最近半年，我们在跟国内外众多医药企业交流的过程中，发现有些朋友在免疫学基础知识，或是模式动物设计，品系选择方面了解的不是很全面，可能会让一些人走一些不必要的弯路。这里，我结合百奥赛图多年的模式动物制备经验，以及我自己的一点免疫学知识，给朋友做一点小科普。希望对大家有点用。

       BMS和Merck药厂PD-1抗体药物的上市，将肿瘤免疫，尤其是免疫检查点抗体药物的研发带进了一个新纪元。肿瘤免疫治疗是国内外众多药企积极投入的一个热门领域。预计将来70％以上的肿瘤可以通过抗体药物得到治愈。与此同时，中国医药企业有可能在肿瘤免疫抗体药物研发领域实现弯道超车。

       与小分子药物不同，抗体药物研发由于靶点明确，研发过程更有方向性和可控性。联合用药以及双特异性抗体研发在今后5年会非常热闹且竞争激烈。由于免疫检查点抗体药物是通过调节免疫系统进行肿瘤治疗，所以，动物体内实验是验证和评价这类药效的最佳途径，尤其是联合用药及双特异性抗体药物药效评价。

       在选择体内药效评价模型方面，小鼠无疑是最常用的动物模型。首先，小鼠的繁殖快，可以快速得到有统计学意义的同周龄、同性别、且足量的小鼠；第二，有足够多的近交系小鼠肿瘤细胞系可以使用；第三，容易建立较稳定的动物－肿瘤模型体系，建立标准化的药效评价平台。

       然而，通过比较可以发现，普通小鼠的免疫检查点基因与对应的人类基因之间，在蛋白氨基酸序列上同源性一般在60%左右。所以，一般情况下识别人蛋白的抗体，并不识别小鼠相应基因蛋白。也就是说，我们一般不能用普通小鼠来评价抗人蛋白抗体的药效。这就需要对小鼠的免疫检查点基因进行人源化改造。比如，将小鼠的PD1基因胞外部分换成人的对应部分（见下图）。可以看到，人源化之后的小鼠可以用来做anti-human PD1抗体的药效评价。

       那么，在开发免疫检查点人源化小鼠的时候，需要注意些什么呢？

       1）小鼠品系：这个是首先要考虑的。这个可以根据我们将来用什么肿瘤细胞系做研究，来决定采用什么品系的小鼠来做基因人源化。比如我们要用MC38、B16F10、LLC1等C57BL/6遗传背景的肿瘤细胞系，就一定要在C57BL/6遗传背景的小鼠上做基因改造。（这个大家可以理解，这与配型不对的人之间不能做器官移植是一个道理）。

       这个稍微提一下的是，如果用胚胎干细胞(ESC)来打靶的话，一定要用纯系C57BL/6遗传背景的ESC来打靶。如果用129或129/B6背景的ESC做打靶，就需要用C57BL/6小鼠来回交10代以上，否则实验结果会很不稳定。 肿瘤细胞在这种小鼠上接种之后，即使不做抗体处理，肿瘤生长曲线也会是钟型，也就是说到后期会缩下来。而且个体之间肿瘤生长曲线差异很大。而用纯系的C57BL/6做的人源化小鼠，肿瘤会越长越快，直到小鼠不能承受。而且不同个体之间肿瘤生长曲线较一致。

       2）设计考虑：在设计的时候，需要考虑信号传递（signal transduction)。对于免疫细胞，信号传递包括蛋白受体胞外部分与配体结合、通过穿膜区与其它蛋白聚合形成复合物、以及通过胞内区的特定domain(ITAM, ITAM等)跟下游蛋白进行结合并输送信号等。为了不影响目标蛋白的信号传递，我们的default设计一般是只替换胞外部分，而保留小鼠基因的穿膜区和胞内区。

       我们的default打靶方案一般是在基因组上直接替换，而不建议将人基因的cDNA（或人鼠嵌合cDNA)插入到小鼠的起始密码子ATG的位置。因为我们发现这种方式有很大概率蛋白表达水平太低或没有表达，同样造成实验结果的不稳定。

       3）双敲进小鼠：联合用药以及双特异性抗体药效评价会非常依赖于双基因敲进小鼠。如果两个基因不在同一条染色体上，我们一般先分别进行打靶，然后再将单基因敲进人源化小鼠进行交配，得到双人源化小鼠。在这个过程中，一定要验证每一个单基因人源化小鼠是正确而有功能的。制备双基因人源化小鼠，在小鼠品系的选择上将更加关键。如果采用CRISPR方法在C57BL/6上做打靶，一般不会有什么问题。但是，如果利用ESC来做打靶，需要特别注意的是ESC的遗传背景一定是C57BL/6。否则漫长的回交过程需要几年时间。如果任何一个单人源化小鼠的回交代次不够，就会使得双人源化小鼠的遗传背景更加混乱，实验结果更加不稳定。