光合产氢微生物治疗肿瘤研究【香港】

光合产氢微生物因其能够自发定植于肿瘤组织且具有高度催化选择性，是极具潜力的抗肿瘤治疗氢气递送平台。然而，现有微生物普遍存在近红外（NIR）响应不足及光生电子注入效率低的问题。为此，我们通过静电组装策略，在沼泽红假单胞菌（R.P.）表面构建了一种微生物-半导体杂化体系：将负载有硫化铜的层状双氢氧化物纳米片（LDH/CuS）组装到R.P.表面，以实现NIR驱动的光合产氢免疫疗法。LDH/CuS可增强对NIR光子的捕获能力，并形成p‒n异质结，有效降低电子排斥势垒，从而定向推动光生电子向R.P.注入。在808 nm激光照射下，LDH/CuS异质结可将光生电子注入R.P.的氢酶系统的能力提升6.8倍，实现了高效光合产氢。值得注意的是，R.P.@LDH/CuS能主动定植于缺氧肿瘤组织，其靶向效率高达73.2%；在NIR刺激下，该杂化体系可选择性地将肿瘤富集的乳酸（LA）和糖原转化为氢气。通过消耗乳酸并诱导免疫原性细胞死亡，这种微生物-半导体杂化体系可激发强烈的抗肿瘤免疫反应：浸润的CD8+ T细胞数量增加超过9倍，肿瘤抑制率高达97.8%。本研究提出了一种基于NIR驱动的生物杂化系统，通过空间定向电子泵送实现高效光合产氢，为精准靶向肿瘤免疫治疗开辟了全新思路。

1 简介

分子氢（H2）作为一种颇具前景的气体抗肿瘤剂，能够特异性地下调肿瘤细胞中过度表达的活性氧（ROS）水平。这种下调作用可引发线粒体功能障碍和氧化还原失衡，从而诱导细胞凋亡[1-4]。此外，H2还具有免疫治疗潜力，可通过增强免疫原性细胞死亡（ICD）来激活免疫反应[5-7]。然而，传统的水触发式H2生成系统，如金属镁（Mg）、硅氢化物（SiHx）和氢化钙（CaH2），存在释放动力学难以控制的问题[3, 8-10]。为克服这些局限性，研究人员开发了光催化策略，通过催化质子还原实现外源光照刺激下的可控H2生成[11-14]。尽管性能已得到优化，但人工光催化剂仍面临一些根本性缺陷：催化选择性有限、易发生副反应，以及在复杂的肿瘤微环境中活性位点稳定性不足[15, 16]。此外，大多数光催化剂缺乏主动靶向和定植肿瘤的能力，导致其性能不可逆地下降[17]。相比之下，某些光合微生物能够利用天线蛋白将光能转化为电子，随后这些电子被引导至细胞内氢酶以生成H2[18, 19]。光合微生物具有极高的转化速率和底物特异性，能够在厌氧条件下高效地将多种有机酸和糖原选择性地转化为H2[20, 21]。尤为重要的是，许多这类兼性厌氧微生物，包括蓝藻、希瓦氏菌（Shewanella oneidensis）和沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris，简称R.P.）[22-24]，能够自主定植于缺氧的肿瘤区域，从而实现微环境选择性的H2递送[25-28]。因此，凭借其固有的缺氧趋性与选择性代谢活性，光合微生物成为肿瘤内靶向H2生成的理想生物反应器[29-32]。 现有的光合微生物由于光子捕获不足，尤其是对近红外（NIR）波段的光子捕获效率低下，导致其光-电转换效率先天性地较差[33-35]。为提高光合产氢效率，必须同时优化光吸收与光电子注入机制[36-38]。令人鼓舞的是，微生物-半导体杂化体系的开发为拓展光谱响应范围、提升光电子转移效率提供了一条有效策略[39-44]。例如，利用金纳米颗粒（NPs）修饰微藻可增强其在635 nm处的光吸收能力，从而促进乳酸（LA）的消耗及氢气的生成[45]。然而，这类杂化体系的治疗潜力却受限于对深层穿透的近红外窗口利用率不足[37]。另一方面，典型的半导体光敏剂（如CdS、FeS）能够向微生物光合反应中补充额外的光电子，进而提高产氢效率[46-49]。不过，在现有微生物-半导体杂化体系中，生物-非生物界面处的光电子产生缺乏空间定向的传输路径[50-52]。这一局限性源于代谢活跃的细菌膜始终处于富电子状态，形成了对半导体的电子排斥屏障，从而削弱了电子向细胞内氢化酶的注入效率[45, 53, 54]。通过构建p‒n异质结以形成局域内建电场，有望成为一种有效的定向电子泵送策略，因为这能使电子持续向n型组分迁移[55-57]。因此，基于p‒n异质结介导的微生物近红外光吸收增强与定向电子泵送，将协同提升微生物-半导体杂化体系的光合产氢效率，这对于实现高效且靶向肿瘤的氢气治疗具有重要意义。 在此，我们通过静电组装法，在R.P.表面构建了一种微生物-半导体杂化材料（R.P.@LDH/CuS），将负载有硫化铜（CuS）的锌钼层状双氢氧化物（ZnMo-LDH）组装到R.P.表面，从而实现了近红外光驱动的光合产氢，用于肿瘤靶向免疫治疗（图1）。LDH/CuS不仅增强了对近红外光的捕获能力，还形成了p‒n异质结，诱导出局部电子匮乏区，并削弱了电子排斥势垒，使光生电子能够定向注入R.P.。在808纳米激光照射下，LDH/CuS异质结将光生电子注入R.P.的氢酶体系的效率提高了6.8倍，实现了高效的光合产氢速率。借助天然的低氧趋性[58]，R.P.@LDH/CuS杂化材料能够主动定植于肿瘤组织，其靶向效率高达73.2%；在近红外光刺激下，该杂化材料可选择性地将肿瘤富集的乳酸和糖原转化为氢气。通过乳酸耗竭与免疫原性细胞死亡（ICD）诱导的双重作用，这种微生物-半导体杂化材料激发了强大的抗肿瘤免疫反应：浸润的CD8+ T细胞数量增加了超过9倍，肿瘤抑制率高达97.8%。这项工作开发了一种近红外光驱动的生物杂化系统，实现了空间定向电子泵送，高效生成光合氢气，为精准靶向肿瘤免疫治疗开辟了一条极具前景的新路径。 详情请见图片下方的说明文字。

图1

基于近红外光驱动的R.P.@LDH/CuS微生物-半导体杂化体系的光合发酵机制示意图，用于靶向肿瘤治疗。该机制可在肿瘤内部实现光合产氢、代谢干扰及免疫激活。

2 结果与讨论

2.1 微生物-半导体杂化材料R.P.@LDH/CuS的构建

采用共沉淀法合成了ZnMo-LDH纳米片（NSs）。随后，通过同晶取代作用，Cu2+部分替代了LDH纳米片表面的Zn2+；接着，利用Na2S进行硫化处理，从而在二维（2D）LDH界面原位生成了CuS纳米颗粒[59, 60]。所得的LDH/CuS复合材料随后通过静电自组装方式负载于R.P.表面，制备出微生物-半导体杂化材料R.P.@LDH/CuS（图2a）。利用透射电子显微镜（TEM）对样品的结构和形貌特征进行了表征。原始LDH纳米片的横向尺寸约为100 nm（图S1a）。经修饰后，CuS纳米颗粒均匀负载于LDH上，形成了清晰的异质结构（图S1b）。元素Mapping分析证实，Zn、Mo和O在LDH纳米片中分布均匀（图S2）。在LDH/CuS纳米片中，还观察到了Cu和S的额外信号（图2b），进一步验证了CuS纳米颗粒的成功负载。原子力显微镜（AFM）测试表明，LDH/CuS纳米片的厚度约为24 nm（图2c,d）。X射线衍射（XRD）分析显示，LDH的特征峰分别归属于其（003）、（006）、（009）和（110）晶面。LDH/CuS的衍射图谱不仅保留了这些特征峰，还出现了与CuS的（102）、（103）和（110）晶面相对应的额外峰（图2e）。为进一步探究其化学组成和价态，我们采用了X射线光电子能谱（XPS）进行分析。LDH的全谱证实了Zn、Mo和O的存在，而LDH/CuS的谱图则显示出额外的Cu 2p和S 2p峰（图S3a）。高分辨Cu 2p谱图揭示了Cu2+ 2p3/2和Cu2+ 2p1/2峰，其结合能分别为932.0 eV和951.8 eV（图S3b）。在S 2p谱图中，位于161.1 eV、162.3 eV和167.3 eV的峰分别对应于S2− 2p3/2、S2− 2p1/2以及S−O键的特征峰（图S3c）。同时，Zn 2p和Mo 3d谱图显示，在LDH和LDH/CuS中均存在Zn2+（1046.4 eV、1023.3 eV）、Mo6+（236.8 eV、233.2 eV）和Mo5+（235.5 eV、231.9 eV）的特征峰（图S4）。 详情请见图片下方的说明文字。

图2

微生物-半导体R.P.@LDH/CuS杂化材料的构建与表征。（a）示意图展示了通过共沉淀法和水热法合成LDH/CuS纳米片，随后利用静电相互作用将其组装到R.P.表面的过程。（b）LDH/CuS纳米片的TEM映射图像。（c）LDH/CuS纳米片的AFM图像。（d）LDH/CuS纳米片的AFM高度轮廓图。（e）LDH、CuS以及LDH/CuS的XRD谱图。（f）ζ电位，（g）FTIR光谱，以及（h）LDH、LDH/CuS、R.P.、R.P.@LDH和R.P.@LDH/CuS的粒径分布。SEM图像显示：（i）R.P.和（j）R.P.@LDH/CuS。数据以平均值±标准差表示（n=3）。 得益于其较高的比表面积（54.96 m² g⁻¹），二维LDH/CuS纳米片提供了充足的界面接触（图S5），从而促进了生物-非生物界面的相互作用。通过ζ电位测量，阐明了LDH/CuS与R.P.之间的组装机制。LDH/CuS纳米片表面带正电荷（10.2 ± 1.2 mV），而R.P.则带负电荷（−24.3 ± 0.8 mV）（图2f）。相反的表面电荷促进了界面间的静电吸附，最终形成了ζ电位为−17.3 ± 0.8 mV的R.P.@LDH/CuS杂化体。对R.P.@LDH/CuS杂化体进行傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析发现，在1655和1530 cm⁻¹处出现了特征性的酰胺Ⅰ/Ⅱ吸收峰，这源于丰富的细菌脂质和蛋白质（图2g）。此外，在R.P.@LDH/CuS中还观察到一个位于1360 cm⁻¹的附加峰，该峰归属于LDH中插层CO₃²⁻的反对称伸缩振动。动态光散射（DLS）分析表明，经LDH/CuS包覆后，R.P.的流体力学直径从1.54 ± 0.30 µm增至1.75 ± 0.39 µm（图2h）。利用扫描电子显微镜（SEM）对细菌的形貌进行了观察。原始R.P.呈现棒状形态，直径约为0.6 µm，长度约为1.7 µm（图2i）。组装完成后，LDH/CuS纳米片均匀地固定在细菌表面，未引起明显的结构完整性变化（图2j）。为了评估LDH和CuS对R.P.增殖的影响，我们在白光照射下监测了R.P.、R.P.@LDH、R.P.@CuS以及R.P.@LDH/CuS在9天内的生长曲线。结果发现，无论是LDH还是LDH/CuS均未抑制R.P.的增殖，反而表现出轻微的促进作用（图S6）。这种增强效应可能归因于Zn²⁺和Mox⁺分别作为脱氢酶和氢酶的重要辅因子，能够促进光合发酵过程[61-63]。 2.2 近红外驱动的光合产氢

为评估近红外光下的光合活性，将R.P.、R.P.@CuS以及R.P.@LDH/CuS在厌氧条件下悬浮于含有LA和葡萄糖的培养基中，随后暴露于近红外辐射（808 nm，0.5 W cm−2）。首先通过亚甲基蓝-铂（MB-Pt）指示剂定性监测H2的生成情况：当H2还原MB-Pt时，溶液颜色会从蓝色变为无色（图3a）。结果显示，R.P.@CuS杂化材料在近红外光照下几乎不产生H2（图S7），这归因于CuS纳米颗粒的光热杀菌效应（图S8），其温度升高（ΔT）在近红外光照5分钟后可达18.6℃（图S9）。相比之下，R.P.@LDH/CuS组的MB脱色速率明显快于单独的R.P.（图S10），表明其光合产氢过程显著加速。原位光学显微镜进一步证实，在近红外光刺激下，R.P.@LDH/CuS产生了气泡（图3b）。通过气相色谱的定量分析发现，R.P.在黑暗条件下几乎不产生H2。而在近红外光照30分钟后，R.P.@LDH/CuS的累计H2产量达到66.5 µM（图3c），远高于R.P.所产生的21.1 µM（图3d；图S11）。此外，底物代谢分析表明，近红外光激活了R.P.的代谢活动，促进了LA和葡萄糖的消耗。值得注意的是，引入LDH/CuS异质结构后，LA和葡萄糖的消耗速率均比单纯R.P.+NIR处理提高了三倍以上（图3e,f）。对光合作用过程中三磷酸腺苷（ATP）合成的定量分析显示，与R.P.及R.P.@LDH相比，R.P.@LDH/CuS在近红外光照后的ATP含量最高（图3g）。这一结果与光合产氢能力的增强高度一致，表明LDH/CuS的引入有效促进了R.P.的光合作用。 详情请见图片下方的说明文字。

图3

光合产氢及R.P.@LDH/CuS杂化材料的适应性代谢。（a）用于检测H2的MB还原法示意图。（b）H2气泡生成的显微镜图像。（c）R.P.@LDH/CuS所产生H2对应的气相色谱峰。（d）在近红外光照下，R.P.、R.P.@LDH和R.P.@LDH/CuS的产氢情况。（e）不同处理后培养液中LA的消耗量。（f）不同处理后培养液中葡萄糖的消耗量。（g）经近红外照射后，R.P.、R.P.@LDH和R.P.@LDH/CuS的ATP含量定量分析。（h）LDH、LDH/CuS、R.P.、R.P.@LDH和R.P.@LDH/CuS的紫外−可见吸收光谱。（i）CuS和LDH的禁带宽度。（j）CuS和LDH的Mott-Schottky曲线。（k）CuS与LDH形成的p‒n异质结示意图。（l）LDH和LDH/CuS的光致发光光谱。（m）用于电化学测试的三电极体系示意图，其中涂有细菌的ITO玻璃作为工作电极。（n）R.P.、R.P.@LDH和R.P.@LDH/CuS在近红外光开闭循环下的瞬态光电流响应。（o）R.P.@LDH/CuS光合产氢的示意机制。数据以平均值±标准差表示（n=3）。 为阐明光合作用性能增强的机制，我们对R.P.@LDH/CuS杂化材料的光学和电子特性进行了研究。紫外−可见−近红外光谱分析表明，R.P.在806 nm和867 nm处呈现出特征性菌绿素吸收峰（图3h）。而R.P.@LDH/CuS杂化材料则表现出从800至1000 nm宽范围的吸收增强。通过紫外−可见漫反射光谱和Mott-Schottky测试，我们对LDH和CuS的能带结构进行了分析。结果表明，CuS的禁带宽度为1.68 eV，LDH的禁带宽度为4.35 eV（图3i）。Mott-Schottky曲线显示，CuS呈现负斜率，对应于p型半导体行为；而LDH则表现为正斜率，符合n型半导体的特征（图3j）。根据计算，CuS的导带（CB）和价带（VB）位置分别为−1.18 V和0.50 V，LDH的相应能级则为−0.83 V和3.52 V（图3j,k）。当费米能级对齐后，n型LDH与p型CuS形成了典型的p-n异质结，并产生了内建电场。这一异质结能够将光生电子定向输送到LDH一侧，有效抑制了电子-空穴复合。光致发光（PL）光谱分析显示，与单独的LDH相比，LDH/CuS杂化材料的发光强度显著减弱（图3l），这表明其电荷分离效率得到了提升。因此，可以预期LDH/CuS异质结将优化近红外光驱动的光电子产生过程，并促进电子持续向微生物界面转移，从而有效激活光合作用途径。 在近红外光激发下，通过三电极体系监测了生物-非生物界面处的电子转移过程（图3m）。电化学阻抗谱分析表明，与R.P.和R.P.@LDH相比，R.P.@LDH/CuS的电荷转移电阻最低（图S12），这表明LDH/CuS异质结降低了界面电子转移的能量势垒。此外，在交替的近红外开闭循环条件下，R.P.@LDH/CuS产生的光电流密度最高（图3n），达到R.P.的6.8倍。这一现象源于局部形成的LDH/CuS p‒n异质结增强了近红外驱动下的电子-空穴分离，并促使电子定向地向R.P.泵送。从机制上讲，在近红外光（808 nm）照射下，LDH/CuS异质结充当了一个高效的光捕获模块，产生光生电子并将其注入生物-非生物界面（图3o）。这些光生电子进入R.P.自身的电子传递链（反应中心、醌池、细胞色素复合物和铁氧还蛋白），最终被输送至氢化酶，驱动葡萄糖或乳酸的催化转化生成氢气。因此，LDH/CuS不仅提高了光子捕获效率和光生电子转化效率，还促进了高效的近红外诱导电荷分离，并实现了电子的定向流动，从而最大限度地提升了氢气的生产效率。这种微生物-半导体杂化系统克服了天然光合微生物固有的低光生电子转化效率问题。 2.3 光合产氢的抗肿瘤作用及机制

在近红外光（808 nm，0.5 W cm⁻²）照射下，采用小鼠乳腺癌4T1细胞评估了R.P.@LDH/CuS杂化材料的体外抗肿瘤性能。R.P.@LDH/CuS表现出良好的血液相容性，在浓度高达10¹⁰ CFU mL⁻¹时，溶血率低于4%（图S13）。同时，R.P.@LDH/CuS对LO2、4T1和DC2.4细胞的细胞毒性可忽略不计，细胞存活率均保持在96%以上（图S14）。为评估其体外治疗效果，我们采用了Transwell共培养体系：4T1细胞置于下室，R.P.@LDH/CuS置于上室（图4a）。单独进行近红外光治疗并未造成任何热损伤；而LDH/CuS+近红外光治疗仅通过轻微的光热效应适度降低了细胞活力（图S15）。值得注意的是，R.P.@LDH/CuS+近红外光治疗通过光催化产氢作用将细胞活力降至7.4%，这一效果明显优于仅使用R.P.+近红外光治疗所观察到的中度抑制效果（图4b）。流式细胞术分析显示，LDH/CuS+近红外光处理的细胞凋亡率为25.2%，R.P.+近红外光处理的细胞凋亡率为35.3%。相比之下，R.P.@LDH/CuS+近红外光处理则将细胞凋亡率显著提高至93.0%（图4c及图S16）。活/死染色进一步证实了上述结果：经R.P.@LDH/CuS+近红外光处理后，红色荧光标记的死亡细胞数量明显增加（图S17）。 详情请见图片下方的说明文字。

图4

光合H2疗法介导的R.P.@LDH/CuS体外抗肿瘤作用及其机制。（a）体外细胞实验装置示意图。（b）不同处理条件下4T1细胞的存活率。（c）采用Annexin V-FITC/PI染色对4T1细胞进行凋亡的流式细胞术分析。（d）不同条件下4T1细胞的代表性JC-1染色图像。（e）通过γ-H2AX免疫荧光染色检测DNA损伤。（f）对照组与R.P.@LDH/CuS+NIR组之间差异表达基因（DEGs）的热图，（g）火山图。（h）显著改变的生物通路的GO富集分析。（i）关键DEGs与富集通路相关性的桑基气泡图。与（j）MAPK、（k）NOD样受体、（l）TNF以及（m）细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路相关的DEGs热图。数据以均值±标准差表示（n=3）。n.s.：无显著性差异，**p<0.01 ***p<0.001。 为探究细胞死亡的潜在机制，我们采用5,5′,6,6′-四氯-1,1′,3,3′-四乙基咪唑啉碘化物（JC-1）染色法检测了线粒体膜电位。在近红外光激发下，经R.P.@LDH/CuS处理的细胞表现出明显的线粒体荧光变化：从红色（聚集态）向绿色（单体态）转变（图4d）。定量分析显示，R.P.@LDH/CuS+NIR组中单体形式的平均荧光强度（MFI）显著升高，这表明光催化产生的H2引发了还原应激，破坏了氧化还原稳态，并损害了线粒体电子传递链（图S18）。同时进行的共染色实验进一步证实，R.P.@LDH/CuS+NIR组出现了广泛的溶酶体功能障碍和内质网（ER）应激（图S19和图S20），而LDH/CuS+NIR及R.P.+NIR处理仅引起轻微的细胞器损伤。此外，我们还通过免疫荧光染色标记γ-H2AX来评估DNA损伤情况。与R.P.+NIR组相比，R.P.@LDH/CuS+NIR组的γ-H2AX斑点更为密集，细胞核内信号的平均荧光强度也显著升高（***p < 0.001，图4e；图S21）。综合上述结果表明，R.P.@LDH/CuS+NIR处理引发了严重的细胞器应激，包括线粒体去极化、溶酶体破裂、内质网功能障碍以及DNA损伤，最终导致不可逆的细胞凋亡。 为进一步阐明其生物学机制，我们开展了转录组测序，以检测基因表达的改变。经验证，生物重复样本之间具有高度可重复性，所有样本对之间的皮尔逊相关系数均超过0.97（图S22）。主成分分析显示，对照组与R.P.@LDH/CuS+NIR组之间存在明显分离（图S23）。差异表达分析发现，R.P.@LDH/CuS+NIR组中有699个基因显著上调，727个基因显著下调（图4f,g）。基因本体论（GO）富集分析将这些差异表达基因（DEGs）与关键生物学过程关联起来，包括单羧酸代谢、免疫效应过程、炎症反应调控、凋亡信号通路、T细胞活化的正向调节以及MAPK级联反应等（图4h）。这些发现表明，R.P.@LDH/CuS+NIR治疗通过营养竞争和光合发酵产氢诱导了细胞凋亡，同时发挥了免疫调节作用。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析进一步揭示，与代谢、凋亡和免疫相关的信号通路显著富集（图4i）。这些通路包括MAPK（图4j）、p53（图S24a）、NOD样受体（图4k）、Toll样受体（图S24b）、TNF（图4l）、细胞因子-细胞因子受体相互作用（图4m）、趋化因子（图S25a）以及抗原加工与呈递（图S25b）。值得注意的是，促凋亡基因如Tnfsf和Gadd45的表达上调，支持了程序性细胞死亡的激活。此外，氢气的产生引发了明显的免疫原性细胞死亡（ICD），这表现为干扰素相关基因（如Ifnb1、Stat和Irf7）以及免疫招募趋化因子（如CXCL9、CXCL10和CCL5）的协同上调。这些转录组学证据共同表明，R.P.@LDH/CuS+NIR治疗通过诱导凋亡/ICD并激活抗肿瘤免疫来发挥其疗效。 2.4 R.P.@LDH/CuS+近红外光治疗的免疫激活效应

基于转录组学证据显示免疫通路已被激活，我们进一步在体外评估了R.P.@LDH/CuS+NIR治疗的免疫原性细胞死亡诱导及免疫调节作用。光催化产氢可诱导免疫原性细胞死亡，并触发损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，从而启动树突状细胞（DC）成熟、巨噬细胞极化重编程以及T细胞活化（图5a）。对关键DAMPs的免疫荧光染色结果显示，LDH/CuS+NIR和R.P.+NIR处理均能适度诱导钙网蛋白（CRT）暴露及高迁移率族蛋白B1（HMGB1）的胞外释放（图5b）。相比之下，R.P.@LDH/CuS+NIR组表现出最显著的CRT膜转位及核内HMGB1的丢失（图S26），这表明其免疫原性细胞死亡效应得到了放大。为评估下游免疫调节效果，我们采用了一种Transwell共培养体系，将经不同处理的4T1细胞与免疫细胞共培养（图S27）。与对照组（2.2%）相比，R.P.+NIR组的DC成熟度提升至9.5%，而R.P.@LDH/CuS+NIR处理则使成熟DC比例进一步提高至21.6%（图5c,d）。这种增强效应归因于LA耗竭与H2介导的免疫原性细胞死亡的协同作用。免疫荧光染色显示，R.P.@LDH/CuS+NIR处理下调了CD206表达（M2标志物），同时上调了CD86表达（M1标志物）（图5e,f）。对CD206和CD86表达的平均荧光强度进行定量分析进一步证实，R.P.@LDH/CuS+NIR处理有效促使免疫抑制性的M2型巨噬细胞向促炎性的M1表型极化（图S28）。流式细胞术分析也验证了这些表型转变。与对照组相比，R.P.@LDH/CuS+NIR处理使M2型巨噬细胞比例从32.1%降至11.5%（图5g,h），同时使M1型巨噬细胞比例从10.5%升至40.1%（图5i,j），表明免疫抑制微环境已得到逆转。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了巨噬细胞分泌的细胞因子。结果发现，R.P.@LDH/CuS+NIR组分泌的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）等促炎性细胞因子水平最高（图S29）。综上所述，H2介导的免疫原性细胞死亡与代谢性LA耗竭协同作用，共同促进了DC成熟及促炎性巨噬细胞极化，从而激活了强大的抗肿瘤免疫反应。 详情请见图片下方的说明文字。

图5

在近红外光照射下，R.P.@LDH/CuS+NIR触发的体外免疫激活。（a）R.P.@LDH/CuS+NIR治疗引发免疫激活的示意图。（b）不同处理后暴露的CRT及释放的HMGB1的免疫荧光图像。（c）经不同处理的DCs的流式细胞术分析。（d）成熟DCs百分比的定量结果。巨噬细胞标志物的免疫荧光染色：（e）CD206和（f）CD86在Raw264.7细胞中的表达。（g）F4/80+CD206+ Raw264.7细胞的流式细胞术分析。（h）M2型巨噬细胞百分比的定量结果。（i）F4/80+CD86+ Raw264.7细胞的流式细胞术分析。（j）M1型巨噬细胞百分比的定量结果。数据以均值±标准差表示（n=3）。**p<0.01 ***p<0.001。 2.5 R.P.@LDH/CuS的体内抗肿瘤疗效及肿瘤靶向性

采用原位4T1乳腺癌模型评估了R.P.@LDH/CuS的体内抗肿瘤疗效。荷瘤小鼠被随机分为六组：（I）对照组（PBS）；（II）近红外光照射组；（III）R.P.组；（IV）LDH/CuS+近红外光照射组；（V）R.P.+近红外光照射组；以及（VI）R.P.@LDH/CuS+近红外光照射组。当肿瘤体积达到50 mm³时，各组小鼠开始接受不同治疗，并在16天内监测肿瘤生长情况（图6a）。首先通过荧光成像评估了R.P.@LDH/CuS的肿瘤靶向能力。注射后各预定时间点，R.P.@LDH/CuS在肿瘤中的富集程度显著高于单独使用LDH/CuS（图6b）。定量分析显示，R.P.@LDH/CuS的荧光信号中，有73.2%定位在肿瘤组织中，这反映了其主动靶向特性。这一表现远优于LDH/CuS的被动积累，后者仅在肿瘤组织中保留了20.9%的荧光信号（图S30）。此外，电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）分析进一步证实了Zn²⁺的分布特征。结果显示，LDH/CuS主要分布在肝脏和肿瘤中，且在注射后12小时达到峰值（图S31）。相比之下，R.P.@LDH/CuS则主要富集于肿瘤组织，给药24小时后达到最高浓度（图6c）。R.P.@LDH/CuS优异的肿瘤靶向性源于R.P.本身对缺氧且营养丰富的肿瘤微环境的天然趋向性（图6d）。为了探究R.P.@LDH/CuS在体内的命运，我们进行了菌落形成单位（CFU）测定，以量化注射后多个时间点主要器官和肿瘤中的微生物浓度。如图S32所示，R.P.@LDH/CuS主要定植于缺氧的肿瘤组织，这一结果与荧光成像结果一致。肿瘤中的微生物数量在注射后第1天达到峰值，随后逐渐下降至低水平，直至第16天，这主要归因于有效的免疫介导清除作用。与此相反，心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏在早期阶段的细菌积累量较低，且在观察期内迅速被清除，进一步证实了该生物杂化系统对肿瘤的高选择性定植特性。 详情请见图片下方的说明文字。

图6

R.P.@LDH/CuS在近红外光照射下的体内肿瘤靶向及抗肿瘤疗效。（a）原位4T1肿瘤模型与体内治疗流程的示意图。（b）体内荧光成像显示Cy7标记的LDH/CuS和R.P.@LDH/CuS在各器官中的分布情况。（c）通过ICP-AES测定Zn含量，半定量分析R.P.@LDH/CuS在主要器官及肿瘤中的生物分布。（d）R.P.@LDH/CuS靶向肿瘤微环境的示意图。（e）不同治疗组小鼠的体重变化。（f）各组小鼠肿瘤体积的变化。（g）不同治疗后第0、8和16天荷瘤小鼠的体内生物发光成像。（h）研究终点时各组肿瘤重量。（i）各组切除肿瘤的实物照片。（j）各组肿瘤组织的TGI率。（k）各组肿瘤切片的H&E染色及Casp-3免疫染色图像。数据以均值±标准差表示（n=5）。***p<0.001。

在16天的治疗期间，各组均未出现明显体重减轻，表明全身毒性极低（图6e）。对照组、NIR组和R.P.组的肿瘤体积持续增大（图6f）。LDH/CuS+NIR组和R.P.+NIR组则表现出中度的肿瘤生长抑制效果。尤为引人注目的是，采用R.P.@LDH/CuS+NIR治疗后，肿瘤几乎完全消退。体内生物发光成像直观地证实了R.P.@LDH/CuS+NIR组肿瘤的显著消退（图6g）。这一显著的治疗效果可归因于光合作用产氢、代谢竞争以及免疫激活之间的协同作用。从肿瘤终末重量（图6h）和切除肿瘤的代表性图像（图6i）可以看出，R.P.@LDH/CuS+NIR治疗具有强大的抗肿瘤疗效，其肿瘤生长抑制率（TGI）高达97.8%（图6j）。相比之下，LDH/CuS+NIR组的TGI仅为27.1%，这凸显出CuS的光热效应相较于产氢和代谢调控这一主导机制而言，其作用相对次要。此外，苏木精-伊红染色结果显示，R.P.+NIR治疗引发了中度的细胞核碎裂，而R.P.@LDH/CuS+NIR组则表现出更为广泛的细胞核溶解（图6k），表明增强的产氢作用加速了肿瘤细胞的凋亡进程。进一步的免疫组织化学分析显示，R.P.@LDH/CuS+NIR治疗显著上调了凋亡标志物（Casp-3和TUNEL）的表达，同时下调了增殖标志物Ki67的表达（图6k；图S33）。这些发现共同证实，R.P.@LDH/CuS+NIR治疗能够触发强烈的细胞凋亡，有效抑制体内肿瘤的增殖。 2.6 R.P.@LDH/CuS+NIR的免疫治疗疗效

基于上述结果，R.P.@LDH/CuS+NIR可通过一种双重机制在体内重塑肿瘤免疫微环境，该机制涉及代谢性耗竭免疫抑制性LA以及诱导细胞焦亡（图7a）。代谢分析表明，R.P.+NIR治疗可在一定程度上降低肿瘤内葡萄糖和LA的水平。值得注意的是，R.P.@LDH/CuS+NIR组的代谢耗竭效果更为显著，其中葡萄糖水平降至1.45毫摩尔，LA水平降至0.59毫摩尔（图7b、c）。这种增强的代谢耗竭效应归因于微生物-半导体杂化体系对近红外光利用效率的提升及光合作用反应速率的加快。葡萄糖的竞争性耗竭减少了肿瘤细胞增殖的主要能量来源，并降低了用于LA生成的糖酵解通量[64, 65]。此外，LA的同步耗竭有助于逆转免疫抑制性微环境，从而促进免疫细胞的浸润与活化[5, 42]。对肿瘤切片进行免疫荧光分析，为强烈的细胞焦亡提供了直接证据。如图7d和图S34a所示，与对照组、NIR组和R.P.组相比，LDH/CuS+NIR组和R.P.+NIR组的CRT暴露水平略有升高；而R.P.@LDH/CuS+NIR组则表现出更显著的CRT暴露。此外，对照组、NIR组和R.P.组主要表现为HMGB1的核内滞留，而LDH/CuS+NIR组和R.P.+NIR组则诱导了少量的HMGB1核外移出（图7d）。其中，R.P.@LDH/CuS+NIR组的HMGB1胞质转位最为明显（图S34b）。CRT暴露和HMGB1释放随后刺激了模式识别受体TLR4的表达，该受体在R.P.@LDH/CuS+NIR组中显著上调，证实了先天免疫信号通路的激活（图7d；图S34c）。 详情请见图片下方的说明文字。

图7

R.P.@LDH/CuS+NIR治疗的体内免疫治疗效果。（a）R.P.@LDH/CuS+NIR诱导的免疫识别与激活机制示意图。不同组别肿瘤组织匀浆中（b）葡萄糖和（c）乳酸的浓度。（d）经不同处理后肿瘤组织中CRT、HMGB1和TLR4的免疫荧光染色结果。经不同处理后（e）M2型巨噬细胞（F4/80+CD206+）、（f）成熟DCs（CD80+CD86+）、（g）CD4+ T细胞（CD3+CD4+）以及（h）CD8+ T细胞（CD3+CD8+）的代表性流式细胞术分析图。（i）不同处理下肿瘤组织中炎症因子IFN-γ的水平。（j）切除肺组织中转移结节的H&E染色图像。数据以均值±标准差表示（n=3）。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。 通过流式细胞术和免疫荧光染色，全面评估了R.P.@LDH/CuS+NIR的免疫治疗效果。首先利用流式细胞术检测了巨噬细胞的极化状态。与对照组（M2型巨噬细胞占比35.0%）相比，R.P.+NIR组的免疫抑制性M2型巨噬细胞比例降至25.6%。更令人瞩目的是，R.P.@LDH/CuS+NIR治疗进一步将M2型巨噬细胞比例显著降低至11.7%，这主要归因于其增强的LA耗竭能力和ICD诱导能力（***p < 0.001，图7e、图S35）。与此同时，R.P.@LDH/CuS+NIR治疗使促炎性M1型巨噬细胞的比例从对照组的9.8%显著升高至31.8%（图S36），表明免疫抑制微环境正被积极重编程为免疫激活状态。这一表型转变也得到了免疫荧光染色的进一步证实：R.P.@LDH/CuS+NIR治疗后，CD206表达下调，而可诱导一氧化氮合酶（iNOS）表达则上调（图S37）。 接下来，我们通过流式细胞术评估了DC的成熟度。正如预期，与其它各组相比，R.P.@LDH/CuS+NIR组的DC成熟度显著增强（42.2%）（***p < 0.001，图7f；图S38），这表明微生物-半导体杂化体系能够激活强烈的免疫反应，从而促进有效的抗原呈递及随后的T细胞活化。在此基础上，我们进一步检测了T细胞的浸润与活化情况。免疫荧光染色显示，经R.P.@LDH/CuS+NIR治疗后，肿瘤区域中CD4+和CD8+ T细胞的浸润均明显增加（图S39）。流式细胞术分析进一步证实，仅使用NIR或单纯递送R.P.对T细胞活化的影响可忽略不计，CD4+和CD8+ T细胞的比例分别维持在2.8%和3.3%以下（图7g,h）。相比之下，R.P.@LDH/CuS+NIR则使CD4+和CD8+ T细胞比例分别提高了14.6倍和9.1倍（图S40）。从功能上看，CD8+ T细胞直接杀伤肿瘤细胞，而CD4+ T细胞则通过分泌细胞因子来协调免疫激活。与此一致，经R.P.@LDH/CuS+NIR治疗后，TNF-α、IL-6、白细胞介素-12（IL-12）和干扰素-γ（IFN-γ）的表达均显著上调（*p < 0.05，图7i；图S41），全面启动了促炎微环境。单次NIR照射引发的瞬时H2爆发可启动ICD级联反应及代谢重编程，进而诱导持久的抗肿瘤免疫。随后CD8+ T细胞的扩增以及持续的细胞因子分泌为长期抑制肿瘤提供了保障。为进一步验证R.P.@LDH/CuS的抗转移效果，我们采用H&E染色对乳腺至肺部的转移情况进行组织学评估。对照组、NIR组和R.P.组均观察到大量转移结节，而LDH/CuS+NIR组和R.P.+NIR组的转移则明显减少（图7j）。值得注意的是，R.P.@LDH/CuS+NIR治疗通过激活强大的抗肿瘤免疫，显著抑制了肿瘤向肺部的转移。尤为重要的是，在静脉注射R.P.@LDH/CuS后的第1天（急性期）和第16天（亚急性期），血液学指标未见明显病理变化（图S42），且对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏等主要器官的组织学检查也未发现异常（图S43），这充分证明了该疗法具有良好的全身安全性。因此，NIR刺激同时启动上游H2释放与代谢物耗竭，协同激活下游的抗肿瘤免疫应答作为关键效应机制，而光热效应仅发挥次要的辅助作用。 3 结论

总之，本研究成功构建了一种近红外光驱动的微生物-半导体杂化体系（R.P.@LDH/CuS），用于靶向性光合产氢。该杂化体系协同结合了兼性厌氧菌R.P.固有的肿瘤归巢能力，以及由LDH/CuS异质结介导的增强光生电子转移效应。在808纳米近红外光照射下，异质结促进了高效的电荷分离，并将光生电子定向输送到细菌氢酶系统中，从而实现了高效光合产氢。借助R.P.对缺氧微环境的天然趋向性，R.P.@LDH/CuS杂化体系能够主动靶向并定植于缺氧肿瘤，其靶向效率高达73.2%。更重要的是，R.P.@LDH/CuS杂化体系在近红外光刺激下，可将肿瘤富集的乳酸和糖原转化为氢气，进而实现精准肿瘤消融并显著诱导免疫原性细胞死亡（ICD）。这种微生物-半导体杂化体系通过乳酸耗竭与ICD诱导的双重作用，激发了强大的抗肿瘤免疫反应，使浸润的CD8+ T细胞数量增加了超过9倍，最终实现了高达97.8%的显著肿瘤抑制率。与传统的光催化产氢系统相比，这种微生物-半导体杂化体系在精准肿瘤靶向、氢气选择性生成及免疫激活能力等方面展现出独特优势。因此，这一近红外光驱动的光合生物杂化系统为精准靶向氢气免疫治疗提供了一种极具前景的新范式。