞定位。首先，研究人员在前体脂肪细胞中过表达了在C端带有FLAG标签的SLC25A35，通过高分辨显微镜观察发现，SLC25A35蛋白在线粒体中选择性表达，但信号与OMM标志物TOMM20没有重叠(图1I)。相反，当用蛋白酶K处理降解TOMM20后，SLC25A35显示定位在IMM中，且SLC25A35和同样定位于IMM的蛋白ATP5A保持完整(图1J)。此外，研究人员在分化的脂肪细胞中验证了SLC25A35蛋白的线粒体定位(图S2I和S2J)。

图1.与线粒体PEP合成相关的载体蛋白鉴定

图S1.脂肪细胞中线粒体丙酮酸示踪研究

图S2.与线粒体PEP合成相关的线粒体载体蛋白

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 2.SLC25A35是线粒体PEP外排所必需的

为了研究SLC25A35的生物学作用，研究人员通过Easi-CRISPR(高效添加单链DNA[ssDNA]插入片段的CRISPR)系统构建了SLC25A35缺失的腹股沟WAT来源的前脂肪细胞(Slc25a35 KO)和对照细胞(图2A)。然后，研究人员使用Mito-Tag从这些细胞中快速分离线粒体，并通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析其代谢产物(图2B和S3A) (小编注：Mito-Tag 是一段由线粒体靶向信号序列(MTS，通常15–30个氨基酸)构成的短肽标签，用于将目标蛋白/分子特异性锚定到细胞线粒体内(基质/内膜/外膜)，实现线粒体定位的精准操控与示踪，是细胞与分子生物学中最常用的线粒体靶向工具。研究人员把MTS序列与目标蛋白的基因融合，并构建到质粒载体中。把质粒转染进脂肪前体细胞，细胞会转录翻译出带MTS的融合蛋白。新生肽链上的MTS（线粒体靶向信号）会被细胞质里的识别蛋白抓住，引导整个蛋白穿过线粒体膜，进入线粒体基质。进入线粒体后，MTS通常会被线粒体蛋白酶切掉，剩下的标签蛋白就稳定锚定在线粒体内）。研究人员发现，与对照细胞来源的线粒体相比，Slc25a35 KO细胞来源的线粒体含有更高水平的代谢物，包括PEP，NAD⁺(小编注：NAD+中的“+”指的是烟酰胺环上的氮原子带一个形式正电荷，这是它作为氧化还原辅酶的核心，意指其能从底物上接受一个电子（变成NADH）。实际上它的分子组成是由两个核苷酸（烟酰胺核苷酸和腺嘌呤核苷酸）通过焦磷酸连接而成。每个磷酸基团在生理pH（~7.2）下都会电离，带一个负电荷。所以NAD+的分子结构是：一个带正电的烟酰胺环+两个带负电的磷酸基团，整体带一个净负电荷）和1,3-二磷酸甘油酸(BPG)(图2C;表S1)。相比之下，研究人员在全细胞水平上没有观察到这些代谢物的实质性变化，而与对照细胞相比，Slc25a35 KO细胞中TCA中间体和α-酮异戊酸(KIV)的水平略有升高(图2D;表S2)。当用全细胞代谢物来对线粒体代谢物进行标准化，以计算线粒体富集情况时，研究人员发现相对于对照细胞，PEP是Slc25a35 KO细胞线粒体中富集程度最高的代谢物(9.4倍)，但是两组间ATP和GTP水平无变化(图2E;表S3)。此外，在分化的脂肪细胞中，PEP是Slc25a35 KO线粒体所检测到的唯一显著富集代谢物(图S3B-S3D)。这些结果表明，Slc25a35 KO线粒体中PEP水平的升高反映了PEP在线粒体中的积累，而不是PEP总量的增加，而其他代谢物的变化则是由于全细胞水平的变化。

接下来，研究人员对从对照和Slc25a35 KO细胞分离的线粒体进行13C示踪实验，用13C3-丙酮酸孵育线粒体5min，快速洗涤2次，并通过LC-MS分析标记的代谢物(图2F)。研究人员发现Slc25a35 KO细胞线粒体中M+3 PEP水平显著高于对照细胞，而M+2 PEP水平与对照细胞无差异，而M+1型PEP略有升高(图2G)，且M+3型PEP在白色前体脂肪细胞来源的线粒体中占主导地位。另外，M+3 PEP在Slc25a35 KO细胞线粒体中的积累呈时间依赖性(图S3E)。这些结果表明，线粒体中积累的PEP在很大程度上来源于PCX和PCK2作用下的M+3 OAA，而不是TCA循环中丙酮酸氧化产生的OAA。为了进一步支持这一观点，研究人员发现TCA循环中的丙酮酸氧化在Slc25a35 KO细胞中基本没有变化，因为13C标记琥珀酸和柠檬酸水平在整个细胞中没有差异(图S3F和S3G)。在分离的线粒体中也观察到类似的结果，尽管的M+3柠檬酸水平略有降低，但总氧化TCA循环活性在对照组和Slc25a35 KO细胞之间基本保持不变(图S3H-S3K)。此外，研究人员发现两组之间丙酮酸脱氢酶(PDH)磷酸化、PDH和PCX蛋白表达没有差异(图S3L)。这些结果表明，SLC25A35缺失导致线粒体积累OAA衍生的PEP是由于PEP外排减少，而不是氧化TCA循环活性降低或PCX和PDH的蛋白表达变化。

为了检验这种可能性，研究人员接下来开发了一个直接测量线粒体PEP输出的实验系统(图2H)。该系统将从前体脂肪细胞分离的线粒体放置于含有苹果酸、琥珀酸和谷氨酰胺的培养基中，同时与13C-丙酮酸孵育进而激活线粒体。随后，研究人员在孵育15，30，60和120分钟后收集孵育培养基，在培养基中检测到M+3 PEP。研究人员发现，分离的线粒体以时间依赖的方式分泌13C标记PEP。然而，在Slc25a35 KO线粒体中，线粒体PEP的输出显著减少(图2I)。这些数据表明，PEP从线粒体的主动输出需要SLC25A35。(小编注：SLC25A35属于线粒体溶质载体家族(SLC25)，定位于线粒体内膜，核心功能是将线粒体基质中PCK2生成的PEP，以质子梯度/膜电位依赖方式转运到胞质，为甘油-3-磷酸合成、甘油脂(甘油三酯)合成提供前体，是脂肪生成与脂肪肝的关键调控靶点)

图2.SLC25A35是线粒体PEP输出所必需的

图S3.SLC25A35缺失导致PEP的线粒体积累3

3.SLC25A35对PEP转运的重构

为了重建SLC25A35对PEP的转运，研究人员利用纯化的SLC25A35蛋白建立了无细胞脂质体系统(图3A)，将表达鼠源SLC25A35-TwinStrep质粒或空载体(对照)的杆状病毒感染的Sf9细胞进行亲和纯化(图3B)，随后将纯化的SLC25A35蛋白或空载体对照洗脱液插入脂质体中。为了避免脂质体膜的非特异性结合，研究人员排除了不含蛋白质的空脂质体的背景信号。在装载未标记PEP的SLC25A35脂质体中，研究人员观察到¹³C标记PEP的转运显著高于对照脂质体(图3C)（小编注：通过离心、过滤或快速分离等方法，把脂质体和外部溶液分开。然后破坏脂质体膜，释放内部内容物，用LCMS检测里面¹³C-PEP含量）。为了确定转运特异性，研究人员接下来测试了过量未标记的PEP作为竞争者时的¹³C-PEP转运情况，并发现¹³C-PEP进入SLC25A35脂质体的转运被完全阻断，验证了SLC25A35对PEP的底物特异性。并且，在脂质体内外不同PEP浓度下，这种PEP转运均被观察到(图3D)。此外，用蛋白酶K部分消化蛋白脂质体显著降低了PEP的转运活性(图S4A)。

为了进一步确定底物特异性，研究人员接下来在未标记的OAA、苹果酸、琥珀酸和延胡索酸作为竞争剂的情况下，测定了SLC25A35脂质体中¹³C-PEP的转运情况(图3E)。虽然在含有SLC25A35的蛋白脂质体中持续观察到¹³C-PEP的转运，但在OAA、苹果酸和琥珀酸存在的情况下，¹³C-PEP的转运受到适度但显著的抑制(图3F)。另一方面，过量的延胡索酸并未阻断SLC25A35脂质体中¹³C-PEP的转运(图3G)。这些结果表明PEP是SLC25A35的高亲和底物，而其他TCA循环中间产物，如OAA、苹果酸和琥珀酸，尽管其亲和力较低但仍可以通过SLC25A35运输。在酿酒酵母中的一例研究报道了线粒体OAA载体(Oac1p)转运来源于KIV的α-异丙基苹果酸(α-IPM) （小编注：KIV为α-酮异戊酸，是缬氨酸（Val）分解代谢产生的α-酮酸。KIC为α-酮异己酸，是亮氨酸（Leu）分解代谢产生的α-酮酸，两者都属于支链α-酮酸，结构非常相似，只差一个-CH₂-），并且人源SLC25A35的异位表达部分恢复了Oac1p缺失酵母的生长缺陷。研究人员通过代谢组学研究也发现KIV在Slc25a35 KO线粒体中的富集减少，表明KIV和α-酮异己酸(KIC)可能是SLC25A35的底物。研究人员随后进行了基于脂质体的底物竞争实验，结果表明在含有SLC25A35的脂质体中，过量未标记的KIV或KIC与¹³C-PEP的摄取不存在竞争(图3G和3H)。当使用13C标记KIV和KIC作为示踪剂时，研究人员没有观察到SLC25A35脂质体中的主动转运(图S4B)。这些结果表明，KIV在Slc25a35 KO线粒体中的富集减少不是由于其线粒体的输入量减少造成的。

PEP在生理条件下带净负电荷，提示线粒体PEP转运与跨膜质子梯度耦合(即线粒体膜电位)之间的可能性。为了验证这一点，研究人员在pH 3.0到8.0的条件下制备了蛋白脂质体，以确定PEP转运依赖于pH梯度的程度(图3I)。结果发现在较低的pH条件下，PEP在SLC25A35脂质体中的转运能力与对照组相比显著增强(图3J)。这些数据表明，当线粒体膜电位较高时，可以促进线粒体PEP的转运。

图3.SLC25A35对PEP转运的重构

图S4.SLC25A35的底物特异性

44.SLC25A35介导的PEP转运的结构研究

接下来，研究人员应用计算模拟进一步评估SLC25A35作为底物转运PEP的能力。目前还没有关于SLC25A35的三维(3D)蛋白结构的报道，其与其他模板结构(经BLASTp检索,同源性<30%)的序列相似性较低，因此同源建模的可靠性较低。因此，研究人员利用人SLC25A35(AF-Q3KQZ1-F1model_v4)的AlphaFold结构来评估PEP作为其底物的可能性。该结构整体显示出高置信度的预测分数(图S5A)，并且呈现出类似于溶质载体常见的形态特征，如垂直于IMM的6个跨膜α螺旋形成的通道状中央空腔(图4A、S5B、S5C)。此外，这个腔的内壁由极性和碱性氨基酸残基构成，包括Y72,Q73,N77,R80,Y124,K127,R175和R276，在小鼠SLC25A35中这些氨基酸残基都是保守的(图4B)。

接下来，研究人员进行了诱导拟合对接，以使PEP和SLC25A35之间产生了稳定且低能量的相互作用，其中PEP采取了一种能够被SLC25A35中心空腔容纳的构象(图4C和S6A)。在此状态下，PEP的磷酸氧基团与SLC25A35的Q73和R276残基之间形成氢键和/或盐桥，PEP的羧酸基团与SLC25A35的的R175、Y124和Y72残基之间存在氢键作用(图4D和S6B)。随后，研究人员通过对SLC25A35在线粒体内膜朝向的考虑，在PEP存在和不存在的情况下分别进行了分子动力学(MD)研究。这使研究人员推断出PEP与SLC25A35能够形成稳定且可重复的复合物。SLC25A35-PEP相互作用的平均均方根偏差值(RMSD)为1.73A°，低于相应无配体模拟中观察到的2.10 A°(图S6C)。重要的是，估算得到的PEP -SLC25A35相互作用的平均ΔG结合亲和力(MMGBSA)为26.58 ± 10.53 kcal/mol(图4E)，且在整个模拟轨迹中关键的相互作用得以保持，尤其是与R276和R175形成的氢键(图4F、图S6D和图S6E)。

图4.SLC25A35介导的PEP转运的结构研究

图S5.AlphaFold预测SLC25A35的结构

图S6.分子动力学模拟SLC25A35与PEP之间的相互作用

5.PEP通过SLC25A35的转运是脂肪组织中糖异生所必需的

在脂肪细胞的胞浆区，PEP可转化为GA3P和磷酸二羟丙酮(DHAP)，随后转化为G3P。G3P是脂肪组织和肝脏中脂肪酸酯化成甘油脂所必需的甘油骨架，包括甘油三酯、甘油二酯和磷脂(图5A)。由丙酮酸合成G3P的过程被称为糖异生，有助于脂肪组织和肝脏中的TG库的形成。因此，研究人员探究了线粒体来源的、由SLC25A35转运的PEP在多大程度上参与脂肪细胞中GA3P和DHAP的合成。为此，研究人员在缺乏Slc25a35的腹股沟WAT来源的脂肪细胞中进行了¹³C₃-丙酮酸示踪实验。示踪实验发现，Slc25a35 KO细胞中¹³C标记的GA3P/DHAP水平显著低于对照细胞77.2%(图5B)。值得注意的是，GA3P和DHAP是分子量相同的同分异构体，研究人员的LC-MS平台无法对两者进行区分。因此，所测得的信号代表这些样品中GA3P和DHAP的组合丰度。重要的是，SLC25A35的缺失导致腹股沟WAT来源的分化脂肪细胞和前脂肪细胞中的G3P水平显著降低，尽管在前脂肪细胞中基础水平较低(图5C)。

为了检测SLC25A35是否是脂肪细胞中TG合成所必需的，研究人员检测了1-¹⁴C丙酮酸掺入到脂质中的情况。如前所述，在Slc25a35 KO脂肪细胞中的1-¹⁴C 丙酮酸示踪研究发现，在甘油酯的脂肪酸组分中没有检测到¹⁴C信号(图S7A)。另一方面，Slc25a35 KO脂肪细胞中¹⁴C丙酮酸掺入脂质的水平显著低于对照脂肪细胞，在无胰岛素刺激时降低了27.9%，在胰岛素刺激后降低了57.1%(图5D)。与使用¹⁴C葡萄糖作为示踪剂观察到的结果一致(图S7B)。重要的是，Slc25a35 KO脂肪细胞的总TG含量显著低于对照脂肪细胞31.2%(图5E)。细胞内PEP总水平是否是TG合成的限速步骤，或者线粒体来源的PEP是其关键因素。如果是前者，那么过表达PCK1可以恢复Slc25a35 KO脂肪细胞中的TG水平。然而，研究人员发现PCK1过表达不足以恢复Slc25a35 KO细胞中的细胞TG水平(图S7C)。随后，研究人员通过在缺乏Slc25a35和Pck2的细胞中进行¹³C₃-丙酮酸示踪试验，探究SLC25A35和PCK2是在同一通路中还是独立地作用于糖异生。结果一致表明，Slc25a35 KO细胞中¹³C标记的GA3P/DHAP量显著低于对照细胞。同样，单独敲除Pck2也降低了¹³C标记的GA3P/DHAP水平(图S7D)。然而，在Slc25a35 KO细胞中敲除Pck2并不能进一步减弱GA3P/DHAP的生成(图5F)。这些结果表明，Slc25a35 KO细胞中减少的糖异生依赖于PCK2催化在线粒体合成的PEP，而不是细胞内总的PEP库。

由于WAT中表达低水平的甘油激酶，负责催化甘油生成G3P，因此，通过糖异生途径合成G3P被认为是脂肪组织中脂肪酸酯化的主要途径。然而，相对于细胞质来源的PEP，线粒体来源的PEP对TG库的贡献仍不清楚。在这方面，SLC25A35作为线粒体PEP转运蛋白的鉴定，使研究人员能够在体内严谨地解答这一问题。因此，研究人员构建了Slc25a35^flox/flox小鼠,并将其与Adipoq-Cre杂交，获得脂肪特异性KO小鼠(adiponectin-Cre×Slc25a35^flox/flox,称Slc25a35^Adipo KO小鼠)(图S7E)。为了最大程度减少骨骼肌和棕色脂肪组织(BAT)的适应性产热的干扰，将Slc25a35^Adipo KO小鼠和同窝对照小鼠(Slc25a35^flox/flox)置于热中性条件(30℃)下，并饲喂60%高脂饲料(HFD) (图5G)。两种基因型小鼠的出生体重没有差异；然而，在18周龄及以后，雄性Slc25a35^Adipo KO小鼠体重增加缓慢，但显著低于对照组(图5H)。体重的差异主要来源于腹股沟WAT、附睾WAT以及肩胛间BAT的组织质量的降低，而肝脏或其他组织中的质量无差异(图5I)。组织学分析一致显示，Slc25a35^Adipo KO小鼠肩胛间BAT中脂肪细胞尺寸显著小于对照小鼠(图5J)。值得注意的是，小鼠在30℃条件下饲养23周，因此肩胛间BAT由单房脂肪细胞组成。因为先前的研究有报道大鼠的BAT中存在活跃的糖异生过程，并且其高表达PCK2。同样，Slc25a35^Adipo KO小鼠腹股沟WAT中脂肪细胞尺寸也显著小于对照小鼠(图S7F)。研究人员还发现，在30℃并饲喂高脂饲料条件下，雌性Slc25a35^Adipo KO小鼠表现出与雄性小鼠一致的代谢表型(图S7G-S7J)。当小鼠在室温下饲喂普通饲料时，体重无差异(图S7K和S7L)。值得注意的是，丙酮酸-PEP循环被认为是一条无效产热途径。然而，研究人员的数据表明，脂肪组织中的SLC25A35对于产热的激活并不是必需的，因为在30℃下给予β3-肾上腺素受体激动剂CL316243后，Slc25a35^Adipo KO小鼠能将其全身能量消耗提高到与同窝对照小鼠相当的水平(图S8A)。此外，两组小鼠在全身能量消耗、摄食量和运动能力方面无显著差异(图S8B-S8D)。另外，研究人员发现两种基因型小鼠在脂肪组织分解脂肪和葡萄糖氧化方面没有差异(图S8E-S8G)。

图5.PEP通过SLC25A35的转运是脂肪组织中糖异生所必需的

图S7.SLC25A35是脂肪组织中糖异生所必需的

拓展阅读:酸烯醇式丙酮酸（PEP）的转化

^{PEP通过糖异生的几个步骤生成生成甘油三酯的骨架甘油-3-磷酸（G3P）。PEP首先沿糖异生逆反应依次生成2-磷酸甘油酸→3-磷酸甘油酸→1,3-二磷酸甘油酸，最终裂解为3-磷酸甘油醛（GA3P）。GA3P在磷酸丙糖异构酶（TPI）催化作用下，快速、可逆地转变为GA3P的同分异构体磷酸二羟丙酮（DHAP），GA3P和DHAP在胞浆中保持动态平衡。这一步也是连接糖代谢与脂质合成的关键分支点：若继续糖异生过程，GA3P与DHAP可缩合为果糖-1,6-二磷酸并生成葡萄糖；但DHAP又作为合成G3P的直接前体，能够在甘油-3-磷酸脱氢酶的催化作用下，以NADH+H⁺作为还原剂，将DHAP的酮基（C=O）还原为羟基（-CHOH），生成G3P。}

甘油生成与转化

GA3P与DHAP互相转化

G3P与DHAP之间转化

^{参考文献：}

^{[1] 王镜岩,朱圣庚,徐长法.生物化学(下册).北京:高等教育出版社,2002:63-89.}

^{[2] Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. Principles of Biochemistry, 7th Ed. New York: Worth Publishers Inc. 2017.}

6. 脂肪组织中的甘油酯合成存在显著差异

为了测定脂肪组织中14C标记的葡萄糖掺入到甘油脂的甘油骨架中的情况，研究人员对从脂肪组织中提取的脂质进行皂化处理，然后用过碘酸-希夫染色结合薄层层析法(PAS-TLC)进行分析(小编注：过碘酸-希夫染色(PAS 染色)，全称过碘酸-希夫染色(Periodic Acid-Schiff Stain, PAS)，是组织学和病理学最常用的染色方法之一，专门用来显示细胞和组织里的糖、糖原、粘蛋白、基底膜等含糖成分。文章中用¹⁴C-葡萄糖进行示踪，脂肪组织中¹⁴C标记的葡萄糖通过糖酵解途径转化为甘油-3-磷酸，甘油-3-磷酸即为合成甘油三酯和甘油酯类的直接甘油骨架来源。PAS染色是通过识别特定化学键进行化学染色的，而通过皂化使得脂质中的甘油骨架游离出来，而甘油骨架中含有能够被PAS染色识别的邻二醇结构（-CHOH-CHOH-），使其能被过碘酸氧化生成醛，再与希夫试剂反应显色)。研究人员发现，无论有无胰岛素的刺激，Slc25a35Adipo  KO小鼠腹股沟WAT中14C-葡萄糖掺入到甘油酯甘油骨架的水平均显著低于对照组小鼠(图5K)。同样，Slc25a35Adipo KO小鼠附睾WAT中14C掺入到脂质甘油骨架中的水平也低于对照组小鼠(图5L)。由于14C标记的葡萄糖可以掺入到甘油酯的脂肪酰基部分，因此研究人员对从WAT中提取的皂化脂质进行了TLC分析。与SLC25A35在糖异生中具有功能需求相反，研究人员发现14C掺入脂肪酸组分水平在两种基因型小鼠之间没有显著差异(图S8H和S8I)（小编注：SLC25A35转运线粒体PEP到细胞质并增强糖异生的功能，而检测14C标记的脂肪酸组分水平是为了说明SLC25A35在脂肪酸合成过程中不发挥作用。细胞内葡糖糖分解转化产生丙酮酸，丙酮酸进入线粒体生成乙酰CoA，而脂肪酸合成的场所在细胞质，需要相应的转运系统将线粒体乙酰CoA转运到细胞中，通过该实验验证SLC25A35在乙酰CoA的转运过程中不发挥作用，也不影响脂肪酸的生成）。这些结果表明，线粒体PEP通过SLC25A35转运到胞质中支持糖异生，从而促进脂肪组织中甘油酯的合成。

图S8.Slc25a35^Adipo KO小鼠的代谢特征

7. 阻断线粒体PEP输出可减轻肝脏脂肪变性

肝脏摄取的脂肪酸约有50%或更多被重新酯化为TGs，并以极低密度脂蛋白(VLDLs)的形式释放，这一过程的紊乱会导致代谢功能障碍相关脂肪性肝病(MASLD)。先前的研究表明，糖异生在大鼠和人的肝脏的TG合成中起关键作用，尤其是在长时间禁食期间。此外，在2型糖尿病患者中，糖异生似乎有助于VLDL中TGs的合成。然而，线粒体来源的PEP对肝脏糖异生的贡献及其在肝脏脂肪变性发病机制的影响尚不清楚。值得注意的是，对公开数据集的转录组学分析显示，与健康受试者相比，患有MASLD的人类肝脏中SLC25A35表达有轻度但显著的上调(图6A)。同样，与NCD组小鼠相比，HFD组小鼠肝脏中Slc25a35的mRNA水平更高(图6B)。与在脂肪细胞中的结果一致，研究人员发现SLC25A35在肝细胞中的缺失导致PEP在线粒体中积累，这表明SLC25A35在肝脏中也参与线粒体PEP输出和甘油脂的合成 (图S9A)。

为了研究肝脏特异性阻断SLC25A35在多大程度上能够预防饮食诱导的肝脏脂肪变性，研究人员通过将Slc25a35^flox/flox小鼠与Alb-Cre(Alb-Cre×Slc25a35^flox/flox,Slc25a35^Liver KO小鼠)杂交，构建了肝脏特异性敲除Slc25a35小鼠(图S9B)。当小鼠在30℃条件下饲喂高脂饲料时，Slc25a35^Liver KO小鼠的体重表现出比同窝对照小鼠(Slc25a35^flox/flox小鼠)低的趋势，但两种基因型之间无显著差异(图6C)。在组织水平上，Slc25a35^Liver KO小鼠的肝脏重量显著低于对照小鼠，而其他器官重量无差异(图S9C)。苏木精-伊红(H&E)染色显示，与对照组小鼠相比，Slc25a35^Liver KO小鼠肝脏中脂滴面积减少(图6D)。定量检测发现，与对照组小鼠相比，Slc25a35^Liver KO小鼠肝脏中TGs的水平显著降低(图6E)。此外，Slc25a35^Liver KO小鼠血清和肝脏中的甘油水平显著低于对照小鼠(图6F和6G)。重要的是，肝脏的脂质组学分析鉴定出多种在Slc25a35^Liver KO小鼠中水平低于对照组的脂质种类，包括TGs，甘油二酯(DG)(16:1_20:4)，磷脂酰胆碱(PC)(18:0_22:5)，磷脂酰肌醇(PI)和神经酰胺(图6H;表S4)。这些肝脏脂质含量的变化伴随着肝脏炎症谱的改善。对巨噬细胞标记物(F4/80)的免疫染色组化分析发现，肝脏特异性SLC25A35 KO小鼠肝脏中的巨噬细胞浸润明显少于对照组小鼠(图6I)。与之一致的是，Slc25a35^Liver KO小鼠肝脏中参与炎症反应的基因表达水平也显著低于对照小鼠(图S9D)。

肝脏TGs和炎症水平的降低与全身血糖稳态的改善有关。因此，研究人员继续探究了肝脏特异性敲除SLC25A35对饮食诱导的胰岛素抵抗小鼠的保护作用。在HFD喂养18周时，胰岛素耐量实验(ITT)显示，Slc25a35^Liver KO小鼠比同窝对照小鼠表现出更强的胰岛素敏感性(图6J)。同样，在HFD喂养17周时，丙酮酸耐受试验(PTTs)显示，Slc25a35^Liver KO小鼠的肝脏糖异生水平显著低于同窝对照小鼠(图S9E)。随后，研究人员检测了SLC25A35是否为糖异生所必需。为此，研究人员采用¹³C标记的丙酮酸作为示踪剂，测定原代肝细胞条件培养基中的¹³C标记的葡萄糖生成量。因为胰高血糖素能够增加¹³C标记的葡萄糖的释放量，验证了该检测体系能够用于测量糖异生。研究人员发现Slc25a35 KO肝细胞产生¹³C标记葡萄糖水平与对照肝细胞相当 (图S9F)。这些数据表明，通过SLC25A35转运的线粒体PEP在甘油酯类合成中发挥重要作用，但对肝脏糖异生的贡献较小。以上数据表明，Slc25a35^Liver KO小鼠丙酮酸耐受性的改善是由TG和肝脏炎症的降低导致的。

最后，研究人员通过评估在肝脏脂肪变性的肥胖小鼠体内诱导性清除SLC25A35的疾病改善程度，来探索阻断SLC25A35介导的脂肪合成的治疗潜力。为此，研究人员通过将8型腺相关病毒8(AAV8)-TBG-iCre或AAV8-TBG-null(对照)通过尾静脉注射到到30℃条件下高脂肪饮食喂养8周的Slc25a35^flox/flox小鼠肝脏中，以急性敲除SLC25A35(图6K)。在尾静脉注射AAV 10周后，AAV-Cre有效降低了90%以上的Slc25a35 mRNA表达(图S10A)。诱导性清除SLC25A35并不影响体重(图S10B)。然而，研究人员发现，诱导性敲除SLC25A35使肝脏TG含量降低了33.4%(图6L)。与Alb-Cre组一致，肝脏脂质组学分析显示，在Slc25a35 AAV-KO^Liver小鼠(图S10C;表S5)中的其他脂质种类，包括二酰甘油、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酸(PA)(16:0_18:1)也降低。组织学分析发现，诱导型Slc25a35 KO小鼠肝脏中脂滴面积相比于对照肝脏有所减少(图6M和S10D)。最后，与对照组小鼠相比，Slc25a35 AAV-KO^Liver小鼠血清中肝损伤标志物丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)的水平显著降低(图6N)。研究人员还发现Slc25a35 AAV-KO^Liver小鼠肝脏线粒体应激标志物Fgf21,Gdf15,Atf5和Trib3的表达与对照小鼠没有差异，Atf4的表达在AAV-KO^Liver小鼠中略有增加(图S10E)。综上所述，通过Alb-Cre介导的基因敲除和AAV-Cre诱导的基因清除两种互补策略来阻断肝脏中的SLC25A35，均有效地改善肥胖相关的肝脏脂肪变性。

图6.阻断线粒体PEP转运可改善体内肝脏脂肪变性

图S9.阻断肝脏线粒体PEP转运可减轻肝脏脂肪变性

图S10.基于AAV的肝脏线粒体PEP转运的耗竭改善了肝脏脂肪变性

总结

线粒体提供除ATP外的多种代谢产物，以满足细胞特异性需求。其中，磷酸烯醇丙酮酸(PEP) 是一种含有比ATP更高能量磷酸键的代谢物，具有多种生物学功能。然而，线粒体来源的PEP是如何被转运到细胞质并满足细胞特异性需求的，目前仍不清楚。在本研究中，研究人员发现，在利用丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸旁路合成甘油脂的成脂细胞中，SLC25A35调节线粒体PEP转运和糖异生过程。重组表达和结构研究表明，SLC25A35以pH梯度依赖的方式转运PEP。在脂肪细胞中敲除SLC25A35会损害线粒体PEP转化为甘油-3-磷酸，从而减少甘油酯的合成。值得注意的是，在肥胖小鼠肝脏中抑制SLC25A35可改善肝脏脂肪变性，并改善全身葡萄糖稳态。综上所述，线粒体通过SLC25A35提供PEP促进甘油酯合成，揭示了线粒体在脂肪生成中作为限制甘油酯合成的靶点，这是肝脏脂肪变性和2型糖尿病发病机制中的关键环节。

原文链接：https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(26)00224-2

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