摘要

给野生动物和犬接种狂犬病疫苗是控制和预防动物和人狂犬病的唯一有效方法。目前使用的疫苗要么是灭活疫苗(通过注射途径用于家畜狂犬病预防)，要么是减毒活疫苗或生物技术改造的疫苗(通过口服途径用于野生动物狂犬病预防)。为大部分目标群体接种疫苗，以达到群体免疫，从而打破感染链是其目标。需要对最终产品进行质量控制，以保证这些药物在目标群体中是安全、稳定、无菌和有效的。本章回顾了国家监管机构要求的在胃肠外和口服疫苗上市前评估其质量的测试。主要控制集中在疫苗活性上，包括灭活疫苗的效力试验(NIH试验)和口服疫苗的病毒滴度。还重点介绍了在动物试验中应用3R(优化、减少和替代)方法的替代方法。这需要开展国际合作，在控制实验室之间达成协调一致的协议，并在使用前测试所有生产的疫苗批次，以确保结果一致。

介绍

据世界卫生组织统计，全球每年约有60，000人死于狂犬病，其中大部分是儿童，而且几乎完全是在发展中国家。由于狂犬病是一种被忽视的疾病，影响到生活在偏远农村地区的穷人和弱势群体，疾病的负担被低估。狂犬病通过两个主要的流行病学循环在世界范围内出现，一个是犬类循环，其中犬扮演了独特的媒介角色，另一个是森林循环，其中野生食肉动物或蝙蝠是疾病的媒介。如今，狂犬病在犬类中被消灭后，在发达国家的野生动物中仍然存在，在发展中国家的犬类中仍然存在，主要是在非洲和亚洲。

无论狂犬病的起源是什么(例如，家养的还是林栖的动物)，动物对这种病毒性疾病的控制都依赖于群体免疫。事实上，当大部分群体得到有效免疫时，感染链就可以被打破。这种群体免疫为动物提供了充分的保护，包括那些没有产生免疫力的动物(由于疫苗失效或未接种疫苗)。许多国家已经实施了严格的卫生和医疗措施，包括动物疫苗接种计划，以实现控制并最终消除狂犬病。为了有效，这种系统应该提供可靠的信息，以确认目标已经实现，并通过有效的监测网络保持“零检测到狂犬病病例”的状态。从历史上看，野生动物狂犬病的控制已经从简单的扑杀行动演变成一种更全面的方法，包括在卫生和医疗领域使用策略。事实上，野生动物的口服疫苗在20世纪70年代首次被提出作为控制狂犬病的一种方法，因为在实验室条件下进行的第一次遗传实验允许产生具有减毒力的狂犬病毒株。西欧、北欧和中欧的许多国家实施了这种口服疫苗接种计划，成功地控制和消除了野生动物狂犬病。

主动狂犬病免疫是控制人用和动物疾病的唯一有效策略。由于疫苗中所含抗原的复杂性，以及佐剂和其他抗原(用于注射疫苗)以及包裹疫苗悬液的诱饵基质(用于口服疫苗)的潜在内含物，它们的质量可能因批次而异。因此，应要求对这些批次的活性进行评估，以确保保护性免疫水平符合营销授权档案中所展示的内容。

本章介绍了在胃肠外和口服疫苗上市前，用于评估某些质量控制的正在使用或新开发的试验的最新科学状况。

狂犬病疫苗质量标准

兽用疫苗已经被开发出来，用于阻断狂犬病病毒在家养和野生非飞行哺乳动物中的传播，目的是减少人用狂犬病病例。这些疫苗要么是灭活的，要么是减毒的，或者来自生物技术改造的。除了表达狂犬病糖蛋白的金丝雀痘病毒狂犬病疫苗外，所有的胃肠外疫苗都是灭活的，该疫苗可用于猫的免疫接种。口服疫苗要么是减毒活疫苗，要么是生物技术衍生疫苗。

目前兽医用灭活狂犬病疫苗是由巴斯德在1885年使用的原始毒株(巴斯德病毒)或衍生毒株如PM株、标准攻击毒株(CVS)、Flury、SAD等生产的。

口服疫苗目前用于野生动物的疫苗接种。目前的口服疫苗可以是含有减毒活病毒的疫苗或使用表达狂犬病病毒的糖蛋白(G蛋白)的痘苗病毒的重组疫苗。目前使用的所有口服减毒病毒疫苗均来源于在细胞培养中传代后具有不同减毒水平的ERA株和SAD株。然后，开发了其它重组疫苗，例如一种基于人腺病毒载体的疫苗，用于表达狂犬病病毒的G蛋白以接种野生动物，另一种利用犬腺病毒载体作为活狂犬病病毒和糖蛋白，作为口服接种中国犬的保护性抗原。目前在加拿大使用的另一种口服疫苗是狂犬病糖蛋白重组人腺病毒5型口服疫苗，该疫苗是为控制加拿大浣熊种群中的狂犬病而开发的。最近，一种新的口服疫苗被开发用于野生动物免疫。这种新的构建体具有亲本SADB19口服疫苗，含有两个糖蛋白基因，在糖蛋白的194位和333位有两个修饰。这种新疫苗最近在狐狸和貉身上测试了它的免疫原性和免疫效果。口服疫苗被整合到诱饵外壳中，其形状、质地和气味将吸引目标物种，并且应该没有病原体。诱饵基质应包含标记物(通常为四环素)，以便在诱饵投放后进一步检查目标动物是否摄取了诱饵。摄入后，这种抗生素会被残留在骨头和牙齿中，并能在被杀死的动物的切掉的牙齿或下颚中被检测到。经济方面也很重要，因此，诱饵应该以标准化的形式生产，如果可能的话在当地生产。诱饵还应能抵抗有时可能适应极端的野外和储存条件。出于安全考虑，建议使用标签系统来识别生产商、用户和使用的疫苗株。

因为狂犬病疫苗来源于传染性生物材料，因此它们要经过许多过程中的批量控制，包括鉴定、纯度、无菌性(细菌、真菌和支原体)、安全性、灭活和效力(对于灭活疫苗)、病毒滴度、外来试剂的检测和生物标记稳定性(对于口服疫苗)。为了限制基因改造的风险，病毒的传播应该被限制在从最初的储备到最终疫苗的最大代次为5代。

疫苗必须由使用国的主管当局批准，并符合国家和/或国际准则。对最终产品进行批量测试的主要建议涉及疫苗悬液的安全性、效力、无菌性和功效。

疫苗株(主毒种库)还应由疫苗生产商通过完整的基因组测序进行遗传特征鉴定，以便检测疫苗株病毒初始储备的任何潜在突变或污染。已经为口服疫苗的诱饵基质建立了关于它们在环境中的吸引力和稳定性以及关于遗传生物标记的稳定性的具体建议。

狂犬病灭活疫苗效力检测

小鼠攻毒测试

第一次在小鼠中进行狂犬病灭活疫苗效力试验是在几十年前的试验中描述的。从1953年开始，后者逐渐被NIH测试取代，这是一种体内方法，包括对各组小鼠进行两次腹腔免疫，14天后用固定的狂犬病病毒株进行脑内攻击。在攻击后的14天内对小鼠进行监测，通过将试验疫苗的中位有效剂量(ED50)与参考疫苗的ED50进行比较，推断出试验疫苗的相对效力。已经提出了几种不同的攻毒方法，作为改进，用于监管目的，主要区别在于接种的数量、每次疫苗稀释使用的小鼠数量和稀释的数量。因此，欧洲药典专论0451(专用于兽医用灭活狂犬病疫苗)提出了一种改良的NIH试验，该试验使用10只小鼠的单次免疫，从而向3R迈出了第一步。攻毒前常规使用麻醉和采用人性化终点而非致死性也取得了显著进展。然而，NIH测试及其变体存在许多缺点。首先，通过脑内途径进行的病毒攻毒并没有真正模拟自然暴露的条件。类似地，通过腹腔途径的免疫并不反映狂犬病疫苗的经典给药途径。综上所述，这些因素可能导致估计效力的偏差。此外，美国国家卫生研究院的测试结果产生了高度可变的结果，如世界卫生组织(WHO、世界动物卫生组织(OIE)和欧洲药典专论所述，估计效力差异高达400%被认为是可接受的。此外，攻毒潜力测试相当昂贵和耗时。它使用大量的动物(一批疫苗测试至少120只小鼠)，其中大多数(通常超过50%)暴露于与狂犬病感染发展相关的剧烈疼痛和痛苦中。所有这些问题都主张减少体内试验，采用更合乎道德和可靠的替代方法，不使用实验动物。

血清学效价测定

最近，通过欧洲药品和保健质量局(EDQM)组织的一项合作研究，朝着采用替代方法迈出了重要的一步。在这项涉及10个国家的13个实验室(包括欧盟、加拿大和美国的实验室)的研究中，通过使用血清学效力试验替代当前的小鼠攻毒试验来评估不同灭活狂犬病疫苗的效力。血清学效价测定(SPA)意味着用预先稀释的试验疫苗或参考标准疫苗免疫的小鼠组被调整到1IU/剂量的最低效价。免疫14天后采集所有小鼠的血样，并使用血清中和试验测定接种后诱导的狂犬病病毒中和抗体的量。如果用试验疫苗获得的抗体滴度大于或等于参考疫苗获得的抗体滴度，则疫苗符合要求。这种技术有几个优点——它具有时间效率和成本效益，并且与小鼠攻毒试验相比，显示出更高的可靠性和更好的再现性，而小鼠攻毒试验是众所周知的具有可变性的。它还通过减少用于测试一种疫苗的动物数量(约20只小鼠对120/148只小鼠的小鼠攻毒测试)提供了显著的3Rs改进。它还避免了颅内注射的疼痛和痛苦以及无保护动物的临床症状。这种替代方法虽然没有完全消除对实验动物的使用，并且只提供“定性”结果，但现在已在欧洲药典专论中得到认可，专论兽医用狂犬病灭活疫苗。这是第一个成功的具体步骤，取代了欧洲批量检测狂犬病疫苗的小鼠攻毒试验及其衍生物。

体外抗原定量检测

在过去的几十年中，已经开发了许多用于定量疫苗中狂犬病病毒抗原的体外试验。这些技术必须能够区分天然和高免疫原性(三聚体)形式G蛋白（其在诱导狂犬病病毒中和抗体中起关键作用）和免疫原性差和可溶性形式的G蛋白。这就是为什么试图将疫苗中抗原的数量与小鼠的保护性反应联系起来是一个巨大挑战的主要原因。此外，当疫苗含有佐剂时，这一障碍更难克服，大多数兽医用灭活狂犬病疫苗通常都是这种情况。

单向免疫扩散(SRID)试验，描述于1984年，是基于试验疫苗和参考疫苗用去污剂处理，以从狂犬病病毒颗粒中释放糖蛋白抗原。制备两种疫苗的系列稀释液，并将其分配到琼脂糖凝胶的孔中。游离的G蛋白呈放射状扩散，并与凝胶中含有的狂犬病糖蛋白特异性抗体结合。扩散区的面积与糖蛋白的数量成正比。参考制剂和试验疫苗之间扩散区的测量和比较用于确定试验疫苗的抗原含量。SRID是一种快速且廉价的方法，但通常不能与小鼠攻击试验相关联，显然不适用于佐剂疫苗。由于无法提供最终疫苗批次的一致结果，SRID从未被提议作为国家卫生研究院试验的可能替代方法，但可能作为过程中试验用。

抗体结合试验(ABT)是另一种快速试验，是在20世纪70年代早期发展起来的。它包括用一定浓度的中和抗体对参考疫苗和试验疫苗进行系列稀释。然后用荧光聚焦抑制法检测未被吸收的抗体。类似于SRID，ABT没有正确地与小鼠攻毒测试相关联。这里，灭活狂犬病兽用疫苗中所含的佐剂也会干扰抗原/抗体的结合。改良的ABT已广泛用于过程控制，以确定纯化后的抗原含量，浓缩步骤导致最终批次。尽管最近试图进一步改善ABT，但后者不是抗原定量的合适替代方法。

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种体外替代方法，用于定量狂犬病疫苗的抗原含量，并可能评估其效力。到目前为止，已经描述了不同形式的酶联免疫吸附试验:竞争和直接测定，使用相同或两种不同的单克隆抗体(Mabs)进行平板包被和抗原检测，或者使用多克隆抗体进行平板包被和单克隆抗体进行检测。现在普遍认为糖蛋白G的含量可以指示疫苗的效力，只要检测抗体能够识别G蛋白的适当折叠的三聚体形式，这主要涉及狂犬病病毒中和抗体的诱导。此外，酶联免疫吸附试验还应该能够检测亚批次。酶联免疫吸附法目前被科学界认为是最相关的体外检测方法。几个关于兽医和人用狂犬病疫苗试验替代方法的国际研讨会聚集了来自行业、学术界和官方药物控制实验室的狂犬病专家，强调了促进验证酶联免疫吸附试验的重要性，以取代目前的小鼠效力试验。应特别注意用于平板包被和G蛋白检测的单克隆抗体的选择。非佐剂狂犬病疫苗取得了最显著的进展。许多基于G蛋白的酶联免疫吸附试验目前被制造商用于过程控制，以检查人用或兽用疫苗生产中抗原量的一致性。在日本，免疫捕获酶联免疫吸附试验也被批准用于批量释放不含佐剂的兽用狂犬病疫苗。然而，仍然需要努力促进ELISAs的实施，用于辅助疫苗中糖蛋白的定量(尤其是最后一批狂犬病兽用疫苗)。为此，在不破坏单克隆抗体和糖蛋白G之间识别的情况下，开发旨在去除佐剂的方法是至关重要的一步。

口服狂犬病疫苗的检测

病毒滴度

必须确保疫苗滴度足以引起免疫目标动物的血清转化。在欧洲，已经建立了批签发系统。事实上，EDQM已经采用了官方控制机构的野生动物疫苗批签发。因此，在投放市场之前，每批疫苗都应由官方药物控制实验室(OMCL)进行外观和病毒滴度测试，然后，根据获得的结果和制造商提供的档案，该批疫苗应由国家主管部门进行放行。另一个需要检查的要点是疫苗诱饵在运输、储存和分发过程中所处的温度，并确保它们不会影响疫苗效价。这就是为什么似乎有必要在接收时和口服疫苗接种活动开始前随机滴定几个批次。此外，由于疫苗诱饵是在地面上投放的，它们可能会受到一些局部小气候变化的影响，这可能会影响它们对目标物种的感染性以及它们有效免疫目标物种的能力。为了确保口服疫苗接种活动的有效性，可以建立一个协议，在分发后的不同时间在现场收集诱饵，以检查其疫苗接种效价。

目前，细胞培养物上口服疫苗毒饵的体外滴定没有统一的方案，因为OMCLs或测试实验室必须遵循每个制造商给出的方案。因此，每种口服疫苗的滴定程序都是不同的，都有自己的培养基、细胞系、读数方法(例如，“全有或全无”法或计数荧光焦点法)以及自己的滴定度计算方法。

讨论

主动免疫是控制人和动物狂犬病的唯一有效策略。狂犬病灭活疫苗和活疫苗是由传染性物质制成的，因此，在生产过程中可能会观察到固有的可变性。因此，质量控制是确保这些药物在目标物种中安全、稳定和有效的关键因素。

注射型注射狂犬病疫苗

对于目标是在市场上发布的最终产品，这些控制主要集中在效力测试上。因为已经使用了几十年，小鼠效力试验仍然被认为是确定灭活狂犬病疫苗效力的黄金标准方法。到目前为止，任何新方法的验证都是通过尝试观察NIH效力试验证明的保护与3Rs替代模型结果之间的直接相关性。然而，这种直接的定量关联可能是不可能的和有问题的，不仅因为NIH效力测试是一种生物测定，而且因为后者遭受了固有的可变性。因此，通过使用有效批次和子批次，采用通过/失败相关性来进行小鼠攻毒试验，对于任何3Rs替代方法的成功实施和监管验收，更具适应性和推荐性。从体内效价测定向体外效价测定的转变还需要参考材料/生物制品的可用性。世卫组织和EDQM都可以提供狂犬病疫苗标准，这些标准是通过组织合作研究收集参与狂犬病疫苗控制的实验室来校准的。这些标准可用于校准内部标准。欧洲委员会实施了生物标准计划(BSP)，以制定药典参考标准，如狂犬病疫苗，标准化生物制品质量控制的测试方法，并制定替代方法，以便将3R概念应用于实验室实验中的动物。这样的程序对促进替代方法的采用特别有帮助并且非常重要，并且应该尽可能地重复。狂犬病疫苗效力测试结果的相互认可也是一个至关重要的因素。疫苗生产商经常被要求在将产品投放到世界各地的市场之前提交批次进行多次效力测试。一些欧洲联盟成员国通过的《官方控制机构批签发 OCABR》在这里也可以作为非欧盟国家监管机构的范本。对于每一批受控的狂犬病兽用疫苗(灭活的或活的)，成员国的主管当局签发一份OCABR证书，证明该批疫苗符合欧洲联盟相关专论中规定的批准规格，以及相关的营销授权。该程序预见到这些证书被网络的所有成员所认可，以避免重复测试，从而导致动物使用的显著减少。从陈旧的NIH测试向替代方法学的过渡还需要克服监管机构、控制实验室和行业通常持有的保守立场。这种转变可能需要重新验证、培训、质量认证、购买新设备，这些同样会阻碍替代品的采用。最近在欧洲采用的批量释放狂犬病灭活疫苗的血清学效力试验表明，这种心理障碍是可以克服的。

完全替代NIH试验及其变体的最有希望的方法之一是使用酶联免疫吸附试验进行抗原定量。产品特异性酶联免疫吸附测定法已经取得了相当大的进展，可以对人用或兽用狂犬病疫苗的生产过程质量控制中的G蛋白进行定量。然而，仍然需要努力获得适用于辅助最终产品的工具。选择对糖蛋白天然三聚体形式特异的单克隆抗体，以及开发在不干扰抗体/G蛋白结合的情况下除去佐剂的方法，是实现这一目标的关键驱动因素。

 尽管仍然不够，但在过去几十年中，为了用于狂犬病疫苗效力控制的实验动物的福利，已经采取了重大步骤:采用人道的终点、使用麻醉剂、改进NIH测试、实施相互承认、采用血清学效力测试。遗令人遗憾的是，许多这些具体进展尚未成为所有国际监管要求的一部分。这加强了参与疫苗质量控制的所有利益攸关方和合作伙伴之间开展国际合作的重要性。技术和方案的协调，最后替代方法进展的共享是完全替代实验室动物用于狂犬病疫苗效力测定试验的关键因素。

口服狂犬病疫苗

得益于提出的野生动物疫苗接种策略，基于在每年秋季和春季的两次口服疫苗接种运动中分发的有效口服疫苗的使用，自1978年以来，北欧、西欧和中欧的欧洲国家的情况已显著改善。

自1985年以来，在世卫组织建议的大规模疫苗接种运动中，在世界许多地方，犬的可及性被报告为犬控制狂犬病的主要障碍。世卫组织已经认识到消除犬类狂犬病的胃肠外途径的局限性，因此促进了犬类口服疫苗的研究和有效疫苗和毒饵的开发。这种口服疫苗接种被认为是一种新的方法，无论是单独还是与胃肠外疫苗接种相结合，都有可能显著提高那些无法处理的犬的疫苗接种覆盖率，无论它们的所有权状况如何。犬的“理想”诱饵应该遵循世界卫生组织的要求。OIE最近对犬的口服疫苗表现出新的兴趣。OIE现在认可犬的口服疫苗接种的概念，该概念包含在《OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2018年)的狂犬病章节中。

口服诱饵应该是可口的，并应立即吸引目标物种。它的设计最好不要吸引非目标物种，包括人。不管目标物种的大小和年龄如何，它的形状都应该有利于它的摄食。疫苗液体应该放在不影响其效力的容器(小袋或泡罩)中。正如世卫组织所强调的，重要的是要记住，适合一个国家的东西不一定最适合另一个国家。例如，对于肠衣来说，它必须被开发和评估为对于存在于要接种疫苗的地理区域中的目标动物来说是最合适和最有吸引力的。例如，在墨西哥，鱼饵闻起来像犬的饼干，在埃及它闻起来像鸡头，在美国西南部它有一种犬的鱼的气味。此外，为了保证病毒株在田间的稳定性，诱饵外壳在不同气候条件下(例如暴露于阳光、雨水等)，以便它们不会融化或退化，直到消费。

疫苗诱饵对目标和非目标物种应该是安全的。对于口服疫苗，安全性检查比胃肠外疫苗更复杂。由于诱饵是在野外分发的，因此有必要确保它们的安全性，方法是检查它们不会引起不利的严重影响(例如疫苗的致癌可能性、与其他病毒的潜在重组、在目标动物中诱发狂犬病、疫苗接种区域中能够吃诱饵的非目标物种以及非人灵长类动物。事实上，根据病毒株疫苗的减毒水平，一些口服疫苗可能具有残留毒性。由于这种毒力可能导致疫苗狂犬病病例，从分子角度来描述疫苗接种区域中所有分离的狂犬病病毒的特征是很重要的，以便知道狂犬病病例是由循环的狂犬病病毒还是狂犬病疫苗引起的。对于在痘苗病毒载体中表达的重组病毒，重要的是检查是否对动物、人用和环境没有潜在风险。对于野生动物，应在目标群体中进行一些适口性和功效测试，以确保该产品符合犬类群体要求。

无论目标人群是野生的还是犬类的，如果使用口服疫苗对人群进行疫苗接种，则在申报狂犬病病例的情况下，应对从疑似接种狂犬病的动物中分离出的狂犬病毒株进行分型。

致谢：

本章节：Assessing the Potency of Inactivated  Veterinary Vaccines and Oral Live Vaccines

Against Rabies

作者：Alexandre Servat, Florence Cliquet, and Marine Wasniewski

来源：本内容翻译自《Rabies and Rabies Vaccines》，翻译该章节完全出于个人兴趣，不用做其它。

原书：ISBN 978-3-030-21083-0 ISBN 978-3-030-21084-7 （eBook） https：//doi.org/10.1007/978-3-030-21084-7

翻译：孟胜利