CRISPR-Cas系统广泛存在于细菌和古细菌中，是原核生物的一种适应性免疫系统，用来抵御病毒、质粒等外源核酸的侵入。CRISPR-Cas系统免疫机制分为3个阶段：适应，表达和干扰。2013年，研究人员发现ICP1噬菌体也携带了CRISPR-Cas系统[1]，这是首个发现的噬菌体来源的CRISPR-Cas系统。ICP1 CRISPR-Cas系统相较于细菌CRISPR-Cas系统，最明显的区别是ICP1系统中的Cas8f亚基缺失了螺旋束结构域（helical bundle domain,HB），而在细菌CRISPR-Cas系统中，Cas8fHB负责招募Cas2/3核酸酶结合到Csy以及靶DNA上以降解靶DNA[2]。在ICP1 Cas8f缺失HB的情况下，ICP1 CRISPR-Cas系统如何招募Cas2/3降解靶DNA一直悬而未决。而Cas1作为首个被鉴定出的Cas基因，长久以来一直被认为只参与CRISPR-Cas系统免疫机制的第一个阶段——即适应阶段，没有报道显示其可以在其他两个阶段发挥功能。

在本研究中，冯越课题组通过结构生物学、生物化学和噬菌体学等多种手段阐明了ICP1CRISPR-Cas系统复合物全新的招募Cas2/3的分子机制。首先，他们发现ICP1 Cas1可以结合ICP1 Csy或Csy-dsDNA复合物，而铜绿假单胞菌的Cas1不能结合其Csy或Csy-dsDNA复合物；其次，ICP1Cas1-Cas2/3复合物结合ICP1 Csy-dsDNA后，可以形成稳定的Csy-dsDNA-Cas1-Cas2/3复合物，冯越课题组和杨茂君课题组合作解析了该复合物的冷冻电镜结构（图1）。该复合物中，Cas1-Cas2/3复合物位于中心，两侧各结合一个Csy-dsDNA复合物，形成一个异源24聚体，总分子量约1 MDa，这也是首个I-F型CRISPR-Cas系统结合Cas2/3的复合物结构，而铜绿假单胞菌Cas1-Cas2/3结合其Csy-dsDNA后，Cas1会逐渐从Cas2/3解离下来，最终只能形成Csy-dsDNA-Cas2/3复合物[3]；最后，通过对复合物结合界面分析后，冯越课题组设计了一系列破坏Cas1和Cas2/3与其它亚基结合的突变体，用于体内和体外的活性实验。结果表明，ICP1 Cas2/3只有在Cas1存在时，才能更好的降解Csy复合物靶向的DNA，而铜绿假单胞菌Cas1几乎不影响Cas2/3降解靶DNA。结合以上结果，冯越课题组提出了ICP1 CRISPR-Cas系统由Cas1招募Cas2/3进行靶DNA降解的新机制（图1）。

图1ICP1 I-F型CRISPR-Cas系统干扰机制

综上，Cas1在ICP1CRISPR-Cas系统中通过连接Csy复合物和Cas2/3来介导靶DNA的切割。这一发现展示了ICP1Cas1在干扰阶段的关键作用，打破了长久以来认为其仅在适应阶段发挥作用的传统观点。

清华大学张来幸博士、北京化工大学王浩博士、清华大学曾建伟博士、北京化工大学曹雪利博士和已毕业硕士生高政宇为研究论文的共同第一作者，北京化工大学冯越教授，张怡副教授与清华大学杨茂君教授为该文的共同通讯作者。清华大学王佳伟教授为蛋白质结构解析提供指导。北京化工大学冯越、王浩为研究简报的作者。

相关论文信息：

https://www.nature.com/articles/s41589-024-01659-5

https://www.nature.com/articles/s41589-024-01667-5

面对细菌CRISPR-Cas等多种免疫系统带来的生存压力，噬菌体进化出一系列以Anti-CRISPR（Acr）蛋白为代表的反制手段来对抗细菌，关于噬菌体对细菌CRISPR-Cas免疫系统抑制机制的研究可为基于CRISPR-Cas系统的基因编辑技术带来天然的调控工具。冯越课题组近年来开展了关于噬菌体对细菌CRISPR-Cas免疫系统抑制机制的系统性研究，先后阐明了噬菌体七种Acr蛋白、可同时抑制细菌CRISPR-Cas和CBASS系统的Acb2/Tad1/Tad2蛋白以及噬菌体CRISPR-Cas系统的工作机制，相关论文发表在Nature、Cell、Mol Cell (×3)、Nat Chem Biol(×2)、PNAS、Nat Commun (×2)、Nucleic Acids Res等期刊。课题组长期招收博士后及博硕士研究生，热忱欢迎生物医学领域青年才俊加盟。

参考文献

[1] SEED K D, LAZINSKI D W, CALDERWOOD S B, et al. A bacteriophage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity [J]. Nature, 2013, 494(7438): 489-491.

[2] ROLLINS M F, CHOWDHURY S, CARTER J, et al. Structure Reveals a Mechanism of CRISPR-RNA-Guided Nuclease Recruitment and Anti-CRISPR Viral Mimicry [J]. Mol Cell, 2019, 74(1): 132-142 e135.

[3] ROLLINS M F, CHOWDHURY S, CARTER J, et al. Cas1 and the Csy complex are opposing regulators of Cas2/3 nuclease activity [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2017, 114(26): E5113-E5121.

编辑 |余 荷

排版| 王大雪

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