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第二代测序技术原理精讲

已有 9472 次阅读 2022-11-25 18:57 |系统分类:科研笔记

（一）文库(library)构建

1. 末端修复（3‘末端添加碱基A）

建库第一步是使用Taq聚合酶补齐不平的断裂末端，并在两个末端添加突出的碱基A，从而产生粘性末端（若使用Taq酶扩增，则无需末端修饰），产生粘性末端的片段可以添加接头（adaptor）。

2. 添加接头

经过末端修饰后的PCR片段末端具有突出的A尾，而接头具有突出的T尾，可以使用连接酶将接头添加到DNA片段两端。

adaptor含有碱基U连接的环状结构。还需要将碱基U删除从而形成“Y”形接头。每一端接头是两条不互补的序列（每一端都是Rd1 SP与Rd2 SP交错）。

3. 磁珠纯化

添加接头后的文库体系中含有聚合酶、连接酶等各种酶以及辅助物质，接头的添加也是过量的，而且由于末端的不稳定性，容易形成自连片段，鸟枪法打断的片段中也可能有大片段存在，所以需要特殊磁珠（AMPure XP Beads）纯化来去除大片段以及各种杂质，从而获得成功添加接头的文库片段。其原理为磁珠可以通过氢键等作用力来吸附DNA片段，磁珠本身不具有片段大小选择的能力，但其储存的buffer里面含有20%的PEG 8000，PEG浓度越大则可以吸附的DNA片段越小。因此磁珠纯化的时候要根据文库片段不同严格控制磁珠添加量（其实是PEG添加量）来实现片段选择。

4. PCR扩增

添加了接头的DNA片段，可以使用与接头互补的引物来扩增。这个过程非常重要，因为目前所有片段其两端是不互补的Y形结构，不能直接进行测序；此外，片段还需要添加用于区分不同文库的特异性index，以及与测序仪芯片互补的两种寡核苷酸序列（P5/P7）。

5. 第二次磁珠纯化

PCR后需要将产物DNA片段与聚合酶等杂质分离，因此再次进行磁珠纯化，之后进行质量检测，包括DNA浓度检测、琼脂糖凝胶电泳和片段长度检测，完成建库。

第2，4步骤过程详见下图：

建库完成后的每条DNA的单链均一端连有测序引物Rd1SP、Index2和P5；

另一端为Rd2SP、Index1和P7。

（二）上机测序

1. 以寡核苷酸为引物、文库片段为模板进行DNA复制

因为文库稀释后浓度足够低，可以认为文库片段均匀的结合在流通池表面，每个片段结合的位置相距足够远（即每条文库模板有足够的成簇空间），这很重要，否则测序时会导致信号叠加而不能识别。复制完成后解链，将文库片段洗去，留在流通池表面的为与文库模板互补的DNA序列。

2. “桥”式扩增成簇(cluster)

假如第1步结合的为寡核苷酸链P5’，则复制完成洗脱模板后顶端可以与相邻的寡核苷酸链P7互补结合形成“桥”，并以寡核苷酸链P7为引物进行复制，完成后再次解链并与相邻不同种接头结合来进行复制，如此类推，过程如下图。25-28个循环完成后，原来散布在表面的单核苷酸序列变成散布的DNA簇，这一步主要是为后续测序做准备，因为测序时单分子产生的光信号很弱，难以检测。

3. 测序要保证每个片段一致性（都是正向或都是反向），切割并洗去P5’上的DNA链，只留P7上的DNA单链。

Illumina巧妙地利用了甲酰胺基嘧啶糖苷酶Fpg对8-氧鸟嘌呤糖苷8-oxo-G的选择性切断作用，在合成的引物链上加入了一个8-oxo-G，用Fpg处理，就把带8-oxo-G基团切掉，并把DNA链切断，留下一带不完整糖基的磷酸基。这个磷酸基在接下来的过程中，起到了阻止P5’延伸的作用。此后的双末端测序中需要恢复3'-OH，则用脱嘌呤嘧啶内切核酸酶AP-endonuclease把带不完整糖基的那个磷酸基切掉。

4. 加入测序引物Read1 SP（Read1测序引物结合位）和修饰过的DNA聚合酶，则在测序引物3’端开始DNA复制。

在流通池加入可逆终止荧光dNTP，其3'-OH被阻隔（糖基3'连接有叠氮基团，在链延伸时起到了阻止添加下一个dNTP作用，因此在除去阻隔前只能添加一个碱基），4种dNTP在碱基上分别连接有不同颜色的荧光基团（也可以相同颜色荧光标记，但是测序会更慢，每次只能添加一种碱基）。之后洗掉多余的dNTP，使用激光扫描，收集留在流通池表面的荧光信号（如图1-6所示）。用巯基试剂去掉3’位阻断的叠氮基团，用TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine,三(2-羧乙基)膦)去掉荧光基团，进入下一个碱基的测序反应。因为每条DNA单链扩增形成的DNA簇均固定在表面，随着反应进行根据相同位置出现的荧光信号情况，就逐渐读出了改位点DNA链的序列。

5. 读取index信息。

Read1测序结束后，解链并洗掉测序中已经合成的部分，加入测序引物Index引物（也即Read2 SP互补的寡核苷酸），这时会继续在3’端进行复制，读出接头中Index序列，从而可以确定出每个DNA簇属于哪个文库。

6. 双末端测序，加入测序引物Read2 SP，进行另一端的序列读取。

洗掉前面复制合成的片段，DNA单链继续在流通池表面形成桥式连接，这时要用脱嘌呤嘧啶内切核酸酶处理修复P5’的3’-OH末端，加入聚合酶，则在P5’末端开始DNA复制。十几个循环后，将P7上的DNA切割并洗掉。Illumina通过在P7核酸链中加入一个U碱基，用USER酶（Uracil Specific Excision Reagent，尿嘧啶链特定切断试剂）来切隔断链。这时只留下P5’上的DNA链，与Read中方向相反。加入测序引物Read2 SP，进行另一端的序列读取。

第4，5，6步骤过程如下：

（三）测序数据

一般我们接触到的测序数据为fastq格式的碱基序列，然而早期Illumina平台直接下机数据为bcl格式文件，其储存的是显微拍摄得到的荧光信号信息，如下所示（此图为不同碱基使用相同荧光标记的扫描结果）。将相同区域不同时间拍摄的荧光图片按照时间顺序叠加处理，就可以获得该位点结合的DNA序列的碱基顺序。

【补充】

基因组DNA 随机打断片段化（DNA Fragment或DNA insert）

DNA 打断方法：机械打断、超声波打断，酶解法打断等。常见的文库长度有 170bp 文库、350bp 文库、500、800、2k、5k、6k 甚至更长的 10K，20K 等，一般 1000bp 以下，称为小片段文库，否则是大片段文库。

注意，我们说 500bp 文库，这个 500 只是一个峰值。也就是里面大部分的片段在 500bp 附近，并不是每条片段都刚好是 500bp，可能有 300, 的，也可能有 800 的。在打断之后会有一个电泳的过程，将在一定范围内的回收。如果是 500bp 文库，可以回收 300-800bp 长度的片段。这个文库大小特别重要，也叫做插入片段长度 insert_size。在后面序列拼接，短序列比对的过程中会大量用到这个值。

鸟枪法：将大分子的目标DNA随机地处理成大小不同的小片段进行测序，并在后续的生物信息学分析中将这些短序列组装成目标DNA的技术方法。

传统方法：使用限制性内切酶对目标DNA上的限制性内切酶识别位点进行切割，从而形成小片段。

常用方法：使用机械法（例如超声波DNA破碎）使大分子DNA形成在一定长度范围内分布的短序列片段。

Adaptor （接头）	包括P5/P7、Index以及R1 SP/R2 SP序列。一般结构呈“Y”字型。“Y”型接头保证了每条单序列两端均为不同的测序引物，从而可以通过后续的PCR扩增形成两端带有不同核苷酸序列（P5/P7）的文库。
	长接头（完整的Y型）和短接头（不完整的Y型接头）。长接头通过TA连接的方式连接到待测DNA片段两端，在文库产量足够的情况下，可不进行PCR扩增直接上机测序；而短接头通过TA连接的方式连接到待测DNA片段两端后，必须使用与短接头互补的Indexing Primers进行PCR扩增成为完整接头后，才能上机测序。
P5/P7	Illumina测序使用的微阵列芯片叫做流通池(flow cell)，其表面固定了无数条寡核苷酸oligo（P5’和P7）,分别可以与P5、P7’互补结合。这样，当样品文库中的DNA单链进入流通池后，就通过其3’端的P5结合到了附着在流通池表面的P5’上。 Flowcell 上随机分布了两种不同的寡核苷酸oligo，分别与 P5 互补（即 P5') , 与 P7 相同（即 P7)。待测 DNA 文库加入后，接头上的 P5 与 flowcell 上的寡核苷酸P5’互补，以待测序列为模板进行互补链（即 reverse strand）的延伸，扩增DNA两端为 P5’和 P7’。
Index或 barcodes(BC)	或者Barcode(BC)，一般6-8bp，用于区分来自不同样本的DNA片段的标签序列就叫做index。 index1和index2也是不同的，与P5相连的是index2（i5），与P7相连的是index1 (i7)。 Index用来区分不同的文库，因为测序仪一个run产生数据量巨大，由于实际情况不同，一次上机常会进行多个文库测序，因此需要加上Index来区分。
Rd1SP/Rd2SP或 SP1/SP2	分别是第一轮测序引物和第二轮测序引物结合位点。双端测序就是从两端相向读取DNA的序列，需要在待测DNA的两端都加上引物了，是Read1和Read2测序引物结合的区域（sequencing primer binding site1/2<测序引物结合位点>）。