3D打印Janus异质微球精准控释实现全周期调控骨再生

184 A Janus Microsphere Delivery System Orchestrates Immunomodulation and Osteoi.pdf

据统计，全球每年骨移植手术量约200万例，尽管自体骨及同种异体骨移植具有良好的骨再生效果，但由于存在供区并发症及供体来源限制等问题，仍有90%以上的手术需借助骨移植材料完成，因此，目前临床对骨移植材料具有庞大的需求。由于天然骨组织以磷酸钙为主体成分，因此现有骨替代品主要以磷酸钙基材料为主，通过将钙磷原料直接供给缺损区，实现骨引导作用。然而，文献表明，该类磷酸钙基材料植入体内后，并非直接与受区融合成骨，而是通过降解再成骨的方式促进骨再生，同时，其降解率较低，长期的空间占位也影响了新骨的有效重建。因此，这种以成熟骨组织的主要化学成分作为骨替代品的主要成分的Top down策略存在成骨效率低、影响新骨的高效再生等缺点。

基于此，浙江大学医学院附属口腔医院谢志坚教授、石珏医师团队与浙江大学机械工程学院贺永教授团队合作，通过解析骨再生序列事件，研发设计了通用型Janus异质微球控释系统，通过精准调控异质微球的释放行为，靶向骨愈合过程中多个生物学事件，从而实现全周期高效促进骨再生，相关研究“A Janus Microsphere Delivery System Orchestrates Immunomodulation and Osteoinduction by Fine-tuning Release Profiles”以封面文章发表于Small杂志（DOI: 10.1002/smll.202403835），浙大附属口腔医院博士生史洋及硕士生顾静怡为共同第一作者。

研究人员通过深入剖析骨愈合的多个生物学事件，包括炎症期、修复期、矿化期等，采用性能高度可调的甲基丙烯酰化明胶实现对临床常用生物活性分子骨形态蛋白-2（BMP-2）及磷酸钙材料（CPO）的精准控释，以最简单的“配方”实现对复杂生物学过程的按需调控，该Bottom up（自下而上）再生调控策略（靶向骨再生系列生物学事件设计骨替代品）为临床骨替代品的革新提供了新思路。

基于Bottom up再生理念的Janus异质微球控释系统

1.     Janus异质微球控释系统的设计与制造

研究人员选用性能高度可调的GelMA水凝胶作为Janus异质微球控释系统的主体成分，通过调控GelMA的取代率，实现对双重生物活性成分（BMP-2和CPO）的精准控释。载活性成分的不同取代率GelMA基墨水均具有理想的流变性能（图1 A、B），为高精度投影式光固化3D打印制造提供了前提条件。在软件中设计Janus形态的异质微球后（图1 C），利用EFL的光固化打印机成功构建了粒径约为1 mm的Janus异质微球（图1 D-F），该微球具备理想的可注射性能（图1 G、H），有助于严密填充复杂形态的骨缺损。

图1. Janus异质微球的设计与制造

2.     Janus异质微球的理化性能探索

Janus异质微球表面完整，呈微纳级多孔状微结构（图2 A），含CPO的一侧微球能检测到钙元素分布（图2 B），表明投影式光固化3D打印技术能实现微球双相成分的精准制造。傅里叶红外结果进一步表明CPO与GelMA之间存在化学结合力（图2 C），这为精准控释CPO提供了前提条件。将不同取代率的GelMA水凝胶分别负载BMP-2及CPO，实现了对双重活性成分的灵活控释，低取代率GelMA能快速释放因子，而高取代率GelMA则具有可控的释放性能（图2 D、E），同时，其控释行为也一定程度受到该系统的整体降解及溶胀性能的调控（图2 F、G）。

图2. Janus异质微球的理化性能探索

3.     Janus异质微球实现精准免疫调控

各组Janus异质微球与巨噬细胞RAW264.7共培养后，早期高浓度钙离子的释放（Fast组）将驱使巨噬细胞向M1表型极化，而低浓度缓慢释放CPO（Delayed组和Sequence组）则能促进M2型巨噬细胞分化（图3 A-F），抑制促炎因子TNF-a，并促进抗炎因子IL-10的分泌（图3 G）。RNA-seq结果进一步提示，该免疫调控过程可能通过激活JAK-STAT信号通路，优化了骨免疫微环境，加速了血管化及矿化过程（图3 H-L）。

图3. Janus异质微球的免疫调控能力

4.     Janus异质微球靶向调控骨再生序列事件

各组Janus异质微球与骨髓间充质干细胞BMSC共培养后，各组细胞增殖及活性良好（图4 A、B），负载双因子的Janus异质微球的成骨活性显著高于无因子负载的纯GelMA组（Control组），特别地，Fast组和Sequence组表现出最为优异的成骨潜能（图4 C-I），这可能与初期相对高浓度释放BMP-2有关，同时，持续缓慢的CPO释放也为晚期矿化过程提供了充足的钙磷原料。RNA-seq结果进一步提示，Sequence组能上调愈合过程中早期、中期及晚期成骨相关基因（图4 J），激活骨再生序列事件中的多个生物学行为及信号通路（图4 K、L），实现对骨修复过程的全周期调控。

图4. Janus异质微球的成骨性能

5.     Janus异质微球通过优化体内骨免疫微环境实现高效骨再生

为进一步评估Janus异质微球的体内免疫调控及促骨再生行为，研究人员首先将各组微球植入至大鼠皮下，术后3、7天后，进行巨噬细胞免疫荧光染色，结果显示，所有组别中均存在不同程度的巨噬细胞（F4/80+）包裹，与体外结果一致的是，早期低浓度释放CPO的Delayed组和Sequence组，具有较高比例的F4/80+CD206+细胞，而Fast组中微球周围则出现大量的F4/80+CD86+细胞，这意味着Janus异质微球的不同控释行为能精准调控体内免疫微环境，持续低浓度钙离子的释放有助于创造利于成骨的抗炎微环境（图5）。将各组微球植入至大鼠颅骨缺损后，Sequence组实现了最高效的骨愈合，术后8周后在微球间观察到大量的新生骨，较其他组别更为成熟，且有完整的骨桥连接，这一现象得益于BMP-2在微球控释系统的高效按需释放，及CPO的持续性释放，既有利于早期免疫调控，也为晚期的骨基质矿化成熟提供了有利条件。

图5. Janus异质微球的体内免疫调控能力

图6. Janus异质微球的体内成骨能力的影像学评估

图7. Janus异质微球的体内成骨能力的组织学评估

综上，该项工作基于Bottom up骨修复理念，通过采用性能高度可调的GelMA水凝胶，实现对双重活性成分的灵活控释，靶向骨再生序列阶段，完成高效骨修复。该策略充分挖掘了GelMA水凝胶固有的理化性能，实现对复杂生物学过程的精准调控，过程中无更多化学成分的添加，为通用性绿色载药控释平台的构建提供了新思路，也为临床转化提供了优良的前提条件。

原文链接：https://doi.org/10.1002/smll.202403835