Advanced Materials :液-液生物3D打印实现超低粘度墨水打印

【研究背景】生物3D打印通过将细胞及水凝胶墨水混合构成生物墨水，这里的水凝胶墨水起到胶水作用，在打印过程中将细胞固定，实现细胞的三维组装。通常生物墨水的粘度主要由水凝胶墨水决定，在相同温度等条件下，粘度越大，意味着水凝胶的固含量越高，更容易打印，但固含量越高对细胞的约束越大，不利于后续的功能化。此外粘度高了后还有一个大问题，细胞难以均匀的混入墨水中，无法获得高细胞密度的生物墨水，常用的生物墨水其细胞密度约在10^6/ml，体积比约占整个墨水的5%，载细胞密度与体内主要脏器（心肝脾肺肾）细胞占比超过60%相比，差距甚远。

基于支撑浴的悬浮/嵌入式3D打印，虽一定程度上降低了对墨水粘度的要求，但目前半固态的支撑浴在喷头移动后的自愈合速度有限，超低粘度的墨水流动性能过强，会在喷头划过的缝隙中快速流动并扩散，导致打印精度很低。半固态的支撑浴另一个缺点是打印后的结构去除支撑浴是一个难题。

那能否实现超低粘度（粘度与水接近）水凝胶墨水的打印，并在此基础上实现超高细胞密度的打印呢？

浙江大学贺永、宁波大学邵磊等提出了一种液-液生物3D打印策略（Liquid-in-liquid 3D bioprinting，LL3DBP，图1），我们设计了一种近乎液态的支撑浴，这样在打印超低粘度墨水时，液态支撑浴能通过快速自愈合抑制超低粘度墨水的流动。此外我们提出静电吸附策略，通过超低粘度水凝胶墨水与支撑浴的静电吸引抑制支撑浴内超低粘度墨水的扩散。液-液打印方法能打印粘度低于10cp的水凝胶墨水，打印完成后也很容易将打印好的结构取出来。

我们证明了利用超低粘度水凝胶墨水，很容易实现超高密度的细胞装载，并实现高精度及高活性的打印，液-液打印方法能够成功打印细胞体积比超过90%的生物墨水，能够构建拟真实性的组织细胞密度环境，可有效增强细胞间相互作用，促进细胞生长融合与功能化。

图1. 液-液生物3D打印

【浴-墨水相互作用】

为了制备液态的颗粒支撑浴，κ-卡拉胶冷凝胶块搅碎后形成5μm左右的微凝胶颗粒，这些卡拉胶微凝胶组成的支撑浴具有高透明性，且不吸收405nm光（图2A-C）。高度液态的特性使得支撑浴具有很好的流动性，打印的结构交联后可以直接取出，无需多余洗脱支撑浴的步骤（图2D-F）。GelMA是明胶改性的光敏材料，而明胶包括A型和B型。通过不同类型的明胶制备的GelMA-A与GelMA-B，分别携带正电荷和负电荷（图2G）。研究发现携带不同电荷的GelMA在带负电荷的卡拉胶支撑浴内沉积后扩散的程度不一样，GelMA-B墨水在卡拉胶浴内发生了明显的扩散（图2H）。拉曼光谱进一步地揭示GelMA-A的氨基可能与卡拉胶的硫酸酯键直接相互作用（图2I）。GelMA与卡拉胶支撑浴相互静电作用下，6h后打印丝宽度仅增加了约27%（图2J，视频见Video S2）。GelMA-A与卡拉胶浴的颗粒静电相互作用可以形成一层薄膜，而更小的pH值可以增加GelMA-A表面的电荷数量，可以与支撑浴形成更厚的膜结构。并且发现更小的pH环境下，墨水更不容易扩散（图3A-B）。

图2浴-墨水静电作用防止墨水扩散

图3 不同电荷的GelMA墨水与打印效果

【支撑浴特性】

理想的支撑液应具有良好剪切稀化性、快速自愈性和易去除性。24℃时，浓度为 0.3%、0.4% 和 0.5% w/v 的液态颗粒支撑浴的初始粘度介于100 和1000 Pa-s 之间。随着剪切速率的增加，浴液的粘度逐渐下降（图4A）。在低应变（0-8%）条件下，浴液呈凝胶状（G' > G"），代表一种支撑状态。当受到较高应变（10%）时，浴液呈液态（G" > G'），代表流动状态（图4B）。这些结果证实，κ-卡拉胶制备的液态颗粒支撑浴是一种屈服应力流体，表现出剪切稀化。此外，支撑浴应能在液态和支撑态之间快速稳定地转换。支撑浴的G' 和 G''在200%和1%的应变作用两个循环后仍能恢复到初始值，照着表明该支撑浴具备在支撑态和液态之间反复转换的能力（图 4D）。此外，三种浓度的液态颗粒支撑浴都能非常迅速地（< 0.03 s）恢复到支撑状态（图 4E和F）。这些数据表明，κ-卡拉胶浴具有较低的屈服应力与快速的自愈速度。在液态颗粒浴中，5% w/v GelMA 的向上的流动明显受到抑制（图5）。

在打印过程中，支撑浴是一种临时介质，需要在打印结束后完全清除。制备的κ-卡拉胶支撑浴呈液态，取出打印样品过程中，浴液可自行流除。另外，打印的样品上残留的κ-卡拉胶颗粒可以通过热溶解完全去除。液浴在24℃时表现出优异的流动性和低粘度（图4A）。三种浓度的浴液在20-25℃之间都能保持稳定的粘度。在37℃时，0.3%和0.4% w/v的浴液粘度下降了四个数量级，表明浓度为 0.3% 和 0.4% w/v的浴液可以在37℃溶解（图4G）。为了进一步观察 0.4% w/v 浴液的热溶解性，我们在0.4% w/v 浴液中使用 10% w/v GelMA 油墨打印了一个空心球（图4C）。经405nm光交联后，置于37℃水浴中。随着时间的推移，球体变形、下降并塌陷（图4H）。这些结果进一步证实，用适当浓度的κ-卡拉胶制备的浴液可以在37℃下热溶解。由于 0.5% w/v 的浴液不能在 37℃下热溶解，而 0.3% w/v 的浴液在 25℃左右粘度不稳定，因此所有后续实验都选用 0.4% w/v 的浴液。

图4 液态支撑浴的流变特性

图5 5% w/v GelMA在液态颗粒支撑浴与固态支撑浴内的沉积情况

【打印能力】

调整墨水流量与打印速度，可调控打印精度，LL3DBP最小的打印丝直径约为80μm。打印丝横截面的长轴和短轴非常接近，这表明 GelMA 长丝的横截面接近圆形（图6A）。为观察打印丝的均匀性，每隔 30μm测量一根2mm丝的横截面。结果表明，长丝横截面的长宽比始终接近1，横截面的直径和面积都很均匀（图6C和D）。在网格结构中，同一横截面上或不同位置的不同横截面上的打印丝横截面是均匀的（图4E和F，视频见 Video S4）。以上结果表明，LL3DBP可以将液体GelMA 打印成高保真度圆柱形丝状。根据实际值与理论值的孔面积比值，LL3DBP 的打印精度高达 95%（图6G）。大脑模型具有复杂而微小的脑沟结构，这对3D打印是一个严峻挑战。为了研究 LL3DBP 技术在制造复杂结构时的准确性和稳定性，我们打印了一个 2.5cm ´ 1.7 cm ´ 0.5cm的大脑左半球，成功复制了复杂的脑沟结构（图6H）。随后，我们打印了一个有四个空腔的迷你心脏模型。由于浴液的液态性，打印出的心脏可以直接取出（图6I，视频见Video S5）。此外，打印的冠状动脉模型，血管分支与模型之间的平均角度偏差为0.9°（图6J）。总之，液态 5% w/v GelMA-A可以在液浴中均匀地封装成圆柱形细丝，LL3DBP 显示出较高的打印分辨率、打印精度和形状保真度。

图6打印精度与保真度

微型血管芯片打印，尤其是具有多分支、空间交错的小直径血管芯片的打印具有很大挑战。LL3DBP具有较高的打印分辨率和形状保真度，是解决这一问题的潜在技术。最初，我们打印了一个迷你血管芯片，其分叉通道的尺寸为2mm ´ 3mm ´ 6mm（图7A）。此外，我们还设计并打印了具有单螺旋、蜂巢、连续立方晶格和纠缠网络的微型血管芯片，所有这些都能成功灌注（图7B-D）。在人体中，动脉和静脉通常相伴而行，在一个6 mm ´ 6 mm ´ 8 mm的立方体内，我们打印出了一个带有双螺旋通道的微型血管芯片（图7E）。然后，在宽度约为400μm的单螺旋和双螺旋通道内接种HUVEC（图7F和G）。静态培养7天后，HUVEC粘附在通道内壁（图7H和I）。因此，LL3DBP 有助于制造具有多分支和空间交错血管通道的微型血管芯片。

图7 5% w/v GelMA打印的迷你血管芯片

在人体骨骼肌中，肌纤维的定向排列是一个重要的形态特征，也是功能性的基础，而微图案化结构，是诱导细胞取向生长的重要结构形式。水凝胶微图案化需要微米级的分辨率，目前通常需要通过多步浇铸或昂贵的光辅助技术来实现。然而，利用LL3DBP，能在 GelMA 表面打印出螺旋状、波浪状和直线状的微图案构件（图8A）。首先打印基底，再用单根丝打印微槽的两侧的壁，微槽是打印壁之间的空隙。微槽的宽度由壁之间的距离决定。为了确保细胞能完全被限制在微槽中，微槽的壁高可调。微槽壁的高度可通过改变层数来调整。微槽的宽度保持在大约 200μm，槽壁的高度为 377 ± 25μm（图8B）。为了研究微图案促进细胞排列的能力，我们在微凹槽中种植了 C2C12 细胞（图 S8C）。培养5天后，钙绿素和肌球蛋白的交替表达表明细胞被限制在微凹槽内。C2C12 细胞沿着微槽排列，细胞骨架呈现螺旋状、波浪状和直线状（图8C-H）。相邻堆叠打印丝之间形成的层线也有助于诱导细胞排列。与C2C12细胞在槽内的分布相比，细胞在微凹槽内的排列更为集中（图8I-J）。这些结果表明，LL3DBP 能够在水凝胶表面精确打印微米级的微凹槽，而且微图案能有效引导细胞生长排列的方向。

图8 GelMA微图案结构打印并控制细胞生长

【生物相容性分析】

LL3DBP的制造能力已得到证实，但在打印含有细胞的生物墨水时，LL3DBP的生物相容性仍不明确。为了制备20% v/v生物墨水，我们用0.8 mL 5% w/v GelMA-A 悬浮 0.2 mL HUVEC。使用制备好的生物墨水，我们打印出了网格结构，可将其从浴槽中提取出来并直接放入细胞培养基中进行培养（图9A和B）。24小时内的细胞存活率显示，打印样品和浇筑样品之间没有明显的统计学差异，表明打印过程没有对细胞造成损伤（图9C和D）。打印后的细胞表现出逐渐增强的高细胞活力（≥95%）（图9C和D）。从第1天到第5天，打印构建体中的HUVEC细胞从最初的圆形逐渐扩展到后来的长条形，细胞的周长和面积也逐渐增大（图9E和F）。第5天，HUVEC相互连接并形成密集的毛细血管状网络，其内部或之间有明显的空腔（图9E-H）。

图9 载细胞打印的生物相容性分析

【高占比细胞墨水打印】

多孔的细胞负载结构可实现有效的氧气、养分和废物扩散，促进大尺寸复杂细胞负载结构的细胞活性。二重极小曲面结构（TPMS）可通过数学参数调整精确控制孔隙率。使用 5% w/v GelMA-A，LL3DBP可以打印出毫米级 TPMS 结构（图10A）。为了制备约40% v/v的生物墨水，使用 0.6 mL 5% w/v GelMA稀释0.4 mL HUVEC。此外，我们尝试用 40% v/v的细胞打印两种类型的TPMS结构（Ⅰ型和Ⅱ型）（图10B-G，视频见Video S6）。对于I型TPMS结构，分别从顶部150μm和底部200μm区域选择了三个圆形孔区域（图10B-E）。所选区域的HUVEC形成了毛细血管样网络。这些血管网络分支的总长度和平均长度没有明显的统计学差异（图10F）。同时，我们打印了不同孔隙结构的Ⅱ型TPMS结构，结构中的HUVEC充分伸展并形成了均匀密集的网络（图10G）。以上结果表明，封装在TMPS结构中的HUVEC具有均匀的生物活性，体现出TMPS结构的高效营养输送性。

图10 40%细胞占比的GelMA墨水打印TPMS结构

类器官球在科学研究和医疗领域具有多方面的价值，为了展示LL3DBP打印类器官微球的能力，我们设计了空心球形路径，成功打印出直径微百微米级的中空球体，同时可调节打印参数精确控制球体的直径和壁厚（图11A-E，视频见Video S7）。此外，LL3DBP可实现空心球体的组装式打印（图11F）。我们使用70% v/v HUVEC的生物墨水进行打印，结果显示细胞在中空球体结构内分布均匀，并且在培养过程中具有良好的生长状态（图11H-K）。

图11 70%细胞占比的GelMA墨水打印空心微球

目前，由于纯细胞缺乏交联特性，纯细胞墨水的直接打印成形尚未见报道。为了开发出具有光交联功能的100% v/v细胞占比的生物墨水，我们首先用 5% w/v GelMA-A 悬浮预先收集的细胞。离心后，除去上清液，底部的细胞沉淀物被视为近乎100% v/v细胞比例的光交联生物墨水（图12A和B）。在紫外光交联后，可直接从水浴中提取由 LL3DBP 打印的含有近100% v/v HUVEC的丝（图12C和D）。打印丝在打印后24小时内保持了91%的细胞活力（图12E和F）。随后，我们使用含 98% v/v HUVEC 的生物墨水打印了网格结构。光交联后，结构可从浴槽中提取而不会断裂（图12G）。随后，我们使用含 98% v/v HUVEC的生物墨水打印了网格结构。光交联后，结构可从浴槽中提取而不会断裂（图12G）。打印结构在第三天出现明显收缩（图12H），我们推测收缩是由细胞-细胞相互作用和HUVEC对GelMA的降解引起的。为了证实GelMA的降解情况，用钙黄绿素接枝的GelMA混合98% v/v HUVECs用于打印，比较培养第1天和第3天的绿色荧光GelMA的降解情况（图12I和J）。钙黄绿素在第一天的表达量很高，第三天几乎完全降解（图12J）。因此，GelMA 降解和细胞间相互作用的增强导致了结构的收缩。此外，95% v/v C2C12占比的GelMA墨水打印了环状结构。培养一天后， C2C12 细胞骨架形成网状结构，在应力作用下封装在结构中的 C2C12 则向一个方向排列生长（图12K）。同时，C2C12 在一天内排列整齐的现象说明，高细胞比例能保持良好的生物活性。

图12 100%细胞占比的生物墨水打印

【本文亮点】

1.      本文开发了一种卡拉胶制备的液态颗粒浴，具备液态的流动性和快速自愈合能力以及较好的支撑特性。

2.      利用液体生物墨水和液体颗粒浴之间的静电相互作用，有效防止液态墨水扩散，可实现正电荷的GelMA的打印，并且具备较高的打印精度与保真度。

3.      LL3DBP能够打印超过90%体积比的高细胞比例生物墨水，打印结构表现出优异的生物活性。