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5.AAV8介导的选择性靶向降低LSEC中的GLP-1R表达

      为了破坏肝脏EC中的GLP-1R信号，研究人员采用AAV8-Cre病毒方法实现肝脏中Glp1r的诱导性敲低。成年Glp1rfl/fl小鼠维持CDHFD饮食及接受单次尾静脉注射AAV8-Cre来实现肝微血管内的靶向重组。注射后2个月，AAV8-Cre给药对体重、脂肪量、瘦体重或葡萄糖耐量没有影响（图S4A–S4C）。值得注意的是，肝脏中Glp1r mRNA水平下调，但在肝外组织（如胰腺、肺和肾脏）中没有变化（图S4D）。为了评估细胞类型选择性，研究人员从肝脏中进行了基于FACS的CD45⁻CD31⁺ EC和CD45⁺CD3⁺ T细胞分选（图S4E–S4I）。在CD31⁺EC中检测到Glp1r表达显著降低并同时伴有Cre表达上调，而CD3⁺ T细胞中Glp1r或Cre水平没有变化（图S4F–S4I）（小编注：病毒物理上确实会流经整个肝脏。但它不感染T细胞，而是特异性感染内皮细胞，根本原因在于AAV8血清型的天然趋向性（Tropism）与细胞表面受体的差异。病毒与细胞的接触效率完全不同，肝窦内皮细胞衬贴在血管壁内，接触时间充分。AAV8高效感染细胞主要依赖硫酸肝素蛋白聚糖（HSPG）以及整合素（如αVβ5）等共受体,静息状态下的T细胞表面几乎不表达AAV8所需的这些关键附着受体（HSPG和特定整合素）。此外静息T细胞没有分裂，核膜完整，AAV8很难突破核孔复合物进入细胞核，AAV有效核运输比较困难）。

为了进一步证实AAV8-Cre对肝脏EC的选择性靶向，研究人员在Glp1r^fl/fl:Ai14小鼠中进行了类似的实验，在该小鼠中Cre介导的重组驱动永久的tdTomato表达。（小编注：Ai14小鼠基因组Rosa26位点携带tdTomato元件，无Cre时终止序列阻碍荧光基因表达；Cre介导loxP重组、切除Stop片段后，细胞永久表达tdTomato红光，实现重组细胞可视化标记。本实验仅CD31⁺LSEC出现荧光、CD3⁺T细胞阴性，结合前文分选qPCR的Glp1r转录下调数据，从荧光示踪+基因定量双层面共同证实AAV8-Cre仅靶向肝窦内皮，无T细胞脱靶）。将小鼠分为三组：溶剂对照组、AAV8-GFP（对照病毒）组或AAV8-Cre组。成像流式细胞术显示GFP和tdTomato信号仅存在于CD31⁺ EC中，在CD3⁺T细胞中未检测到表达（图S4J–S4L）。从注射AAV8-Cre的Glp1r^fl/fl:Ai14小鼠中FACS分选的CD31⁺细胞显示Glp1r mRNA减少，而在CD3⁺细胞中表达保持不变（图S4M–S4O）。这两种互补的方法验证了肝脏EC的选择性靶向，从而能够在这个在解剖学和免疫学上至关重要的肝脏区室中精确解析GLP-1R信号的功能。

图S4.AAV8-Cre介导的肝Glp1r下调及其机制的验证及实验性MASH对Glp1rWnt1-/-和Glp1rfl/fl小鼠的代谢影响

6.司美格鲁肽在MASH中发挥肝脏保护作用，需要依赖肝脏内皮细胞上的GLP-1R

接下来，研究人员研究了内皮GLP-1R信号在介导司美格鲁肽不依赖于体重减轻的肝脏获益中的功能相关性。研究人员将AAV8-Cre病毒导入Glp1r^Wnt1-/-雄性小鼠体内，这些小鼠在司美格鲁肽治疗下体重并未下降，但表现出部分肝脏保护作用（图1和图2）。通过在这个体重稳定的模型中选择性下调肝窦内皮细胞（LSEC）中的Glp1r，研究人员探索了内皮GLP-1R活性是否参与了司美格鲁肽的肝脏获益。给喂食CDHFD的Glp1r^Wnt1-/-小鼠注射AAV8-GFP或AAV8-Cre，并随机分组接受生理盐水或司美格鲁肽治疗（图5A）。各组间在体重、身体组成或器官重量（肝脏、附睾白色脂肪、腹股沟白色脂肪和棕色脂肪）上均未观察到差异（图5B–5E、S4P和S4Q）。尽管体重没有下降，司美格鲁肽仍改善了AAV8-GFP和AAV8-Cre治疗小鼠的葡萄糖代谢（图5F和5G）。各组间的血清脂质谱及ALT、AST、ALP、胆红素水平均无变化（图5H、S4R和S4S）。在Glp1r^Wnt1-/- AAV8-GFP小鼠中，司美格鲁肽减轻了肝脏脂肪变性和纤维化，但在接受AAV8-Cre的小鼠中则未观察到这一效果（图5I和S4T）。两组接受司美格鲁肽治疗的小鼠肝脏甘油三酯含量均同样降低（图5J），但羟脯氨酸含量及纤维化标志物Col1a1、Col4a1的肝脏表达水平呈下降趋势，而Tgfb1和Acta2仅在司美格鲁肽治疗的AAV8-GFP小鼠中降低（图5K和5L）。此外，在AAV8-GFP治疗的Glp1r^Wnt-/-小鼠中，司美格鲁肽抑制了肝脏Cxcl2、Fabp4和Cd36的mRNA表达，但这些效应在内皮Glp1r被AAV8-Cre下调后消失（图5M）。

接下来，研究人员在对司美格鲁肽表现出体重减轻反应的Glp1r^fl/fl雄性小鼠中靶向了肝脏EC。在给予AAV8-GFP或AAV8-Cre后，小鼠被随机分配接受每日生理盐水或司美格鲁肽治疗持续10周（图5N）。司美格鲁肽诱导的体重减轻在两组之间相当，AAV8-GFP和AAV8-Cre队列之间在身体成分或器官重量方面没有差异（图5O–5R、S4U和S4V）。类似地，司美格鲁肽在两组中均改善了血糖水平（图5S和5T）。血清脂质谱保持不变（图S4W）。然而，虽然司美格鲁肽降低了注射AAV8-GFP的小鼠的ALT水平，但这种效应在缺乏内皮GLP-1R表达的小鼠中减弱了（图5U）。在AST、ALP或胆红素水平方面未观察到变化（图5U和图S4X）。在组织学上，接受司美格鲁肽治疗的AAV8-GFP小鼠表现出纤维化和脂肪变性的减少，而这些改善在注射AAV8-Cre的小鼠中减弱了（图5V和图S4Y）。肝脏羟脯氨酸呈降低趋势，并且甘油三酯含量仅在接受司美格鲁肽治疗的AAV8-GFP小鼠中减少（图5W和5X）。司美格鲁肽在AAV8-GFP治疗的小鼠中还降低了Acta2、Cxcl1、Cxcl2和Fabp4的肝脏表达，但在AAV8-Cre组中没有（图5Y和5Z）。

为了证实这些发现，研究人员接下来将AAV8-Cre给予Glp1r^fl/fl雌性小鼠，并将其分为三组：STD组、CDHFD加生理盐水治疗组，以及CDHFD加司美格鲁肽治疗组（图S5A）。CDHFD喂养诱导了体重增加、脂肪量增加和葡萄糖代谢受损。值得注意的是，尽管AAV8-Cre导致肝脏内皮Glp1r下调，司美格鲁肽仍逆转了所有这些代谢异常（图S5B–S5G）。在接受生理盐水治疗的CDHFD小鼠中，血清ALT和AST水平显著升高，而在接受司美格鲁肽治疗的动物中，这些水平部分减弱（图S5H）。组织学分析显示，在接受AAV8-Cre给药并接受司美格鲁肽治疗的小鼠中，肝脏纤维化或脂肪变性没有改善（图S5I）。

通过t-SNE密度图和定量分析对肝脏免疫细胞进行免疫表型分析，结果显示，CDHFD喂养小鼠中肝脏总T细胞增加，经过司美格鲁肽治疗后这些细胞仍部分维持在较高水平。CDHFD喂养显著减少了B细胞，司美格鲁肽治疗后出现轻度恢复，但未回到对照水平（图S5J和S5K）。其他免疫细胞群体基本保持不变。CDHFD喂养小鼠中CD8a⁺T细胞升高，且未被司美格鲁肽恢复正常。值得注意的是，由CDHFD喂养诱导的初始和中央记忆CD8a⁺T细胞的丢失未被司美格鲁肽挽救（图S5L和S5M）。CD4⁺T细胞数量在CDHFD条件下减少，中央记忆CD4⁺T细胞也相应减少，这些发现同样不受司美格鲁肽的影响（图S5L–S5N）。尽管使用了司美格鲁肽，肝脏中CXCL1/KC和TNF-α蛋白水平仍然升高（图S5O和S5P）。这些发现表明，内皮GLP-1R信号是司美格鲁肽局部肝脏作用的关键介质，有助于MASH的缓解。

图5. 通过AAV8-Cre递送下调内皮细胞中的肝脏Glp1r表达可减弱司美格鲁肽介导的肝脏保护作用

图S5.司美格鲁肽在注射AAV8-Cre并喂食CDHFD的Glp1r^fl/fl小鼠中对脂肪变性、纤维化和肝脏免疫调节的影响

7.GLP-1R⁺肝脏EC在MASH中重编程代谢和炎症网络，由司美格鲁肽实现缓解

揭示GLP-1R信号如何重塑肝脏微环境，研究人员分析了来自喂食STD、CDHFD或CDHFD加司美格鲁肽的WT小鼠的单细胞转录组数据。司美格鲁肽逆转了CDHFD的全身和肝脏效应，使体重、身体成分、葡萄糖代谢和肝脏组织学恢复正常（图S6A–S6I）。在细胞水平上，CDHFD降低了B细胞丰度，T细胞和巨噬细胞增加，这些变化被司美格鲁肽完全恢复正常，这与肝脏免疫“面貌”的广泛免疫调节重塑相一致（图6A）。这种基于scRNA-seq的细胞类型丰度评估反映了我们通过流式细胞术获得的结果，进一步证实了司美格鲁肽广泛重塑肝脏细胞免疫特征的观点。为了进一步解析巨噬细胞的异质性，研究人员对所有条件下的巨噬细胞区室进行了二次重新聚类，鉴定出枯否细胞、活化的单核细胞来源的巨噬细胞（活化MoMF；Trem2⁺）、炎性单核细胞来源的巨噬细胞（炎性MoMF；Vcan⁺/Chil3⁺）和巡逻单核细胞（Ace⁺/S1pr5⁺）。这些巨噬细胞亚群的相对丰度在不同饮食和治疗条件下差异显著，CDHFD诱导活化MoMF显著增加并减少炎性MoMF，而司美格鲁肽治疗逆转了这些群体的变化，并将巨噬细胞组成恢复至稳态状态，同时相对保留了库弗细胞和巡逻单核细胞（图S6J）。

通过火山图可视化的差异基因表达分析及随后的基因本体（GO）富集分析揭示，炎症通路（如免疫效应过程、TGF-β信号、对IL-1和TNF的反应）协同上调，同时关键代谢功能（包括前体代谢物和能量的生成、线粒体组织、对氧化应激的反应以及胰岛素信号）显著下调（图6B–6D）。司美格鲁肽逆转了这一转变，恢复了代谢、线粒体和氧化程序，同时抑制了促炎特征，包括T细胞活化和TGF-β反应（图6E–6G）。这些数据得到了标志性基因集富集分析的支持，表明在MASH中，中央静脉周围LSEC呈现出炎症性、血管生成性和EMT样表型（图6H）。这一转变与先前描述慢性肝损伤中LSEC表型重塑（包括代谢功能丧失和血管分泌信号中断）的报道一致。值得注意的是，司美格鲁肽治疗抵消了这种转变，恢复了代谢和抗炎的转录谱（图6H）。由于肝脏纤维化与LSEC毛细血管化相关，研究人员评估了已建立的内皮去分化和基底膜形成的基因特征（小编注：生理状态下，肝窦内皮细胞（LSEC）具有特征性筛孔结构，且不表达完整基底膜，这是其执行物质交换功能的形态学基础。在慢性肝损伤（如MASH）中，LSEC 发生毛细血管化：筛孔消失、细胞间连接变紧密，并沉积大量连续的基底膜成分。这一结构改变是肝星状细胞活化、肝纤维化启动的关键上游事件）。CDHFD喂养诱导了毛细血管化和转分化标志物的上调，包括连续内皮、细胞外基质沉积和间质转化的特征基因，这一模式被司美格鲁肽治疗大部分逆转（Pecam1除外），表明LSEC分化状态得以维持（图6I）。

接下来，研究人员根据Glp1r表达对中央静脉周围LSEC进行分层，以确定该标志物是否划分出功能不同的亚群。值得注意的是，尽管共享相同的解剖位置，Glp1r⁺和Glp1r⁻LSEC对损伤和治疗的反应表现出不同的转录反应（图S6K–S6N）。在MASH中，Glp1r⁺LSEC显示出313个基因的独特性下调（Glp1r^pos_DOWN；图S6J），这些基因富集在肌动蛋白丝组织、趋化性、白细胞迁移和细胞因子信号中（图S6L），而在Glp1r⁻LSEC对应群体中未观察到这一特征（Glp1r^neg_DOWN）。相反，司美格鲁肽选择性地在Glp1r⁺LSEC中上调了与蛋白质运输、细胞解聚和氧化代谢相关的基因（Glp1r^pos_UP；图S6M和S6N）。这些发现确定Glp1r⁺中央静脉周围LSEC是肝损伤的动态哨兵和对司美格鲁肽的优先反应细胞，这不仅是因为体重减轻，更是通过直接参与能够选择性启动保护性代谢程序并抑制炎症和迁移信号的分子机制。这种在同一解剖区室内出现的功能相反凸显了Glp1r作为MASH中LSEC可塑性的关键分子决定因素。

为了研究中央静脉周围LSEC的转录变化如何影响其他肝脏细胞类型，研究人员对全局scRNA-seq数据集进行了CellChat分析。与高细胞数量和组织复杂性相一致，分析揭示了一个由显著的配体-受体相互作用构成的密集网络（图S6O）。全局模式识别识别出传入和传出信号的三个潜在信号程序，分别对应于EC（模式1）、免疫细胞（模式2）和实质/基质群体（模式3）（图S6P）。每个通讯模块都与不同的信号通路和细胞贡献者相关联，如河流图所示，其中每条流线的宽度反映了一个群体对特定信号程序的贡献（图S6Q和S6R）。（小编注：模式1（EC程序）为血管微环境稳态与损伤感应，主要由肝窦内皮细胞（LSEC，特别是Glp1r+LSEC）驱动，富集VWF（血管性血友病因子）、SELE（选择素E）、CEACAM和EDN（内皮素）等通路，这些通路直接与血管通透性、凝血、白细胞募集（免疫细胞黏附滚动）有关。作为血液与肝实质之间的“第一道屏障”，EC程序主要负责感知血流剪切力、损伤信号，并向免疫细胞或肝细胞发出“微环境改变”的预警信号。模式2（免疫细胞程序）是炎症监控与效应应答，主要由肝脏驻留或浸润的免疫细胞（如巨噬细胞、T细胞、NK细胞）驱动，通常涉及趋化因子（如CCL、CXCL家族）、炎症性细胞因子（如TNF、IFN）或共抑制/共刺激分子，负责执行免疫监视、抗原呈递和炎症反应。模式3（实质/基质程序）为代谢功能与组织重塑，主要由肝细胞（实质细胞，负责代谢）和肝星状细胞（基质细胞，负责细胞外基质产生）驱动，涉及生长因子（如TGF-β、HGF）、代谢物转运相关配体以及细胞外基质重塑信号，负责维持肝脏的合成、解毒、能量储存等核心代谢功能，以及应对纤维化损伤的修复反应）。

为了理解Glp1r⁺LSEC在这一全局架构中的作用，研究人员筛选了数据集，突出显示Glp1r⁺细胞作为主要发送者或接收者的通路。在该群体中特异性富集了几个通路，包括血管性血友病因子（VWF）、选择素E（SELE）、癌胚抗原相关细胞黏附分子（CEACAM）和内皮素（EDN），这些通路均与肝损伤、内皮信号和免疫串扰有关。这些通路以自分泌（LSEC-LSEC）和旁分泌（LSEC-免疫细胞或LSEC-实质细胞）两种方式运作，表明Glp1r⁺LSEC可能作为局部微环境信号的协调者（图S6S）。

接下来，研究人员检测了这些通讯网络在不同条件下（STD、CDHFD和CDHFD+司美格鲁肽）是否发生改变。CDHFD诱导的肝损伤导致推断的细胞间相互作用的数量和整体强度均全局性减少，表明正常的肝脏通讯网络发生破坏或重组（图6J）。这种减少影响了多种细胞类型，包括内皮细胞、免疫细胞和实质细胞群体（图6K）。司美格鲁肽治疗将相互作用的数量和强度恢复至接近STD水平，表明肝脏微环境中协调的细胞间信号得以重建（图6J和6K）。

接下来，研究人员量化了每条信号通路的整体信息流，应用配对Wilcoxon检验来识别条件特异性变化。该分析显示，VWF和SELE等通路在CDHFD肝脏中富集，并被司美格鲁肽恢复正常，而EDN和CEACAM信号在MASH中被抑制，并在司美格鲁肽给药后恢复（图6L）。为了精确定位这些变化的细胞来源和靶点，研究人员绘制了不同条件下的配体-受体表达和信号作用图（图6M和图S7A–S7C）。值得注意的是，Glp1r⁺LSEC在损伤和恢复环境中均作为主要的信号发送者，特别是在免疫、纤维化和内皮相关通路中（图S7C）。这些细胞根据条件调节不同的靶标群体，表明Glp1r⁺LSEC在重塑肝脏微环境中起着核心协调作用。总之，这些结果揭示了Glp1r⁺LSEC作为细胞间通讯的动态传感器和协调者，响应代谢损伤和治疗干预而重新连接特定的信号轴。

为了验证单细胞分析中确定的关键转录变化，研究人员在来自遗传和病毒遗传模型（包括Glp1r^Tie2-/-小鼠以及AAV8-Cre介导的Glp1r敲除的Glp1r^fl/fl和Glp1r^Wnt1-/-小鼠）的整个肝组织中进行了独立的基因表达分析（图S7D–S7F），量化了Vwf、Ceacam1、Edn1和Sele的表达。Vwf在所有实验模型中均表现出对司美格鲁肽最一致且最强烈的调节（图S7D–S7F），强调内皮活化和血管信号是肝脏GLP-1R作用的核心靶点。（小编注：VWF是LSEC内皮活化标志性基因，多基因敲除+AAV条件敲除多模型交叉验证，锁定VWF介导的内皮血管信号是GLP1R调控肝脏病理的核心下游通路）。

图6. 在 MASH 中，小叶中心区LSECs 发生转录重编程和细胞间通讯改变，而司美格鲁肽可逆转这些变化

图S6.WT小鼠中实验模型、内皮转录状态及信号网络的表征

8.蛋白质组重塑反映了司美格鲁肽在MASH 中的转录和细胞水平影响

研究人员对用于scRNA-seq的同一批WT小鼠肝脏（STD、CDHFD和CDHFD+司美格鲁肽）进行了整体蛋白质组学分析。主成分分析（PCA）显示三组明显分离，每种条件形成一个独特的集群，反映了不同的肝脏蛋白质组状态（图7A）。火山图分析揭示了MASH中深刻的蛋白质组重塑：与STD相比，CDHFD诱导了243种蛋白上调和169种蛋白下调（图7B）。与CDHFD相比，司美格鲁肽调节了肝脏蛋白质组，增加101种蛋白，减少95种蛋白（图7C）。重叠分析显示，司美格鲁肽逆转了CDHFD上调的49种蛋白的表达，并恢复了47种蛋白的表达（图7D）。在MASH中升高并被司美格鲁肽恢复正常的蛋白富集于与脂质代谢、β-氧化、凋亡和胶原合成相关的通路，这与肝脏应激和纤维化发生一致（图7E和7F）。相反，在胆碱缺乏高脂饮食（CDHFD）中表达下调、而经司美格鲁肽治疗得以恢复的蛋白质，与酪氨酸代谢、氨基酸代谢以及线粒体β-氧化相关，这凸显了代谢功能的全面恢复。

为了探究这些蛋白质组变化是否反映转录趋势，研究人员从scRNA-seq数据中进行了伪批量分析，并关联了mRNA和蛋白的倍数变化。总体而言，观察到了正相关性，尽管如预期那样存在部分不一致和不显著的基因（图7I）。为了聚焦于具有强烈且一致调控的候选基因，研究人员筛选了在伪批量RNA和蛋白数据集中倍数变化均≥1.5倍的基因。这产生了在每对比较（CDHFD与STD，以及CDHFD+司美格鲁肽与CDHFD）中具有一致上调（两者均上调）或下调（两者均下调）的不同基因集。值得注意的是，所有结果均按起源细胞类型进行了注释，从而深入了解了受疾病和治疗影响最大的肝脏区室（图7J和7K）。在这些候选基因中，有几个基因因其双重水平的调控和已知的功能作用而脱颖而出。例如，主要在LSEC中表达的FABP4和CD36，在mRNA和蛋白水平上均被司美格鲁肽下调（图7K）。有趣的是，相同的蛋白在STEP1和STEP2临床试验中被鉴定为司美格鲁肽反应性生物标志物（图7L），这支持了研究人员发现的转化相关性。跨物种和样本类型的调控一致性表明，这些内皮来源的因子代表了GLP-1RA活性的生物标志物，将局部肝脏变化与全身蛋白质组特征联系起来。

因此，司美格鲁肽产生广泛的肝脏蛋白质组重塑，能够恢复代谢稳态并抑制纤维化和炎症程序。单细胞转录变化、整体组织蛋白质组学和生物标志物特征之间的高度一致性，突显了GLP-1R介导的肝脏重编程的广度。

图7. MASH 中肝脏蛋白质组学重塑及其经司美格鲁肽治疗后的逆转

图S7.司美格鲁肽重塑MASH中由LSEC 介导的肝脏信号网络

 总结   

胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类药物通过依赖体重下降和不依赖体重下降的双重机制改善代谢性肝脏疾病。在本研究中，研究人员探究了司美格鲁肽在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）小鼠模型中的作用。在对GLP-1受体激动剂（GLP-1RA）诱导的体重下降不敏感的Glp1^Wnt1-/-小鼠中，司美格鲁肽仍能改善脂肪变性、纤维化和免疫重塑。GEM-X Flex-seq技术将Glp1r表达定位于小叶中心区的肝窦内皮细胞（LSEC）和CD8⁺ T细胞。在Glp1r^Tie2-/- 小鼠中敲除内皮细胞Glp1r，或通过AAV8-Cre介导的肝脏内皮细胞Glp1r敲低，均可显著削弱司美格鲁肽的肝脏保护作用，而体重下降仍可保持。转录组分析显示，在MASH状态下，Glp1r⁺ LSEC呈现应激反应表型，而司美格鲁肽可逆转该表型。Glp1r⁺ LSEC是司美格鲁肽调控的损伤与修复相关信号通路（涉及VWF、SELE、CEACAM和BMP）的主要贡献者。分子图谱分析表明，司美格鲁肽可在转录和蛋白水平上协同逆转疾病特征。总之，这些基于MASH小鼠模型的数据揭示了一个由内皮细胞特异性、不依赖体重下降、司美格鲁肽调控且依赖GLP-1受体的肝内信号网络，该网络可改善肝脏健康。

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