自然情况下，卵子结合精子受精形成受精卵并发育成为胚胎。2012年诺贝尔医学奖获得者，英国剑桥大学杰出学者约翰格登，主要以在细胞核移植与克隆方面的先驱性研究而知名。20世纪50年代， 约翰格登等研究发现，蝌蚪成熟分化细胞的细胞核移植进入卵母细胞质后，能发育为成熟成体青蛙， 1996年，英国爱丁堡罗斯林研究所胚胎学家伊恩维尔穆特，第一个研制出通过无性繁殖技术产生克隆羊。这些研究都说明，已分化细胞能通过重编返回胚胎状态，胚胎状态的细胞能产生所有细胞甚至个体。

在前人的基础上，通过强迫一些特定转录因子基因表达，也可以重新编程已经分化的成熟细胞，让其回到多功能状态，这是2007年日本学者山中教授等建立的诱导干细胞iPS技术。iPS只需要给细胞转染4个基因，这对许多实验室来说已经足够简单，由于这种技术潜在的广泛应用前景和技术简单性，导致这种技术被大量实验室重复，现在每年有1000篇相关文章发表。iPS技术给各种细胞损伤或缺损性疾病如糖尿病等的治疗带来了希望。今年日本率先开展的临床试验初步证明，这种细胞用于视网膜黄斑变性的治疗是安全的，使这一技术的临床应用向前迈了一步(see Nature http://doi.org/xhz;2004)。

虽然科学家掌握了诱导干细胞的技术，但过去并没有人对成熟细胞诱导为干细胞这种现象的内在分子基础有所了解，这里显然存在一个黑盒子。其中一个问题是，诱导开始阶段会出现多种细胞类型，此时无法获得足够多的诱导干细胞，这些细胞中只有少部分能完全发生重编程，这些细胞也有可能发生逆转，需要科学家仔细调整培养条件才能获得理想效果，这正是诱导干细胞领域存在的一个困难，因为不同的实验条件可能会产生不同的结果，也给这种技术应用的安全性带来隐患。

最新发表在《自然》杂志上的一系列研究论文试图克服这一困难，科学家通过单细胞分析技术，确定了细胞诱导过程的一些关键分子事件，这是一项巨大的工程。由一个被称为“宏大”国际合作项目完成。加拿大多伦多西奈山医院干细胞生物学家Andras Nagy是该国际合作项目的负责人，他认为这是第一次对诱导干细胞不同阶段进行的超精细分子描述。

科学家可以制造诱导干细胞，也可以让他们分化，但是精确控制这些过程十分困难。这正是获得足够理想的治疗用干细胞方面的技术难关。能实现这一技术当然是科学家梦寐以求的，为达到这一目的，首先要了解这些过程的内在分子特征，现在的研究结果给科学家向这一目标研究提供了重要基础。

当Gurdon和Wilmut克隆出青蛙和羊细胞时，他们使用的是细胞核移植技术。细胞核移植技术，是指将一个动物细胞的细胞核移植至去核的卵母细胞中，产生与供细胞核动物的遗传成份一样的动物的技术。科学家们已经先后在绵羊、小鼠、牛、猪、山羊等动物上获得胚胎细胞核移植后代，目前，体细胞克隆也在牛、山羊、小鼠等物种上均获得了成功。使用这种技术的前提是卵细胞内存在重新编程细胞核，这种能力能让细胞核内编码成熟细胞的基因关闭，启动胚胎状态的基因表达。在过去移植入卵细胞技术的基础上，科学家进一步开发出移植到受精卵和胚胎干细胞内的细胞核移植技术。尽管所有这些技术都是利用了目标细胞的重新编程能力，但是科学家并不真正了解这些细胞具体是如何完成这一过程的分子基础。

山中伸弥和高桥和利的诱导干细胞技术改变了这一状况，他们的研究证明，只需要让成熟细胞表达通常是在早期胚胎细胞内表达的4种蛋白，就可以启动这种过程。他们的研究重要性还在于提供了体外诱导干细胞的方法。干细胞生物学家现在知道，将这些被称为山中因子的蛋白引入细胞会导致一系列基因表达，几天后这些细胞进入一个奇怪的状态，此时细胞分裂但似乎稳定，几周后，大约0.1%的细胞变成了多能干细胞。这个过程无法预测，甚至科学家不清楚那个细胞具体何时启动了重新编程过程。哈佛大学干细胞学家Alexander Meissner说，有一个事实是明确的，德国、美国和日本等国家的科学家都在同样的时间，获得了同样比例的诱导干细胞。好消息是这说明这个过程存在一个确定统一的细胞分子基础，尽管这些年这个领域研究的进展没有任何突破，科学家相信迟早能找到这个机理。

目前完全理解这一过程似乎不可能。例如科学家经常从皮肤提取成纤维细胞作为诱导干细胞的材料，研究表明这些细胞存在各种表观遗传标记，如DNA甲基化、组蛋白乙酰化等。这些特点保证了成纤维细胞相关基因的正常表达。皮肤细胞不能象成纤维细胞一样快速分裂，如果突然变成快速分裂细胞，可能已经变成了肿瘤细胞。

科学家现在对诱导干细胞制作的最初48小时的情况比较了解，这些转录因子在胚胎干细胞阶段可激活一个多潜能蛋白信号网络，这种网络使细胞保持在可分裂状态。但在分化为具体成熟细胞时，需要不同作用或不同的分子作用。宾西法尼亚大学细胞生物学家Ken Zaret对诱导早期48小时内这些分子的细胞内分布进行研究发现，这些分子竟然因为染色体结构变化导致和常规目标调节基因被物理阻断，这些分子转向调节其他可调节区域的基因，有时它们能激活迫使细胞自杀的基因，有时这些分子激活参与重编程过程的基因。MIT干细胞学家Rudolf Jaenisch将山中因子调侃为滥交因子。

也有研究发现了在这个早期编程阶段细胞染色体上发生的翻天覆地变化。2011年Meissner小组发现一种能促进基因表达的组蛋白修饰H3K4me2在1000多个基因组位点发生了变化，其中许多涉及多潜能基因，而许多涉及成熟（成纤维）细胞的特定基因则相应减少。细胞的行为特征也发生了改变。Meissner说，开始认为这些因子导致了混乱，研究表明这一过程是有规律的，能够进行预测，现在它们能明确那个基因开始被激活，那个可能被修饰，那个将保持沉默。虽然对早期基因表达能够准确预测，但对下一步的细胞走向仍然无法预测。有的细胞表达新基因，但无法预测。即使H3K4me2修饰的细胞也只能到后期才会发生大量重编程特征基因表达，大部分细胞只能达到部分重编程状态，科学家仍然不清楚这个道理。这属于诱导干细胞的黑箱步骤。Jaenisch用单细胞分析技术研究了这些细胞早期数日内将近50个基因的变化特点，发现细胞开始表达Sox-2蛋白等转录因子，说明重编程过程开始启动。

科学家不知道为什么诱导干细胞必须很长时间的等待，也不清楚为什么这种转变的比例那么低。Woltjen认为可能细胞需要经过多次分裂过程才能修改表观遗传状态，启动重编程程序，每次分裂至少需要半天。这可能是一种无法逾越的障碍。山中教授对这种低比例有自己的解释。细胞在分裂过程中，成熟细胞开始仍然习惯于表达原来的基因，虽然少数细胞能快速发生变化，也必然受到来自周围环境细胞的影响，导致这些细胞发生摇摆不定的分裂。培养细胞一般会出现各种不同的类型，外来基因产生的影响也必然不同，对这种细胞有效的基因，未必对其他细胞都有作用。希望产生快速诱导的愿望也许根本不可能实现。

科学家现在希望将细胞进行分类以分析这个诱导过程的黑箱。Woltjen研究发现，不同比例的重编程诱导因子能产生不同的诱导效率，一种配方有很高的诱导重编程效率，但是大多数细胞都是部分重编程的不稳定状态，难以获得最终理想诱导效率。而诱导重编程效率比较低的配方最终获得更高质量的诱导干细胞。

受Nagy希望打开黑盒子的激励，Project Grandiose项目在2010年由8家研究机构30名资深科学家启动。经过标记重编程过程，这些科学家连续1月每天收集1亿个细胞，然后分析这些细胞的蛋白、RNA，掌握甲基化修饰等信息。甲基化修饰分析会产生海量数据，然后用超大硬盘分发给合作者。

这一合作研究获得了一个非常重要的成果，他们确定了一种新的诱导干细胞类型F-class，意思是fuzzy模糊细胞。胚胎中能分离到胚胎干细胞和外胚层干细胞。F-class细胞和这些细胞具有不同的特征，也不同于诱导干细胞。传统重编程方法中，达到多能性后宿主细胞表达的因子能沉默重编程因子。然而，F-class细胞的维持依赖于转录因子持续性的高表达。因为这种细胞无法满足最严格的干细胞测试，将这种细胞注射到小鼠胚胎无法产生嵌合体小鼠。有人认为不能算干细胞，最多只能算部分重编程细胞。Nagy认为虽然不能形成嵌合体小鼠，但能形成畸胎瘤，这种结构中存在多种细胞类型。

Nagy 认为这一发现好像是打开了一扇大门，应该存在更多类似的干细胞状态。

http://www.nature.com/news/stem-cells-the-black-box-of-reprogramming-1.16525