一、研究背景

植物同源多倍体化和异源多倍体化过程中都可以检测到不同程度的表观遗传变化，例如DNA甲基化和组蛋白修饰。目前遗传和表观遗传变化的研究多集中于在基因表达和蛋白质丰度的变化，这并不能很好地解释多倍体化过程中出现的表型变化。多倍体化是否影响蛋白质的翻译后修饰（PTM）仍然是一个未决问题。

乙酰化调节蛋白质的结构和功能，可以影响蛋白质的稳定性、酶活性、蛋白质与蛋白质之间的相互作用、蛋白质与DNA之间的相互作用、亚细胞定位以及与其他PTMs之间的串扰。柑橘的多倍体化会带来理想的新性状。然而，多倍体柑橘中产生这些新果实性状的机制在很大程度上是未知的。该研究确定了柑橘异源四倍体化过程中果实性状的建立与赖氨酸残基乙酰化的变化之间是否存在关系。

二、技术手段

实验材料：柑橘异源四倍体 "NH "。该四倍体来源于一个名为 "Nova "的二倍体柚（Citrus clementina hort. ×[Citrus paradisi Macfad. × Citrus reticulata Blanco])和二倍体柚"HBP"(Citrus grandis Osbeck) 。

该研究采用TMT标记的定量乙酰化修饰组学技术，对该异源四倍体杂种及其双亲果肉组织进行分析。通过对过表达沉默信息调节因子2（CgSRT2）和组蛋白去乙酰化酶8（CgHDA8）的转基因柑橘愈伤组织和赖氨酸去乙酰化酶（KDAC）抑制剂处理的柑橘果肉的代谢谱分析揭示了KDACs在调控果实代谢中的重要作用。此外，对过表达沉默信息调节因子2（CgSRT2）和组蛋白脱乙酰酶8（CgHDA8）和赖氨酸脱乙酰酶（KDAC）抑制剂处理的柑橘果肉的转基因柑橘愈伤组织进行代谢分析，揭示了KDAC在调节果实代谢中的重要作用。

三、主要结果

该研究通过基于质谱的蛋白质组学分析，量化异源四倍体及其二倍体亲本果肉中特定乙酰化位点的蛋白质丰度和赖氨酸乙酰化水平（Kac）。

使用抗-Kac抗体从这三种基因型提取的蛋白质中检测到大量乙酰化（图1 B）。通过进行蛋白质组分析，并结合串联质量标签（TMT）蛋白质标记。总共鉴定出4,115个含有乙酰化赖氨酸残基的肽段，对应于1,640个蛋白质组中的4,175个特异性Kac位点（图1 C），占被检测蛋白质的25.5%。在柑橘果实的乙酰化蛋白质中，有助于初级代谢（如碳水化合物、能量和氨基酸代谢）的蛋白质所占比例过高（补充图S2 B）。鉴定这些乙酰化位点将为研究对果实品质和其他重要农艺性状有贡献的蛋白质的调控提供一种新的方法。

图2  柑橘类水果中赖氨酸乙酰基组的表征。A, 用于乙酰基组分析的柑橘果肉（果汁囊）（180 DAF）。比例尺= 1 cm。B, 使用抗乙酰-赖氨酸（抗-Kac）抗体（左）对果肉中的赖氨酸乙酰化蛋白进行Western印迹分析。C, 来自柑橘和两个已发表数据集的赖氨酸乙酰化（Kac）位点和乙酰化蛋白质的数量，这两个数据集来自拟南芥。D、柑橘、拟南芥和水稻中每个乙酰化蛋白乙酰化位点的比较（Kruskal-Wallis检验，***P < 0.001）。E、柑橘和拟南芥不同代谢途径中每个乙酰化蛋白的乙酰化位点比较（Kolmogorov-Smirnov检验，ns，不显著；*P < 0.05；**P< 0.01）。F,柑橘果实中具有乙酰化赖氨酸残基的蛋白质的亚细胞定位预测分布。G, 显示柑橘、拟南芥和水稻同源乙酰化蛋白重叠的维恩图。H,柑橘特异性乙酰化蛋白的KEGG富集分析（Fisher精确检验，P < 0.05）

​补充图S2 柑橘中赖氨酸乙酰组的分析。A, 乙酰化组数据集之间的Pearson相关系数。B, 含有乙酰化赖氨酸残基的蛋白质的KEGG通路富集分析（Fisher's exact test, **p < 0.01）。括号中表示乙酰化蛋白质/位点的数量。括号内为乙酰化蛋白质/位点的数量。C,乙酰化(Acetyl)或非乙酰化(Non-Acetyl)赖氨酸残基在柑橘和8种水果蛋白质中保留的百分比。蛋白质中赖氨酸残基的保留百分比。Fisher's exact检验计算P值。D, 对柑橘、拟南芥（5周龄叶片）和水稻（14天龄幼苗的叶片）之间保守的120个乙酰化蛋白的KEGG富集分析（Fisher's精确检验，*p < 0.05）。括号中表示乙酰化蛋白质/位点的数量

NH异源四倍体与HBP和Nova具有同样的差异。该研究结果表明，在亲本之间和/或NH异源四倍体与两个亲本（Nova-NH-HBPdif）之间，共有838个蛋白质中的1,064个Kac位点的赖氨酸乙酰化受到不同调控。

将不同基因型（Nova-NH-HBPdif）中乙酰化水平不同的1,064个Kac位点分为12个区。乙酰化水平优势（ALD）被定义为乙酰化水平仅等于亲本之一的Kac位点或乙酰化蛋白。该研究将乙酰化水平比亲本高或低的Kac位点或乙酰化蛋白称为过乙酰化。具有过高乙酰化的蛋白质主要与核糖体相关。相比之下，过低乙酰化的蛋白质具有多种功能（补充图S3，C和D）。

补充图S3 NH异源四倍体与其两个亲本的乙酰化组比较分析。A和B, NH异源四倍体和两个二倍体亲本中不同乙酰化位点(A)和蛋白质(B)的数量。括号内为数字和百分比。C和D, 转基因乙酰化蛋白的GO富集（C）和KEGG通路（D）分析。(Fisher's exact test, p < 0.05）。括号内为蛋白质数量

定量乙酰化数据显示，参与柠檬酸生物合成的蛋白质的乙酰化水平在NH异源四倍体和HBP中相似，但明显高于Nova（图3，D和E）。研究表明，柑橘果实中柠檬酸积累的关键是利用，而不是调控有助于生物合成的酶（PEPC和CS）和基因。因此，这两种酶的乙酰化水平对柠檬酸积累的影响可能有限。

图3 NH异源四倍体中亲本赖氨酸乙酰化优势与果实酸度（柠檬酸含量）的关系。A, NH异源四倍体中具有HBP亲本ALD（ALD-HBP）的Kac位点和乙酰化蛋白的数量。B和C, ALD-HBP蛋白的KEGG通路(B)和GO富集(C)分析(Fisher's exact test, P < 0.05)。D，热图显示了有助于柠檬酸代谢的蛋白质的乙酰化水平。E, NH异源四倍体及其二倍体亲本中与柠檬酸代谢相关的蛋白质的全局乙酰化水平（Kruskal-Wallis检验，*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, "ns "表示无显著差异）。F，定点突变对GS2和NADP-IDH1活性的影响

NH异源四倍体的总黄酮醇含量与Nova亲本相似，显著高于HBP亲本（图4C）。FLS是黄酮醇生物合成的关键酶。FLS是ALD-Nova蛋白之一。在NH异源四倍体和Nova亲本中发现两个Kac位点（K121和K127）乙酰化水平相似，但比HBP亲本低得多（图4D和补充表S1）。这些数据表明，NH异源四倍体和Nova亲本中较高水平的黄酮醇积累与CgFLS的赖氨酸乙酰化水平密切相关。

图4 亲本赖氨酸乙酰化优势与NH异源四倍体中黄酮醇含量相关

NH异源四倍体的过高乙酰化位点和蛋白质（154/104）多于过低乙酰化位点和蛋白质（94/81）（图5，A和B）。具有过高乙酰化的蛋白质主要与核糖体相关。相比之下，过低乙酰化的蛋白质具有多种功能（补充图S3，C和D）。

四、结论

该研究通过利用蛋白质乙酰化修饰定量分析技术，研究了柑橘异源多倍体化过程中果实性状的建立与乙酰化组的重编程之间的关系。

结果表明：(a)相对于二倍体亲本和中间亲本，异源四倍体中有相当比例的乙酰化蛋白被不同程度地乙酰化；(b)亲本ALD通过调节酶活性与异源四倍体果实性状的形成密切相关；(c) 异源高乙酰化降低了蛋白质的稳定性，导致异源四倍体蛋白质丰度降低；(d) CgSRT2和CgHDA8等几个KDAC的基因表达可能是异源多倍体化过程中乙酰基组重构的原因；(e) CgSRT2和CgHDA8的过表达部分恢复了异源多倍体化过程中形成的代谢性状。

编辑：P.SH

审核：Tao Li

参考文献

Zhang M, Tan FQ, Fan YJ, Wang TT, Song X, Xie KD, Wu XM, Zhang F, Deng XX, Grosser JW, Guo WW. Acetylome reprograming participates in the establishment of fruit metabolism during polyploidization in citrus. Plant Physiol. 2022 Nov 28;190(4):2519-2538.