治疗性单抗研究进展与抗体产业关键技术

   摘要 抗体技术历经动物血清多克隆抗体、杂交瘤单克隆抗体，以及重组基因工程抗体等不同发展时期，尤其是后者使得治疗性抗体的生产进入产业化阶段。在已上市的抗体药物中，人源化抗体、全人源抗体由于免疫原性小，临床药效好，目前已经成为抗体药物的主流。随着抗体药物在癌症、免疫调节等治疗领域的广泛应用。抗体产业已经成为国际制药行业的主要组成部分。我国的抗体产业由于品种不足、技术落后，尚处于起步阶段，其行业发展受限于诸多技术瓶颈，如：工程细胞系构建与筛选、大规模培养工艺开发，单抗的纯化与质控等，上述产业化关键技术的突破可加快我国抗体产业的发展进程。

   关键词: 重组抗体；抗体药物；抗体产业；抗体制备工艺

抗体作为机体免疫应答的效应分子，能够识别、中和或清除诱发疾病的抗原。抗体的“可变区”（Fab）可特异性的结合抗原或靶细胞；抗体的“恒定区”（Fc）介导多种细胞效应功能（CDC、ADCC等）。此外，Fc端与FcRn的结合，使得抗体分子在体内的半衰期长达十至二十天。以上抗体的分子结构与生物功能保证了其作为治疗性蛋的药用疗效。

截止2012年底，欧美市场已有总计三十余种治疗性抗体上市销售（见图1）。以上抗体药物已经在免疫性疾病^[1]、癌症^[2]等治疗领域取得巨大成功。而从抗体药物的研发线来看，已经有三百余种单抗药物进入临床研究阶段^[3]。抗体药物研制的成功率（20%）远远高于传统小分子化学药（11%）^[4]。所以，抗体药物已经成为，并且未来仍将是制药行业发展的主要方向^[5]。

1        抗体技术与抗体药物的发展进程

1.1 抗体技术的发展进程

   抗体在临床上的治疗性应用，始于1888年Emile Roux使用“多克隆抗体”治愈白喉病患者。1897年Paul Ehrlich's 提出了“魔术子弹”（magic bullet）的假说：即利用抗体进行“靶向治疗”。利用抗原免疫动物可以快速获得含有多克隆抗体的“抗血清”。但是由于多克隆抗体本质上是针对抗原不同表位的单克隆抗体混合物，其质量并不均一，加之受免疫动物的制备路线所限，多克隆抗体在临床上的应用并不多见；上世纪七十年代，利用小鼠B淋巴杂交瘤细胞，可以获得抗单个抗原决定簇的“单克隆抗体”，后者较多克隆抗体特异性高、均一性好，成本低廉，为抗体技术的临床应用带来突破^[6]。

上世纪八十年代，美国Gentech公司申请了关于“重组抗体”制备的首个专利（“Cabilly patent”专利），即利用DNA重组技术，将抗体重链、轻链DNA同时导入宿主细胞，后者合成并分泌具有生物活性的单克隆抗体。此后，治疗性抗体的生产真正进入到产业化阶段。另外，基因工程抗体能够在基因水平对抗体分子进行切割、拼接，组装，赋予抗体分子新的生物活性，较“多克隆抗体”“杂交瘤单抗”更具应用前景。

1.2抗体药物的发展进程

  1986年，采用杂交瘤技术生产的“鼠源单抗”OKT3^TM（muromonab）成为上市的首个治疗性单抗。但是，由于鼠源单抗严重的免疫原性（人抗鼠抗）问题。抗体药物在上市的首个十年间临床应用并不广泛。

   此后，“嵌合抗体”技术保留鼠源Fab，采用人源Fc段替代鼠源Fc端，部分减轻了鼠源抗体的免疫原性。“CDR移植技术”又可将可变区的部分序列更换为人源序列，进一步的减轻嵌合抗体的免疫原性，采用此技术的抗体药物称之为“人源化抗体”（humanized antibody）。由于成功的降低了重组抗体的免疫原性，上世纪九十年代末上市的诸多嵌合抗体和人源化抗体，得以在临床上广泛应用。

  “嵌合抗体”的人源程度可达66%，“人源化抗体”可达90-95%，但仍不是真正意义上的“人源抗体”。上世纪八十年代发展起来的“体外展示技术”（噬菌体、酵母菌、核糖体展示等），通过构建大容量人源抗体文库，可实现全人源抗体的体外筛选[7]（如2002年上市Adalimumab）。本世纪初兴起的的“转基因鼠”技术（如：HuMAb-MouseTM、KM-MouseTM、XenoMouseTM、VelocImmuneTM、等），在小鼠体内转入了人的抗体基因簇，经抗原免疫后也产生全人源抗体[8]（如2006年上市的Panitumumab）。此外，近年来出现“兔单抗”技术（如RabMAbTM），较传统鼠源抗体亲和力强、特异性高，也是成为抗体药物设计的一种选择[9]。从目前以上市抗体的结构分析，人源化抗体及全人源抗体已经成为抗体药物的主流[10]（见图1）。

目前抗体药物开发的最新趋势体现在：一是，在原有药物靶点基础上，利用“抗体工程”技术，提高单抗药物的疗效[11]（见图2）；二是，构建抗体免疫连接物、抗体片段、双特性抗体，或新型结构的抗体药物。如：2007年上市的Soliris™（Eculizumab），其Fc端为IG2/4的嵌合体[12]；2009年上市的“三特异性抗体”RemovabTM，可变区可同时结合肿瘤靶点和CD30受体。[1]

2 国内外抗体药物产业现状

2.1 国际上抗体产业现状

2009年美国市场上的抗体药物成为生物技术药物销售额最大的类别。此后数年，抗体药物的销售额均保持在6-8%的增长率。2010年美国市场的单抗药物销售额为185亿美元，世界范围内单抗药物销售额总计已达400多亿美元，约是整个生物制药市场份额的36%[13]。在已上市的单抗药物中，销售额排名前五位的单抗品种，为整个抗体药物市场贡献着82%的市场份额。因此，抗体药物的品种上有所谓“Big 5”之说（即： bevacizumab、trastuzumab 、adalimumab、 infliximab，rituximab）。据预测，2014年adalimumab和bevacizumab将成为世界上销售量最大的药物品种[14]。

在国际制药行业，一方面，传统制药公司通过兼并建立其在抗体药物上的产品线，如：强生收购Centocor，罗氏收购Immunex、Genentech等；另一方面大型药企通过组建自己的抗体药物研发平台，以保持其在单抗药物开发上的技术优势。如Seattle Genetics重点发展“抗体免疫连接物”，[15]。GSK和Boehringer Ingelheim通过并购，建立“双特异性抗体”药物研发平台[16]。

    随着抗体原研药物相关专利的到期，欧盟、美国开始考虑审批抗体仿制药。2010年11 月，EMEA也出台了《生物仿制药的草案》，2012年2月FDA也颁布了《生物仿制药指导原则草案》，两者均开始建立以“生物相似度”为核心的生物仿制药审批流程，这些都为抗体仿制药的审批铺平道路。而在政策相对宽松的亚洲，我国、印度、韩国均已有抗体仿制药上市。印度Dr.Reddy公司的RedituxTM售价仅为原研药物RituxanTM成本的十分之一[17]。我国市场上也出现仿制药益赛普TM、强克TM与原研药物EnbrelTM竞争的局面。

2.2 我国抗体产业发展现状

   我国的抗体药物产业尚处起步阶段，近十年间国内先后涌现出后中信国健、百泰生物、成都弘康、上海赛金等多家专门从事单抗药物生产的企业。同时，许多传统制药企业（哈药、海正、华药、先声等）也开始涉足抗体药物领域。特别是近两年，服务抗体药物开发的CRO/CMO公司（药明康德、义翘神州、中美奥达等）开始出现。标志着新兴的抗体产业在我国已初现雏形。

但是，无论从上市品种，还是从行业产能，技术水平等方面分析，我国的抗体产业的发展尚处于起步阶段。目前我国的上市抗体品种中（见表一），国外进口单抗占据多数，我国市场上唯一全人源抗体（Adalimumab）为国外公司（Abbott）进口，上述“Big 5”单抗药物在国内均已上市；我国自主研发的六种抗体药物，以鼠源、嵌合、人源化为主，多集中在少数靶点上（TNF、EGFR，CD25等）。这就意味着相同临床适应症上，将面临国内外不同厂家的品种竞争。

更为重要的是，治疗性抗体作为大剂量重组蛋白药物。一个年销售额过亿美元的单抗药物，往往需要年产百公斤级重组蛋白的产能做支撑。行业的技术水平与产能规模将直接影响上市抗体的成本与盈利。我国抗体行业普遍存在着细胞系表达水平低，培养规模小、纯化能力不够等技术问题[18][19, 20]。以上诸多“产业化关键技术”限制了我国抗体产业的产能规模，制约了行业的发展进程（见图2）。

3 抗体产业关键技术

目前国际上抗体药物的生产成本一般控制在500美元/g以下。为此，相应的产业化技术水平要达到以下指标：细胞系表达能力>20pcd（pg/cell/day），大规模培养工艺抗体表达水平在1-5g/L，下游纯化能力在50~100kg/batch，纯化收率在70%以上[21][22]。

3.1工程细胞系的构建

   能够正确表达重组抗体的细胞系，还需具备“生长能力强，表达水平高、遗传稳定性等”特性，才能成为具有产业化价值的“工程细胞系”[23]。国内目前抗体表达水平普遍偏低（<1g/L），其根本原因在于细胞系生产能力的不足（＜20pcd）。

在宿主细胞的选择上，除了少数“鼠源抗体”仍由骨髓瘤细胞（NS0、sp2/0）生产外，绝大多数抗体药物均由CHO细胞生产。近年来，Crucell公司开发的人视网膜细胞系PER.C6TM，借助病毒载体能够实现重组抗体的高表达；Merck公司开发的酵母GlycoFi TM，具备了抗体的特异性糖基化修饰能力[23]。

宿主细胞的遗传改造主要集中在借助于“细胞工程”技术提高细胞的生长能力和表达水平。如：通过导入抗凋亡蛋白基因（bcl-2、bcl-xl），使宿主细胞具有更强的生长能力[24]；通过构建“自分泌细胞”表达生长因子，使宿主细胞更适合无血清培养；通过过度表达二硫键异构酶及相关分子伴侣（Bip/GRP78，ERp57），提高宿主细胞对异源蛋白的折叠、分泌能力，等等。[25]

业内在细胞构建中多使用的“基因共扩增体系”（如：DHFR/CHO DG44，GS/CHOK1），在基于此原理的重组细胞筛选过程中，易出现目的基因拷贝丢失、克隆间差异性差等问题，为此可采用了“弱化筛选基因”、“双筛选基因”[26][27]等多种改良策略。此外，已经出现多种商品化载体功能元件，能够克服载体“随机整合”时的“位置效应”，如：强迫目的基因表达的侧翼元件STARTM、UCOEsTM、MARsTM等；用于目的基因“定点整合”的Flp‐InTM技术，以及源自逆转录病毒的新型载体GPExTM等[28, 29]。

在“克隆筛选”环节，传统的“有限稀释法”正在被流式细胞仪自动分选或高通量筛选设备（如clonePixTM，CellCelectorTM，CelloTM）所代替[30]。此外，工程细胞系的筛选策略，也由单一以表达水平为依据，也开始转向综合评价细胞的生长能力[31][32]、生产能力、产物质量[33]等多方面因素。

3.2细胞大规模培养工艺开发

目前，国际上重组抗体的制备主要采用动物细胞培养工艺，其容积产率一般可达3-5g/L  [27]（最高可达13g/L[34]）。大型制药企业的培养规模超过二十万升（如：Amgen公司200,000L，Genentech 公司250,000L等）[21]，国内重组抗体生产水平低于1g/L，流加培养规模不超过3,000L（中信国健），灌注培养规模不超过（500L）[18, 19]。

动物细胞用培养基逐渐由“无血清培养基”或“无动物来源培养基”转向“化学明确培养基”[35]。在培养基优化策略上，除了传统的“组分滴定”、“培养基混合”、“消耗成分分析”，“化学计量法”外[36]，目前更多的倾向于综合上述方法优点的“理性培养基优化[37]”和“系统培养优化”[38]。此外，借助迷你反应器（BioLectorTM、SimCellTM、Micro-24TM,ambrTM等），可实现高通量实验设计[39]。

流加培养模式是目前重组抗体生产的主流方式，其配套反应器多为搅拌罐和气升罐。近年来兴起的一次性反应器（waveTM、Hyclone S.U.BTM等）多用于扩增种子细胞或制备小规模样品。流加培养存在营养物质消耗、代谢废物积累，以及产品质量不稳定等问题，因此其工艺优化集中在基础培养基、流加培养基以及流加策略上[40][41][42]。

灌注培养模式下，细胞密度、蛋白产量可较流加模式提高数倍[43, 44]。但是该工艺需使用细胞截留需特殊装置（如旋转滤器、倾斜沉降装置、超声截留装置等）[45]，这就限制了其工艺的可操作性和放大性。灌注培养工艺的优化策略为通过优化培养基组分，降低灌流速度，提高产物容积收率[46]。

细胞培养工艺中的物理条件（温度、pH、渗透压等）、营养成分等均会重组抗体的质量（聚体[47]、糖基化[48]，电荷变异等[49][50]）影响。因此，建立用于上市抗体生产的细胞培养工艺，需要事先对其进行充分的“定性研究”，以确定各工艺参数的控制范围[51][52]。

3.3大剂量重组蛋白纯化、质控

随着产业上游培养规模（>10，000L）、抗体产率（>5g/L）的提高。下游纯化纯化环节的处理能力成为限制产能的“瓶颈”。另外，纯化环节介质的成本占据抗体药物的生产成本的70%以上。规模、成本上的压力使得业内普遍认为：未来下游纯化将是制约抗体行业扩大产能的主要因素[53]。

目前，业内普遍采用一条抗体纯化生产线，与数个发酵罐配套的设计方案。细胞收液通常采用微滤、离心、深层过滤等方法实现“固液分离”，通过“亲和色谱”（protein A，protein G）捕获抗体。然后再使用“精制色谱”（阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水色谱等）进一步去除宿主蛋白、宿主DNA、色谱配基等杂质。此外，FDA要求整个纯化过程中需配有至少两步病毒灭活步骤。[54]

目前使用的亲和色谱（Prosep vATM、MabSelectTM、MabCaptureTM），其抗体捕获能力通常在15~50g/L。由于“柱色谱”不能无限制放大，其产能放大存在限制。新兴的一次性“膜色谱”技术，如Q膜色谱技术（如SingSep Q TM）处理能力可达10~36kg/L [55]，具有潜在的应用价值。

 抗体分子在整个制备工艺中存在多种降解途径，如：裂解、二硫键错配、甲硫氨酸氧化、谷氨酸焦谷氨酸化、天冬酰胺脱乙酰化、天冬氨酸异构化等，上述降解途径会导致重组抗体在分子量、纯度、等电点、糖基化等方面出现“异质性”，并最终影响抗体药物的临床疗效[56]。因此，抗体药物的质控需根据临床疗效确定其关键质量属性（Critical quality attribute），并据此确定抗体药物的工艺过程、质量标准。

四 结语

我国于2011年已经成为世界第三大医药市场。国内对于抗体药物的市场需求巨大。生物制药产业也因此被列为我国十二五期间的战略性新兴产业。基于抗体抗体的生物制药产业将是未来国家培育的重点行业。近年来，国家先后建立“抗体药物国家工程中心”（上海）、“抗体药物研制国家重点实验室”（石家庄）等国家级重点实验室，行业内部业内也自发形成“抗体产业联盟”等组织。市场需求的驱动、产业政策的扶持，都为我国抗体产业发展提供了良好的机遇。一旦在上述产业关键技术上取得突破，我国的抗体产业必将十年之内有一个跨跃式的发展！