一、研究背景

泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬是真核生物蛋白质质量控制的两个主要途径。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，遗传分析表明，ATG基因失活会导致常规的自噬缺陷表型。在自噬机制中，ATG1-ATG13蛋白激酶复合物是一个严格控制的激酶调节器，它启动自噬体的形成。

磷酸化和泛素化等翻译后修饰通过调节ATG1-ATG13复合体组分的活性或稳定性，在自噬调控中发挥关键作用。在诱导自噬时，去磷酸化的ATG13蛋白与ATG1激酶相互作用，增加它们与拟南芥中附属蛋白亚基ATG11和ATG101的亲和力。有研究发现RING型E3 Ub连接酶蛋白家族成员SEVEN IN ABSENTIA OF ARABIDOPSIS THALIANA (SINAT)通过调节ATG13的蛋白水解，不同程度地调节ATG1-ATG13复合物的稳定性，从而帮助调节自噬。这些结果表明，与哺乳动物一样，拟南芥ATG1-ATG13复合物成分的活性和稳定性在自噬体形成过程中受到磷酸化和泛素化的强烈影响。然而，泛素化和磷酸化之间相互作用调节自噬动力学的分子机制在很大程度上仍然未知。二、研究结果

为研究SINATs的调控网络，该研究通过免疫沉淀和质谱分析（IP-MS）筛选了SINAT1的相互作用蛋白。除了34个主要与蛋白质降解系统相关的候选蛋白外14-3-3蛋白家族的4个成员14-3-3λ(也被命名为General Regulatory Factor 6 [GRF6])、14-3-3κ(GRF8)、14-3-3φ(GRF4)和14-3-3χ(GRF1)可能与SINAT1相互作用(图1 A)。

通过在体共转染相关载体的WT拟南芥原生质体细胞中用抗HA抗体进行体内免疫共沉淀（Co-IP）检测来证明（图1 B），证实了14-3-3λ和14-3-3κ与融合了绿色荧光蛋白（GFP）并带有HA标签的SINAT1和SINAT2的相互作用。该研究还利用双分子荧光互补（BiFC）分析确认了拟南芥细胞中14-3-3λ或14-3-3κ与SINAT1或SINAT2之间的相互作用。结果表明，14-3-3λ和14-3-3κ在体外和体内与SINAT1和SINAT2形成蛋白复合物。

图1. SINATs在体内与14-3-3λ和14-3-3κ蛋白相互作用

该研究通过IP-MS分析筛选拟南芥中14-3-3蛋白的互作蛋白。自噬相关蛋白ATG13a和ATG13b与14-3-3λ存在相互作用，这表明14-3-3可能调控ATG1-ATG13激酶复合物。该研究通过酵母双杂交实验证实14-3-3λ和14-3-3κ与ATG1a、ATG1b、ATG1c、ATG13a和ATG13b相互作用，它们是ATG1-ATG13复合体的成员（图2 A）。

免疫印迹分析发现，当蛋白提取物与抗HA抗体孵育进行免疫沉淀时(图2 B)，14-3-3λ-FLAG和14-3-3κ-FLAG被ATG13a-HA、ATG13b-HA、ATG1a-HA、ATG1b-HA和ATG1c-HA免疫沉淀，而不被对照ATG7-HA免疫沉淀。该研究还通过BiFC实验证实了ATG1s和ATG13s与14-3-3λ和14-3-3κ的相互作用（图2 C）。

为了独立验证14-3-3λ/κ与ATG1/ATG13蛋白之间的直接关联，该研究通过体外Pull-Down实验发现GST-14-3-3λ和GST-14-3-3κ可以拉下MBP-ATG13a-HIS(图2 D)。GST没有拉低MBP-ATG13a-HIS(图2 D)。研究结果表明14-3-3λ和14-3-3κ很可能通过与ATG1-ATG13蛋白复合物直接结合参与自噬。

图2. 14-3-3λ和14-3-3κ与ATG13a发生物理相互作用

Co-IP分析显示，ATG13a-FLAG和14-3-3λ-FLAG均被GFP-SINAT1-HA免疫沉淀，但在14-3-3λ-FLAG存在的情况下，ATG13a-FLAG被免疫沉淀的量更多(图3 A )，表明14-3-3λ和14-3-3κ参与介导SINAT1与ATG13a的相互作用。

在用抗HA抗体免疫沉淀ATG13a-HA和用抗Ub抗体检测后，观察到14-3-3λ14-3-3κ双突变体中ATG13a-HA的泛素化水平显著低于WT，并且伴随着双突变体中ATG13a-HA的积累量显著高于WT(图3 B )。

为确定SINATs对ATG13a丰度的影响，将ATG13a-HA和SINAT1-FLAG构建载体共转染到WT和14-3-3λ14-3-3κ双突变莲座丛分离的原生质体中。SINAT1-FLAG增加了WT 野生型ATG13a-HA泛素化的水平（图3 C）。此外，该研究发现瞬时转染SINAT1-FLAG可以诱导WT原生质体中ATG13a-HA的降解，而在14-3-3λ14-3-3κ双突变体(图3 D)制备的原生质体中，ATG13a-HA的降解受到了抑制。

免疫印迹分析发现，在缺C和缺N条件下，与WT相比，14-3-3λ14-3-3κ双突变体中ATG1a和ATG13a积累到更高水平(图3 E)。作为对照，在相同条件下，14-3-3λ14-3-3κ双突变体中ATG7水平相对于野生型没有变化(图3 E)。以上结果表明，14-3-3λ和14-3-3κ在调节ATG13a稳定性中起主要作用的观点。

图3. 14-3-3s与磷酸化的ATG13a相互作用，调节ATG13a降解和ATG1a-ATG13a复合物的形成

如图4 A所示，ATG13a18A变异体降低了ATG13a与14-3-3λ之间的相互作用，而ATG13a18D变异体增加了它们之间的相互作用。免疫印迹显示，与MBP-ATG13a-HIS相比，MBP-ATG13a18D-HIS和MBP-ATG13a18A-HIS变体分别或多或少地下调了GST-14-3-3λ蛋白，证实了体内Co-IP数据(图4 A)。这些结果表明，在体外和体内，14-3-3蛋白主要与磷酸化形式的ATG13a相互作用。为了证实ATG13a磷酸化对其泛素化和稳定性的影响，该研究将ATG13a-HA、ATG13a18A-HA或ATG13a18D-HA瞬时转染WT或14-3-3λ14-3-3κ双突变体植株制备的原生质体。免疫印迹分析表明，在WT原生质体中，ATG13a18A泛素化水平降低，而ATG13a18D泛素化水平升高(图4 B)，表明14-3-3λ和14-3-3κ可能以磷酸化依赖的方式参与调控SINAT介导的ATG13a的降解。用抗HA抗体进行Co-IP后，该研究检测到转染ATG13a18D-HA的原生质体免疫沉淀中ATG1a-FLAG的水平低于表达ATG13a-HA的原生质体(图4 C)。这些结果表明14-3-3s与磷酸化ATG13a的结合对于ATG1-ATG13复合物的形成至关重要。

图4. 14-3-3s与磷酸化的ATG13a相互作用，调节ATG13a的降解和ATG1a-ATG13a复合物的形成

三、结论

该研究证明了两种拟南芥调节蛋白14-3-3λ和14-3-3κ通过促进ATG13a和ATG13b的SINAT介导的蛋白分解，冗余地调节自噬动力学。14-3-3λ和14-3-3κ在体外和体内与SINATs和ATG13a/b直接互作。在差异营养条件下，14-3-3蛋白质与磷酸化的ATG13a的特异性关联充当维持ATG1-ATG13复合物和自噬体形成的分子开关。

该研究揭示了E3泛素连接酶SINAT家族蛋白通过介导植物自噬发生过程中ATG1-ATG13蛋白激酶复合体泛素化修饰和蛋白质稳定性，动态调控植物自噬发生的起始与终止，影响植物姿势发生的分子机制，具有重要的科学意义。

编辑：P.SH

审核：Tao Li

参考文献：

Qi H, Lei X, Wang Y, Yu S, Liu T, Zhou SK, Chen JY, Chen QF, Qiu RL, Jiang L, Xiao S. 14-3-3 proteins contribute to autophagy by modulating SINAT-mediated degradation of ATG13. Plant Cell. 2022 Nov 29;34(12):4857-4876.