富氢水改善药物非典型股骨骨折愈合【香港】

论文题目：氢气重塑骨痂衰老微环境，促进抗骨质疏松药物相关性非典型股骨骨折愈合

第一作者来自香港中文大学医学院骨科与创伤系肌肉骨骼退化与再生中心

背景：双膦酸盐类药物（BPs）长期广泛用于骨质疏松治疗，但这类药物反而会诱发非典型股骨骨折（AFF），且此类骨折普遍存在愈合不良的特点。本研究采用去卵巢骨质疏松大鼠模型，给予唑来膦酸（ZOL）干预并建立单侧股骨骨折模型，模拟临床非典型股骨骨折。研究发现：骨折局部衰老微环境过度激活，会引发持续性炎症、阻碍骨折有效再生。氢气具有抗衰老、抗炎作用，但其对非典型股骨骨折的愈合作用尚不明确。

方法：本研究采用富氢水（HRW）干预非典型股骨骨折模型大鼠，通过影像学、组织学、显微CT及生物力学检测评估骨折愈合效果；同时从细胞衰老、纤维化、巨噬细胞极化、细胞因子表达、血管生成等多个维度分析骨折微环境变化。

结果：富氢水可显著促进骨痂桥接愈合、消除骨折不连间隙；而单纯唑来膦酸组骨折间隙持续存在纤维组织。显微CT与生物力学检测证实，富氢水不会削弱双膦酸盐所提升的骨力学强度。机制上，富氢水可特异性改善骨折局部衰老微环境，降低SA-β-gal衰老阳性染色及p16、p21蛋白表达；同时清除病理性成纤维细胞，促使巨噬细胞由促炎M1型向抗炎M2型转化，重塑细胞因子平衡，并重建成骨耦合H型血管生成。

结论：氢气并非通过提升全身成骨能力，而是局部逆转骨折衰老微环境，进而促进非典型股骨骨折愈合，为骨痂修复重建创造有利微环境。该策略为骨折延迟愈合、骨不连提供了全新治疗思路。

氢点评：非常喜欢这个论文，1，对氢水效应进行了非常丰富的研究，这对于氢气产生作用提供了足够强的证据。2，机制研究也是多角度开展，没有对某一个现象进行所谓分子机制的探讨。这样的研究应该成为氢气效应研究的范式。

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Hydrogen reshapes the senescent microenvironment of callus to enhance the healing of anti-osteoporotic-drug-induced atypical femoral fracture - ScienceDirect

1 引言

骨质疏松是以骨量减少、骨脆性增加为特征的老年高发疾病，易诱发脆性骨折，具有高致残率、高死亡率及沉重的社会疾病负担[1,2]。自1995年起，唑来膦酸等双膦酸盐类药物已成为骨质疏松一线抗吸收治疗药物[3,4]。临床证实双膦酸盐可降低骨质疏松骨折风险，但长期应用会带来严重并发症，其中药物相关性颌骨坏死以及非典型股骨骨折发生率逐年升高[7-10]。非典型股骨骨折一旦发生，常出现骨折延迟愈合或骨不连，再次手术与残疾风险显著增高[11-13]。目前，非典型股骨骨折的发病机制及有效干预策略仍不明确。

骨折愈合是高度协同的生物学过程，依赖局部微环境的动态平衡。纤维蛋白基质形成是骨折修复的起始关键；但创面纤维蛋白过度蓄积、清除不足，会诱发病理损伤、阻碍组织再生[15-18]。及时有效的纤维溶解是骨折顺利愈合的必要条件。长期双膦酸盐相关非典型股骨骨折中，骨痂桥接障碍常伴随异常纤维化增生，提示靶向改善纤维化有望提升骨折愈合预后[21]。

老年骨折普遍存在愈合延迟、骨不连高发的特点。近年研究发现细胞衰老是骨病理进程的关键调控因素：衰老细胞在组织损伤后大量聚集，即便在年轻个体中也会阻碍修复进程。通过衰老清除药物或基因敲除清除衰老细胞，可显著促进骨折愈合[23-25]。衰老细胞主要通过衰老相关分泌表型（SASP）释放大量促炎因子，抑制修复进程。但现有抗衰老药物缺乏靶向性与普适性，且细胞毒性明显，临床应用受限。因此，研发可安全重塑衰老微环境、抑制SASP、无全身毒性的靶向干预手段，是骨折修复领域的迫切需求。

氢气可选择性中和毒性氧自由基，作为新型医用气体备受关注[27-31]。氢气分子体积极小、呈电中性，扩散能力极强，可穿透细胞膜与细胞器，减轻氧化应激——而氧化应激是细胞衰老与SASP的核心驱动因素[32-33]。研究证实氢气可改善成纤维细胞、内皮细胞等多种细胞的衰老相关病理改变[34-37]；同时含镁释氢植入材料等可促进骨再生与骨折愈合[38-43]。本课题组已成功构建模拟临床特征的非典型股骨大鼠模型[21]，但氢气能否重塑非典型股骨骨折衰老微环境、促进愈合仍有待验证。

本研究科学假设：唑来膦酸诱导的非典型股骨骨折愈合障碍，源于骨折骨痂内衰老细胞病理性聚集，进而诱发异常纤维化与骨不连；富氢水干预可通过局部重塑衰老微环境，促进骨折桥接愈合。

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 2 研究结果

2.1 富氢水促进非典型股骨骨折骨痂桥接

通过双侧去卵巢构建骨质疏松大鼠模型，给予唑来膦酸干预并建立单侧闭合股骨骨折。影像学结果显示：单纯唑来膦酸组骨折后12周仍存在清晰骨痂不连间隙，愈合明显延迟；且后期骨痂密度高于对照组。

图1

富氢水干预组自骨折6周起，股骨骨痂不连间隙逐渐消失，骨折处骨痂密度增高，愈合进程显著改善。

组织学结果显示：单纯唑来膦酸组骨折间隙被大量纤维组织填充、残留组织包裹，两端虽形成致密编织骨，但无法完成桥接。富氢水干预后，骨折间隙纤维组织明显减少，2周即可形成软骨痂，6周实现编织骨完全桥接。

综上，饮用富氢水可有效促进非典型股骨骨折骨痂桥接愈合。

2.2 富氢水不增强唑来膦酸诱导的成骨效应

显微CT三维重建与定量分析显示：唑来膦酸组骨折后6周、12周骨体积（BV）、骨体积分数（BV/TV）、骨矿含量、骨密度等指标均高于对照组；富氢水干预并未进一步升高上述成骨相关参数，但影像学可见骨折线愈合更理想。

对侧非骨折股骨检测同样证实：唑来膦酸可显著提升骨量、皮质骨厚度等指标，富氢水无额外增强作用。

图2结果提示：非典型股骨骨折愈合障碍并非全身成骨能力不足，富氢水不提升唑来膦酸的全身成骨作用，而是通过局部微环境发挥修复效应。

2.3 富氢水不改变骨折骨生物力学性能

四点弯曲生物力学检测显示：骨折后12周，唑来膦酸组、唑来膦酸+富氢水组股骨极限载荷、刚度、断裂能量均显著高于对照组，且两组间无统计学差异。

图3

骨微压痕硬度实验也证实，两组骨痂杨氏模量、硬度均显著升高，但富氢水未带来额外力学提升。

说明富氢水在促进骨折愈合的同时，不会削弱双膦酸盐带来的骨力学保护作用。

2.4 富氢水靶向修复成骨空间缺陷、促进骨痂定向桥接

Runx是成骨分化关键标志物，唑来膦酸组骨折2周骨痂Runx2表达显著降低，富氢水可明显逆转这一抑制效应。

荧光双标矿化结果显示：唑来膦酸组整体骨痂矿化增强，但骨折间隙内无新生骨生成；富氢水可直接在骨折间隙诱导新生骨形成，实现骨痂完全桥接。

图4

破骨细胞TRAP染色提示两组骨痂重塑活性均处于较高水平。

结论：唑来膦酸仅提升整体骨痂矿化，无法实现骨折间隙定向成骨；富氢水可特异性修复这一空间缺陷，且不抑制正常骨重塑进程。

2.5 富氢水抑制非典型股骨骨折骨痂异常纤维化

CD10/CD26双阳性成纤维细胞为纤维化特征细胞。唑来膦酸组骨折后2、6、12周骨痂间隙该类细胞显著增多，形成物理屏障阻碍骨桥接；

图5

富氢水干预2周即可明显减少病理性成纤维细胞浸润，至6、12周几乎完全清除异常纤维组织，实现骨性愈合。

证实富氢水可有效消退骨折局部病理性纤维化，打通骨痂修复屏障。

2.6 富氢水抑制骨折局部衰老微环境

唑来膦酸组骨折间隙SA-β-gal衰老阳性染色显著升高，p16、p21衰老相关蛋白表达明显上调；

富氢水干预可显著降低SA-β-gal活性，下调p16、p21表达，有效改善骨折局部衰老微环境。

图6

富氢水可抑制唑来膦酸诱导非典型股骨骨折骨痂间隙的细胞衰老

(A) 骨折后第2、6、12周骨质疏松大鼠股骨SA-β-gal衰老染色代表性图像（主图标尺200 μm；放大图标尺100 μm）。

(B) SA-β-gal阳性面积占比定量分析（n=5）。

(C、E) 分别为p16、p21免疫组化染色代表性图像（标尺100 μm）；感兴趣区域为骨折周边组织。

(D、F) p16、p21阳性面积定量分析（n=5）。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，

结果小结：本数据证实，唑来膦酸可诱导骨折局部细胞衰老；富氢水能有效逆转这一衰老进程。提示抑制衰老相关信号通路，是富氢水改善非典型股骨骨折愈合不良微环境的关键机制。

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 2.7 富氢水调控巨噬细胞向抗炎表型极化

骨折修复过程中及时抗炎至关重要，本研究检测了巨噬细胞M1/M2表型极化变化。

与对照组相比，唑来膦酸组骨折骨痂间隙附近CD86⁺F4/80⁺ M1型促炎巨噬细胞数量显著增多，呈现持续炎症状态；富氢水干预可明显抑制M1型巨噬细胞活化。

反之，唑来膦酸组CD206⁺F4/80⁺ M2型抗炎巨噬细胞比例降低（尤以骨折后2周明显），而富氢水干预后M2型巨噬细胞显著上调，提示富氢水能促使巨噬细胞由促炎M1表型向抗炎M2表型极化。

图7

唑来膦酸诱导非典型股骨骨折模型中，富氢水干预前后骨痂巨噬细胞表型变化

骨折后第2、6、12周骨质疏松大鼠股骨骨痂M1型（CD86+F4/80）、M2型（CD206+F4/80）免疫荧光代表性图像。

感兴趣区域为骨折周边组织；共定位黄色信号代表对应双阳性巨噬细胞；细胞核经DAPI染为蓝色，标尺100 μm。

随着巨噬细胞表型发生极化转变，骨折间隙促炎因子TNF-α在唑来膦酸组第2、6、12周表达面积显著升高；富氢水干预后TNF-α表达明显下降。

而抗炎因子IL-10在唑来膦酸组表达轻度下调，富氢水处理后则显著升高。

图8

富氢水重塑非典型股骨骨折骨痂间隙促炎/抗炎细胞因子平衡

(A) 骨折后第2、6、12周骨痂间隙TNF-α免疫组化代表性图像及定量分析（标尺100 μm，n=5）。

(B) 同时间点IL-10免疫组化染色及定量分析；感兴趣区域为骨折周边组织，标尺100 μm，n=5。

*P<0.05，***P<0.001，

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 2.8 富氢水恢复骨折骨痂功能性血管生成

血管生成与骨痂重塑密切相关，H型血管（Emcn⁺CD31⁺） 是介导血管生成与成骨耦合的关键血管类型。

免疫荧光结果显示：与对照组相比，唑来膦酸组骨折后2周骨痂间隙周边H型血管内皮细胞数量显著减少；而富氢水干预可明显上调Emcn⁺CD31⁺双阳性H型血管数量，促进骨折骨痂内H型血管新生。

图9

富氢水恢复唑来膦酸骨折模型中成骨耦合H型血管生成

骨折后第2、6、12周骨痂间隙Emcn（红色）、CD31（绿色）免疫荧光及定量分析；

融合黄色信号为H型血管，细胞核DAPI蓝色染色；感兴趣区域为骨折周边组织，标尺100 μm，n=5。***P<0.001，

结果小结：富氢水可逆转唑来膦酸导致的血管生成障碍，通过恢复成骨耦合H型血管生成，重建利于骨痂桥接与成熟的修复微环境。

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 讨论

本研究证实：富氢水给予的氢气可有效促进唑来膦酸诱导的非典型股骨骨折愈合；主要表现为促进骨痂骨性桥接、清除异常纤维化，从而降低骨不连发生率。

机制上，氢气通过重塑骨折局部衰老微环境、调控巨噬细胞由促炎向抗炎极化、恢复H型血管新生三大核心作用，为非典型股骨骨折提供了全新治疗靶点。

图10

机制模式图：氢气重塑骨痂衰老微环境、促进非典型股骨骨折愈合

氢气通过抑制细胞衰老相关分泌表型（SASP），减轻唑来膦酸所致愈合障碍；

调控巨噬细胞极化、平衡促炎/抗炎因子，清除病理性纤维化、促进血管新生，最终实现骨折间隙骨性愈合。

研究证实唑来膦酸可形成高密度、高生物力学硬度但无法桥接的骨痂，与既往研究一致：骨重塑受抑会形成量大但结构紊乱的骨组织。

非典型股骨骨折中可见大量致密纤维组织与CD10⁺CD26⁺成纤维细胞聚集，形成物理屏障阻碍骨桥接；纤维化不仅破坏细胞外基质正常结构，还会抑制血管生成与成骨前体细胞浸润。

富氢水可清除骨痂间隙持续性纤维组织，重建正常空间结构，为软骨生成与骨痂桥接创造条件。

同时研究发现：富氢水不会进一步增强唑来膦酸已提升的全身成骨与骨力学性能。四点弯曲与微压痕实验提示，唑来膦酸组骨痂硬度已显著升高，富氢水主要作用于局部微环境修复，而非全身提高骨量。

机制层面：细胞衰老通过TGF-β1等通路抑制老年骨折愈合，清除衰老细胞可促进骨修复。

唑来膦酸作用具有双向性：低剂量短期使用可抑制破骨细胞衰老，但临床常规长期给药会诱发骨折局部病理性衰老微环境，出现SA-β-gal、p16、p21高表达，并伴随成纤维细胞异常聚集。

富氢水可显著抑制细胞衰老与SASP表型，同时调控免疫微环境：下调TNF、上调IL-10，促使M2型巨噬细胞极化，打破炎症—纤维化恶性循环。

此外，富氢水可特异性恢复H型血管生成。H型血管是成骨微环境的重要支架，唑来膦酸会显著抑制其形成；氢气可逆转这一缺陷，恢复血管—成骨交叉对话，为骨折间隙输送营养、氧供与成骨前体细胞，保障骨痂桥接。

氢气生物学优势：可选择性清除毒性氧自由基、抑制细胞衰老与SASP、调控巨噬细胞极化、组织穿透性极强，可深入致密骨与缺氧骨折区域；同时镁基释氢植入材料也具备骨修复潜力。

研究局限性：动物模型虽模拟临床非典型股骨骨折特征，但与人体复杂病理仍有差异；富氢水给药方式下骨折局部有效氢浓度尚不明确，仍需后续机制与临床验证。

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 结论

本研究证实：氢气可显著促进唑来膦酸诱导的非典型股骨骨折愈合，核心作用是清除异常纤维化、实现骨痂桥接、改善骨不连。

其机制并非进一步提升唑来膦酸带来的全身成骨与骨力学强度，而是靶向重塑骨折局部衰老、炎症、血管新生微环境，为临床难治性非典型股骨骨折提供了具有转化价值的全新干预策略。