富氢水缓解疼痛抑郁新研究2026

 富氢水通过性别与脑区特异性中枢机制改善利血平诱导的纤维肌痛小鼠模型疼痛与抑郁样行为

摘要：纤维肌痛是一种慢性伤害感受可塑性疼痛疾病，常伴随情感障碍（尤以抑郁为甚），目前有效治疗手段仍十分有限。越来越多证据表明，中枢氧化应激、异常突触可塑性与神经炎症改变参与其病理生理过程。本研究在利血平诱导的小鼠纤维肌痛模型中探究氢气（H₂）的治疗效应，重点关注性别依赖性与脑区特异性机制。对雄性与雌性C57BL/6小鼠重复注射利血平以诱导类纤维肌痛症状，评估机械性异常性疼痛、热痛觉过敏、冷异常性疼痛及抑郁样行为，随后对脊髓与杏仁核进行分子水平分析。利血平可在两性小鼠中诱导持续性伤害感受性高敏感与抑郁样行为，雌性小鼠冷异常性疼痛出现更早。富氢水（HRW）可逐步逆转机械性与热性高敏感，并快速消除冷异常性疼痛，在雌性小鼠中疗效更显著；HRW亦可使两性小鼠抑郁样行为恢复正常。分子水平上，HRW降低脊髓氧化应激与ERK依赖性可塑性，但不改变脊髓NLRP3表达；而在杏仁核中，HRW可完全逆转NLRP3上调与HO-1下调。此外，HRW在脊髓中激活性别依赖性抗氧化通路。上述结果表明，H₂通过脑区与性别依赖性中枢机制缓解感觉与情感异常，支持富氢水作为伤害感受可塑性疼痛及其情感共病的潜在治疗策略。

Molecular Hydrogen Reverses Nociplastic Pain and Depressive-like Behaviors via Region- and Sex-Dependent Central Mechanisms

 1 引言

纤维肌痛是以广泛骨骼肌疼痛、疲劳与局部压痛为特征的慢性综合征[1]。尽管其患病率高且致残性强，病理生理机制仍未明确[2]。流行病学研究显示，纤维肌痛累及约2%–4%普通人群，女性患病率显著更高[3]。评估通常包括疼痛强度、压力痛阈、睡眠质量、焦虑、抑郁及整体功能状态[4,5]。当前治疗手段对症状缓解有限，凸显研发更有效药物策略的迫切需求。

越来越多证据表明，氧化应激、线粒体功能障碍与炎症在纤维肌痛症状发生与持续中发挥核心作用[6]。促氧化过程与疼痛敏化密切相关，尤其在中枢神经系统内，脂质过氧化导致丙二醛、4-羟基壬烯醛（4-HNE）等氧化应激标志物水平升高[1,7]。此外，活性氧（ROS）过量生成引发的线粒体功能障碍与伤害性信号增强相关，可能通过破坏细胞能量代谢与促进神经炎症过程实现[8]。与此一致，ROS生成与抗氧化防御失衡是纤维肌痛病理生理的标志性特征，患者总抗氧化能力降低，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等关键抗氧化酶活性下降，可能加重氧化损伤并促进疼痛放大[9,10]。

此外，新证据提示NOD样受体家族含pyrin结构域3（NLRP3）炎症小体激活可能是纤维肌痛与抑郁共病的共同机制。在纤维肌痛中，持续NLRP3炎症小体信号激活导致慢性炎症、线粒体功能障碍与神经免疫改变，促进疼痛敏化与情绪失调[11]。

药物治疗仍是纤维肌痛管理的核心。当前加巴喷丁类与抗抑郁药为主要药物，包括普瑞巴林、度洛西汀与米那普仑。然而，这些药物疗效在临床研究中差异显著，仅约30%–60%患者获得有效疼痛缓解，且通常仅降低约30%疼痛程度，同时伴随显著不良反应[12]。上述局限凸显需持续研发更有效、耐受性更好的治疗策略。

氢气（H₂）作为靶向氧化应激、线粒体功能障碍与炎症的潜在治疗手段备受关注，而这些正是纤维肌痛病理生理的关键环节。作为选择性抗氧化剂，H₂可中和羟自由基等高活性氧，恢复氧化还原稳态[8]。临床前研究表明，富氢水（HRW）通过调控氧化应激与炎症通路，减轻神经损伤或化疗诱导的神经病理性疼痛模型中的异常性疼痛与痛觉过敏。具体而言，HRW上调血红素氧合酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶-1（SOD-1）等抗氧化酶，同时抑制促炎细胞因子生成与核因子κB激活[13,14]。此外，HRW改善线粒体功能与ATP敏感性钾通道活性，发挥镇痛与神经保护作用[14,15]。值得注意的是，HRW在临床前模型中亦表现出类抗抑郁效应，鉴于纤维肌痛中情绪障碍高发，此效应尤为重要；且迄今重复给予H₂未发现不良反应与耐受性[16]。然而，H₂对纤维肌痛相关疼痛（尤其纳入性别生物学变量）与抑郁样行为的改善潜力仍未被充分探索。

本研究采用利血平重复给药诱导的经典小鼠纤维肌痛模型，可忠实重现疾病核心神经化学与行为学特征[17,18]。重复利血平处理导致多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素等单胺类神经递质耗竭，同时通过升高脊髓与丘脑、前额叶皮层等疼痛加工脑区的P物质与谷氨酸水平增强兴奋性神经传递[19,20,21]。因此，利血平处理动物出现与纤维肌痛临床特征高度相似的表型，包括异常性疼痛、痛觉过敏、抑郁样行为与认知障碍[20,22]。重要的是，利血平诱导的氧化应激、线粒体功能障碍与神经炎症改变，进一步支持该模型在机制与药理学研究中的转化价值[22,23,24]。

据此，本研究旨在利用该模型探究HRW对纤维肌痛相关症状（疼痛与抑郁样行为）的治疗效应。我们假设HRW通过调控脊髓（疼痛加工）与杏仁核（情绪调控）中氧化应激、炎症通路及/或突触可塑性改变，缓解纤维肌痛症状[25,26]。

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 2 结果

 2.1 利血平诱导雄性与雌性小鼠持续性机械异常性疼痛、热痛觉过敏与冷异常性疼痛

在基线（第0天）及首次利血平注射后7、14、21、28天，评估利血平处理雄性与雌性小鼠后爪对机械与热刺激的缩足反应。三因素重复测量方差分析显示，两性小鼠双后爪中，处理、时间主效应及处理×时间交互作用均显著（p<0.0001）。

与溶媒对照组相比，利血平给药后7、14、21、28天，两性小鼠对von Frey纤维丝刺激的缩足阈值（图1A、B）与辐射热刺激的缩足潜伏期（图1C、D）均显著降低（p<0.001）。

结果进一步显示，利血平诱导的冷异常性疼痛呈性别依赖性时间特征。三因素重复测量方差分析显示，双后爪中处理、性别、时间主效应，以及处理×性别、处理×时间交互作用均显著。利血平在两性小鼠中均诱导冷异常性疼痛，冷刺激后左、右后爪抬足次数较溶媒组增加（图1E、F）。雌性小鼠在注射后7、14、21、28天出现冷异常性疼痛（p<0.0001），雄性小鼠则在14、21、28天出现（p<0.0001）。

 2.2 富氢水逆转利血平诱导的伤害感受性高敏感

动物在伤害感受性高敏感完全建立后（首次利血平注射后23–28天），连续6天每日腹腔注射HRW（0.3 mM）或溶媒。

三因素重复测量方差分析显示，HRW对利血平诱导的机械异常性疼痛、热痛觉过敏、冷异常性疼痛，处理、时间主效应及处理×时间交互作用均显著（p<0.0001）；冷板实验中冷异常性疼痛还存在处理×性别交互作用显著（p<0.008）。

HRW给药后，两性小鼠机械异常性疼痛逐步缓解，雄性（p<0.0001）与雌性（p<0.0001）呈现相似时间模式，治疗4天后完全逆转。热痛觉过敏亦有相似效应，但完全逆转时间存在性别差异：雄性3天（p<0.0001），雌性4天（p<0.0001）。

HRW亦可减少利血平诱导的冷板抬足次数增加，单日治疗即可消除两性小鼠冷异常性疼痛（雄性p<0.0001，雌性p<0.0001）。值得注意的是，治疗1天后HRW对雌性的抑制幅度（61.5%）高于雄性（48.9%），与处理×性别交互作用显著一致。

所有范式中两性小鼠右后爪结果相似，HRW对溶媒处理小鼠双后爪无影响。

 2.3 富氢水抑制纤维肌痛相关抑郁样行为

HRW治疗6天后（利血平注射后28天）评估抑郁样行为。悬尾实验（TST）与强迫游泳实验（FST）证实，利血平在雌性小鼠中诱导抑郁样行为，且在雄性小鼠中同样出现。三因素方差分析显示，注射、处理主效应及注射×处理交互作用均显著（p<0.0001），性别及相关交互作用无显著效应。

利血平显著增加两性小鼠TST（p<0.001）与FST（p<0.001）中的不动时间。HRW治疗有效使两性小鼠两种行为学范式中的不动时间恢复正常；而HRW对溶媒处理两性小鼠的不动时间无影响。

 2.4 富氢水对利血平处理小鼠脊髓4-HNE、NLRP3与p-ERK1/2表达的影响

为探究HRW效应的分子机制，分析脊髓中4-HNE、NLRP3与磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白水平。双因素方差分析显示，处理主效应显著（p<0.0001），性别及处理×性别交互作用无显著效应。

利血平显著升高雄性（p<0.0135）与雌性（p<0.0093）小鼠脊髓4-HNE水平，HRW治疗使其恢复正常。

利血平显著升高两性小鼠脊髓NLRP3水平（雄性p<0.0030，雌性p<0.0013），但HRW处理后NLRP3仍维持高水平。

利血平显著升高两性小鼠脊髓p-ERK1/2表达（雄性p<0.0141，雌性p<0.0005），提示诱导可塑性改变；HRW治疗使脊髓p-ERK1/2升高水平恢复正常。

 2.5 富氢水对利血平处理小鼠脊髓HO-1、NQO1与SOD-1表达的影响

分析脊髓中抗氧化酶HO-1、NQO1、SOD-1蛋白水平。双因素方差分析显示，性别、处理主效应对HO-1表达均显著（p<0.0450；p<0.0001）。利血平不改变两性HO-1水平，HRW显著升高雄性HO-1表达（p<0.0018），对雌性无影响。

NQO1的双因素方差分析显示性别、处理主效应均显著（p<0.0100；p<0.0170）。利血平不改变雄性NQO1表达，HRW处理后雌性NQO1显著升高（p<0.0112）。

SOD-1仅处理主效应显著（p<0.0001）。利血平显著降低两性SOD-1表达（雄性p<0.0064，雌性p<0.0054），HRW使其恢复正常。

 2.6 富氢水对利血平处理小鼠杏仁核4-HNE、NLRP3与p-ERK1/2表达的影响

鉴于利血平小鼠出现抑郁样行为，检测HRW对杏仁核氧化应激、炎症信号与可塑性改变的调控。双因素方差分析显示，杏仁核中4-HNE与p-ERK1/2无显著主效应与交互作用；NLRP3存在性别主效应（p<0.0240）与性别×处理交互作用（p<0.0001）。

利血平显著升高两性杏仁核NLRP3水平（雄性p<0.0095，雌性p<0.0055），4-HNE与p-ERK1/2无改变。HRW逆转两性杏仁核NLRP3升高。

 2.7 富氢水对利血平处理小鼠杏仁核HO-1、NQO1与SOD-1表达的影响

双因素方差分析显示，处理主效应对HO-1蛋白水平显著（p<0.0001）。利血平显著降低两性杏仁核HO-1表达（雄性p<0.0207，雌性p<0.0041），HRW逆转该下调。

利血平不改变两性杏仁核NQO1与SOD-1蛋白水平。

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 3 讨论

纤维肌痛是重要临床难题，伴随情绪障碍（尤其抑郁）的伤害感受可塑性疼痛有效治疗有限。本研究表明，HRW在利血平诱导纤维肌痛模型中，通过调控脊髓与/或脊髓上水平的氧化应激、神经炎症信号与异常可塑性，发挥强效镇痛与类抗抑郁效应，支持其作为纤维肌痛治疗策略的潜力。

本研究采用利血平诱导肌痛模型，可高度模拟人类纤维肌痛核心感觉与情感特征，包括机械与热性高敏感、自发疼痛行为与抑郁样症状[17,21,27]。然而，此前研究多仅用单一性别，极少系统将性别作为生物学变量[17,23,28,29]。本结果证实利血平在雌性诱导上述改变，且同样存在于雄性。重要的是，两性机械异常性疼痛与热痛觉过敏相似，但冷异常性疼痛出现时间存在明显性别差异：雌性更早（第7天），雄性较晚（第14天），且均持续至28天，与抑郁样行为出现时间一致。该模式与其他临床前疼痛模型的性别差异一致[30]。

HRW逐步逆转两性机械异常性疼痛与热痛觉过敏，4天内完全恢复；冷异常性疼痛单日给药即消除，雌性疗效更优。该性别差异提示性别相关生物因素可调控抗氧化干预在伤害感受可塑性疼痛中的疗效[31]，与顺铂诱导神经病理性疼痛中HRW对雌性冷异常性疼痛效应更强的报道一致[32]。雌性对冷刺激与HRW调控的高敏感性，可能反映氧化还原信号、神经免疫反应或激素对冷敏感感觉通路的性别特异性调控。性别差异在抗氧化能力、线粒体功能与神经免疫信号中，被认为参与慢性疼痛的易感性与恢复差异[33]。重要的是，HRW不改变对照动物伤害感受反应，提示其镇痛效应特异性针对病理性疼痛，增强转化价值。

分子水平上，利血平诱导脊髓显著氧化应激（4-HNE升高）、p-ERK1/2增强与NLRP3上调。氧化应激与ERK依赖性突触可塑性是中枢敏化与伤害感受可塑性疼痛的公认机制[34,35]。HRW使脊髓4-HNE正常化，与H₂的抗氧化与神经保护特性一致[36,37]；同时使p-ERK1/2正常化，强烈提示恢复氧化还原稳态与异常突触可塑性是其镇痛核心机制。

利血平升高脊髓NLRP3，支持神经炎症参与伤害感受可塑性疼痛[38]，但HRW不降低脊髓NLRP3，提示镇痛无需直接抑制炎症小体激活。综上，HRW主要调控氧化还原与可塑性通路，驱动纤维肌痛神经元高兴奋性与中枢敏化。伤害感受可塑性疼痛症状改善无需完全正常化炎症标志物，而依赖氧化还原稳态恢复与神经元兴奋性调控[6]。

重要的是，HRW在脊髓中激活性别特异性抗氧化通路：雄性优先上调HO-1，雌性选择性升高NQO1，提示抗氧化酶激活模式不同；而利血平诱导的SOD-1下调在两性中均被HRW恢复，提示共同基础抗氧化机制。疼痛与神经退行性疾病中抗氧化系统的性别依赖性调控已被认识，可能反映线粒体功能、激素调控与氧化还原缓冲能力的性别差异[33,39]。这些差异可能导致雌性冷异常性疼痛更早出现且对HRW更敏感，冷高敏感受氧化还原敏感离子通道与脊髓兴奋性强烈影响，存在性别差异调控[32,40,41]。

除伤害感受外，利血平在两性诱导显著抑郁样行为，反映纤维肌痛中慢性疼痛与情绪障碍的高共病率[42,43]。该情感改变伴随杏仁核分子改变，杏仁核是整合情绪加工与疼痛情感的核心脑区[25]。利血平下调杏仁核HO-1、上调NLRP3，提示抑郁与疼痛情感相关的脊髓上环路存在氧化应激与神经炎症。与脊髓不同，HRW完全逆转杏仁核HO-1下调与NLRP3上调，提示神经免疫机制对氢气存在脑区特异性敏感性。

HRW使杏仁核氧化还原平衡与炎症小体信号正常化，为其类抗抑郁效应提供合理机制。越来越多证据表明，边缘脑区NLRP3驱动的神经炎症参与慢性疼痛状态下抑郁症状与情感失调[11,44]。因此，HRW可能通过恢复杏仁核神经免疫稳态改善抑郁样行为，而镇痛主要依赖降低脊髓氧化应激与可塑性。这种脑区机制分离凸显HRW作用于疼痛-抑郁轴的多层面机制。

本研究中HRW的治疗效应与抗氧化干预可缓解纤维肌痛症状的证据一致。辣椒素、生姜、姜黄素、n-3多不饱和脂肪酸、葡萄籽提取物、柚皮苷、金雀异黄素等生物活性化合物，在细胞、动物与临床研究中显示有益效应[45]。细胞模型中，这些化合物降低促炎介质、增强抗氧化防御，改善神经元/成肌细胞存活并调控凋亡通路；动物模型中，减轻疼痛高敏感与疲劳，改善纤维肌痛相关行为改变。上述结果支持调控氧化应激与炎症通路是纤维肌痛核心治疗策略。在此背景下，氢气因可选择性中和高活性氧、调控炎症信号、快速穿透生物膜，恢复疼痛与情感加工相关的脊髓与脊髓上脑区稳态，成为极具潜力的治疗手段。

本研究存在若干局限：仅用经典氧化应激标志物评估氧化还原失衡，未直接检测线粒体功能；仅通过NLRP3表达推断炎症小体激活，未检测下游细胞因子；虽控制雌鼠发情期减少激素变异，未来需研究多周期以更全面理解性别差异；本研究采用腹腔注射HRW，与临床常用口服途径不同；且未进行HRW停药后随访，尚不清楚镇痛与类抗抑郁效应是否持续。未来研究需明确HRW治疗效应的持久性。最后，无单一动物模型可完全重现人类纤维肌痛的复杂性。

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 4 材料与方法

 4.1 动物

8–10周龄、体重21–26 g的雄性与雌性C57BL/6小鼠购自Envigo（西班牙巴塞罗那）。饲养于标准实验室条件：12 h光/暗循环、温度（22±1）℃、相对湿度（55±10）%，自由摄食饮水。每笼4只群养于聚丙烯笼，垫料为木屑，环境丰富化包括纸板庇护所与纤维素筑巢材料。每日阴道细胞学监测雌鼠发情周期，行为学测试与组织取材均在间情期进行以减少激素变异。

适应7天后开展实验，遵循欧盟指令2010/63/EU与西班牙法规（RD 53/2013）伦理指南，经巴塞罗那自治大学动物使用与护理委员会批准（伦理批准号：4581）。遵循3R原则，最大限度减少动物痛苦与使用数量。

采用Excel随机序列将小鼠随机分组，G*Power 3.1.7预设样本量（双侧检验，α=0.05，β=0.2），每组至少6只以检测伤害感受与抑郁样行为差异。行为学测试后动物组织用于分子分析以符合减少原则。

行为学测试于上午9点至下午5点进行，动物适应测试环境1小时。每日随机测试顺序，每只动物测试时间不同。一名研究者按随机表给药（仅其知晓分组），另一名盲法研究者评估机械异常性疼痛、热痛觉过敏与冷异常性疼痛。

 4.2 纤维肌痛诱导

参照已建立方案[17]，利血平溶于乙酸并用生理盐水稀释至终浓度0.5%乙酸，第0、1、2、9、16、23天皮下注射0.25 mg/kg。对照动物同期皮下注射溶媒。

 4.3 伤害感受测试

- 机械伤害感受阈值：von Frey纤维丝测试，0.4–3.5 g纤维丝垂直刺激后爪足底，上下法评估缩足阈值。

- 热痛觉过敏：足底实验仪辐射热刺激，记录缩足潜伏期，截止12 s防组织损伤，每侧3次取均值。

- 冷异常性疼痛：冷板（4±0.5℃）放置5分钟，记录后爪抬足次数。

所有测量均进行双后爪检测。

 4.4 抑郁样行为

- 悬尾实验（TST）：距尾尖1 cm处胶带悬挂，距地面35 cm，记录8分钟，统计最后6分钟不动时间。

- 强迫游泳实验（FST）：25 cm×10 cm圆柱，水深10 cm（24±1℃），记录6分钟，统计最后4分钟不动时间。

 4.5 药物

利血平、乙酸、NaCl购自Sigma-Aldrich。HRW由电解制水机新鲜制备，浓度0.3 mM，行为学测试前1小时腹腔注射，体积10 mL/kg。溶媒组注射等量溶媒。

 4.6 实验方案

- 队列1：利血平/溶媒前1天（第0天）及注射后7、14、21、28天评估机械、热、冷异常性疼痛（每组n=6）。

- 队列2：第23–28天连续6天每日给予HRW/溶媒，评估其对伤害感受的治疗效应（每组n=6）。

- 队列3：同给药方案，第28天评估抑郁样行为（每组n=6）。

- 分子分析：第28天取脊髓与杏仁核，Western blot检测4-HNE、NLRP3、p-ERK1/2、HO-1、NQO1、SOD-1（每组n=4）。

总动物数104只，雌雄各52只。

 4.7 蛋白免疫印迹

颈椎脱臼处死小鼠，快速分离腰段脊髓与杏仁核。RIPA缓冲液（含蛋白酶/磷酸酶抑制剂）超声匀浆，4℃孵育1小时，700×g离心20分钟取上清。60 μg蛋白行SDS-PAGE，转印至PVDF膜，5%脱脂奶/BSA封闭。一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1小时，ECL显影，ImageJ定量。

 4.8 统计学分析

采用SPSS 28与GraphPad Prism 9.0，数据以均值±标准误（SEM）表示。Shapiro-Wilk与Bartlett检验评估正态性与方差齐性。

- 伤害感受反应：三因素重复测量方差分析（注射/处理、性别、时间），单因素方差分析+Sidak事后检验。

- 抑郁样行为：三因素方差分析，单因素方差分析+Sidak事后检验。

- 分子表达：双因素方差分析（性别、处理），单因素方差分析+Sidak事后检验。

显著性水平p<0.05。

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 5 结论

本研究证实，富氢水可有效逆转利血平诱导的雄性与雌性小鼠纤维肌痛模型伤害感受与情感异常。其有益效应与脊髓水平氧化应激与异常可塑性正常化、杏仁核氧化还原与炎症稳态恢复相关，凸显疼痛与抑郁的脑区与性别依赖性机制。本研究进一步揭示冷痛敏感性与抗氧化通路激活的性别差异。综上，结果支持富氢水作为纤维肌痛等伤害感受可塑性疼痛的安全且潜在有效治疗策略，并强调未来治疗研发中靶向中枢氧化还原与可塑性机制、纳入性别生物学变量的重要性。