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2.4%氢气改善仔猪缺血缺氧窒息损伤后肾小球增大 精选

已有 4096 次阅读 2025-1-14 10:59 |个人分类:呼吸氢气|系统分类:论文交流

2.4%氢气改善仔猪缺血缺氧窒息损伤后肾小球增大

《科学报告》第15卷,文章编号:1677(2025年)

摘要

据报道,在窒息的新生儿中,有30% - 70%会发生急性肾损伤(AKI)。在发现氢气(H₂)具有强大的抗氧化特性后,其成为了新生儿医学领域的一个主要研究热点。然而,氢气减轻急性肾损伤的能力尚不明确。我们检测了仔猪在遭受缺氧缺血(HI)损伤后第5天肾皮质的组织病理学损伤情况,以及氢气是否能够减轻肾脏损伤。将20只仔猪分为三组:无损伤组(对照组,n = 6)、仅遭受缺氧缺血损伤组(HI组,n = 8)以及遭受缺氧缺血损伤并进行氢气通气组(HI - H₂组,吸入浓度为2.1% - 2.7%,持续24小时,n = 6)。HI组的肾小球细胞总数明显高于其他两组,而HI - H₂组与对照组之间无差异。与对照组相比,HI组近端小管管腔狭窄情况显著增加,但HI - H₂组并无此现象。在该仔猪模型中,观察到在缺氧缺血损伤后第5天,由于肾小管管腔狭窄,出现了肾小球增大且肾小球细胞数量增加的情况。氢气有效地抑制了这种肾小球细胞数量的增加以及肾小管管腔狭窄情况。

Iwaki T, Nakamura S, Wakabayashi T, Nakao Y, Htun Y, Tsuchiya T, Mitsuie T, Koyano K, Morimoto A, Fuke N, Yokota T, Kondo S, Konishi Y, Miki T, Ueno M, Iwase T, Kusaka T. Hydrogen gas inhalation ameliorates glomerular enlargement after hypoxic-ischemic insult in asphyxiated piglet model. Sci Rep. 2025 Jan 11;15(1):1677. doi: 10.1038/s41598-025-85231-8. PMID: 39799178.

引言

窒息约占全球每年估计400万新生儿死亡人数的23%,并且与幸存新生儿的显著发病率相关。窒息的新生儿通常存在多器官功能障碍和/或衰竭情况,新生儿脑病(NE)是这类新生儿面临的一个主要问题。由于在缺氧期间心脏和大脑等重要器官优先灌注,肾脏因局部血管收缩,属于最早受到缺氧缺血(HI)损伤的器官之一。实际上,据报道,在窒息的新生儿中,有30% - 70%存在急性肾损伤。近期多项研究已证实肾脏损伤与不良神经系统预后以及死亡风险增加之间存在关联。

在对人类急性肾损伤的分子病理生理学缺乏基本了解的情况下,大型动物模型(如猪、猴、羊、犬和猫的模型)对于测试新疗法颇具吸引力,因为与啮齿动物相比,这些动物的生理机能和免疫系统与人类更为相似。我们已经建立了一个新生儿脑病仔猪模型,该模型在遭受损伤后能存活5天且伴有脑的组织病理学损伤。因此,该模型可被视为一种与临床新生儿窒息情况相似的转化模型,对该模型中的多个器官进行评估将有助于我们了解临床上缺氧缺血性脑病(HIE)婴儿多器官衰竭的特征,尤其是肾脏方面的特征。

对于患有新生儿脑病的婴儿,轻度治疗性低温(TH)仍是主要的治疗选择,但在接受治疗的婴儿中,仍有40% - 50%会出现死亡或严重的神经功能障碍。在动物转化研究中,表明治疗性低温对改善窒息仔猪急性肾损伤疗效的证据仍较为有限。对分娩时窒息后仅接受治疗性低温的婴儿的临床数据评估得出结论,该疗法并不能降低其急性肾损伤的发生率或严重程度。因此,要进一步改善预后,就需要开发对新生儿脑病和急性肾损伤都更有效的新疗法。

由于氢气在体内和体外针对影响成人的疾病(如脑缺血)都展现出了强大的抗氧化特性,如今它已成为新生儿医学领域的一个主要研究焦点。关键的是,氢气被认为是一种抗氧化剂、抗炎剂以及抗凋亡剂。它通过选择性地降低培养细胞中高活性氧化剂(如羟基自由基(•OH)和过氧亚硝酸盐(ONOO⁻))的水平,起到治疗和预防性抗氧化的作用。我们此前通过评估5日龄新生儿脑病仔猪的短期神经系统预后,报道了氢气通气联合治疗性低温的神经保护潜力。然而,关于氢气减轻急性肾损伤疗效的报道却很少。我们假设我们的新生儿脑病仔猪模型会在肾皮质出现一些损伤,且氢气能够减轻肾脏损伤。因此,在本研究中,我们检测了该新生儿脑病仔猪模型在缺氧缺血损伤后第5天肾皮质的组织病理学损伤情况,以及氢气是否能够减轻这种损伤。

 

结果

HI组和HI - H₂组在遭受损伤后平均血压和心率短暂下降,但随后逐渐恢复。在血气方面,pH值、动脉血氧分压(PaO₂)和剩余碱(BE)下降,乳酸升高,但在3小时后恢复至基线水平,HI组和HI - H₂组之间无差异(表1)。

 

1 对照组、HI组和HI - H₂组在基线、损伤结束时(0小时)以及损伤后1、3和6小时的血气和血糖情况

HI组肾皮质经常呈现出特定的组织学特征,例如鲍曼氏间隙变窄或消失,同时伴有肾小球增大、亨利氏袢管腔结构以及近端小管管腔空间的变化(图1b、e)。这些特征在对照组和HI - H₂组中分别很少见或只是偶尔出现(图1a、c、d、f、g、i)。HI组肾小球中大多数细胞的细胞核和嗜酸性细胞质似乎增大或肿胀。尽管很难准确辨别诸如内皮细胞、系膜细胞和炎症细胞等细胞类型(图1e、h),但在HI组偶尔能观察到一些节段性有核细胞(图1h中箭头所示,推测为中性粒细胞)。在所有组中也都能看到一些α - 平滑肌肌动蛋白(αSMA)阳性细胞(图1j - l,箭头所示)以及CD31阳性细胞(图1m - o,箭头所示)。HI组中与肾小球相邻的近端小管内径明显短于对照组(图1p - r)。

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1对照组(a、d、g、j、m、p)、HI组(b、e、h、k、n、q)和HI - H₂组(c、f、i、l、o、r)肾皮质的过碘酸 - 雪夫(PAS)染色低倍(a - c)和高倍(d - f)放大的代表性图像、高倍放大的苏木精 - 伊红(H&E)染色图像(g - i、p - r)、α - 平滑肌肌动蛋白(αSMA)免疫染色图像(j - l)以及CD31免疫染色图像(m - o)。插图(h、j、k、l、m、n、o)展示了(h、j、k、l、m、n、o)中肾小球的放大图像。HI组(h)中的箭头指示节段性有核细胞,而(j、k、l)中的箭头指示αSMA阳性细胞,(m - o)中的箭头指示CD31阳性细胞。近端小管内径,Di(短双头箭头);外径,Do(长双头箭头)(p - r)。比例尺表示100μm。

 

我们对这些组织学特征进行了形态计量学检测。三组之间的肾小球总数并无显著差异(图1a - c和图2a)。鲍曼氏间隙完全消失且伴有肾小球增大的肾小球百分比在HI组明显高于其他两组,但HI - H2组与对照组相似[图1d - f和图2b:平均值(标准差),对照组为6.1(4.4);HI组为65.0(25.9);HI - H2组为18.4(16.3)]。HI组的肾小球长轴明显长于其他两组,而HI - H2组与对照组之间无差异[图1d - f和图2c:平均值(标准差):对照组为76.7(2.5);HI组为85.8(5.1);HI - H2组为76.0(4.1)]。HI组的肾小球平均细胞总数明显高于其他两组,但HI - H2组与对照组相似[图2d:平均值(标准差):对照组为68.2(5.6);HI组为81.8(9.4);HI - H2组为67.6(6.3)]。发现肾小球增大的百分比与肾小球细胞数量之间存在显著正相关(图3)。另一方面,三组之间肾小球内α - 平滑肌肌动蛋白(αSMA)阳性细胞和CD31阳性细胞的数量并无差异(图1j - l、m - o以及图2e和f)。HI组近端小管内径与外径之比(Di/Do)的百分比明显低于对照组[图1p - r和图2g:平均值(标准差):对照组为40.1(7.6);HI组为23.9(15.8);HI - H2组为29.2(4.4)]。在HI组中,内径与外径之比(Di/Do)的百分比越低,肾小球增大越明显(图4a),不过在肾小球细胞方面未观察到这种情况(图4b)。损伤后低幅整合脑电图(LAEEG)的总时长在两组之间无统计学差异:平均值 ± 均值标准误差(SEM),HI组为18.5 ± 2.8分钟,HI - H2组为15.0 ± 3.0分钟。HI损伤后低幅整合脑电图(LAEEG)的时长可反映脑损伤的严重程度,其与肾小球细胞数量之间呈现显著正相关(图5c),但与内径与外径之比(Di/Do)的值有负相关趋势(图5e)。然而,在HI组和HI - H2组中,其与肾小球增大的百分比均无相关性或相关趋势(图5a、b)。此外,HI - H2组中肾小球细胞数量与内径与外径之比(Di/Do)的百分比之间未显示出任何相关性(图5d、f)。

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2所有组中肾小球的数量(a)、肾小球增大的百分比(b)、肾小球长轴(c)、肾小球细胞数量(d)、α - 平滑肌肌动蛋白(αSMA)阳性细胞数量(e)、CD31阳性细胞数量(f)以及近端小管内径与外径之比(Di/Do)的百分比(g)。三组之间的肾小球总数无显著差异(a)。鲍曼氏间隙完全消失且伴有肾小球增大的肾小球百分比在HI组(■,实心方块)明显高于其他两组,而HI - H2组(△,空心三角)与对照组(●,实心圆圈)无差异(b)。HI组的肾小球长轴明显长于其他两组,但HI - H2组与对照组相似(c)。HI组的肾小球细胞总数明显高于其他两组,而HI - H2组与对照组相似(d)。三组之间α - 平滑肌肌动蛋白(αSMA)阳性细胞和CD31阳性细胞的数量无差异(e、f)。HI组近端小管内径与外径之比(Di/Do)的百分比明显低于对照组(g)。*p < 0.05,**p < 0.01,与HI组相比。

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3 HI组(实心方块)和HI - H2组(空心三角)中肾小球细胞与肾小球增大百分比之间的关系。发现肾小球增大的百分比与肾小球细胞数量之间存在显著正相关。

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4 HI组(实心方块)和HI - H2组(空心三角)中近端小管内径与外径之比(Di/Do)的百分比与肾小球增大百分比(a)以及肾小球细胞数量(b)之间的关系。发现近端小管内径与外径之比(Di/Do)的百分比与肾小球增大百分比之间存在显著负相关。

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5 HI组和HI - H2组中HI损伤后低幅整合脑电图(LAEEG)的时长与肾小球增大百分比(a、b)、肾小球细胞数量(c、d)以及内径与外径之比(Di/Do)的百分比(e、f)之间的相关性。实心方块(a、c、e)表示HI组,空心三角(b、d、f)表示HI - H2组。HI组(实心方块)中,损伤后低幅整合脑电图(LAEEG)的时长与肾小球细胞数量之间呈现显著正相关,且损伤后低幅整合脑电图(LAEEG)的时长与内径与外径之比(Di/Do)之间呈现负相关趋势。

 

讨论

这是首篇关于吸入氢气疗法可改善仔猪肾脏损伤能力的报道。我们的研究结果显示,因肾小球细胞总数升高而导致的肾皮质肾小球增大的百分比在遭受缺氧缺血(HI)损伤的仔猪中有所增加,但在同时遭受缺氧缺血损伤且吸入氢气的仔猪中并未增加。此外,HI组近端小管管腔狭窄情况明显比对照组更严重,但在HI - H2组中并未出现这种管腔狭窄现象。

首先,本研究揭示了肾小球增大可能与肾小球内某些细胞类型的增加有关。一般来说,肾小球增大可由两种机制引起。第一种机制涉及系膜细胞增加以及系膜基质随之增加。第二种机制包括以内皮细胞增殖、肿胀以及炎症细胞浸润为特征的毛细血管内增生。在此,尽管HI组的肾小球细胞总数有所升高,但三组之间α - 平滑肌肌动蛋白(αSMA)阳性细胞数量并无显著差异,这表明肾小球细胞总数升高并非源于系膜增生。虽然在毛细血管内增生过程中,内皮细胞和炎症细胞的数量通常被认为会增加,但三组之间CD31阳性细胞数量并无显著差异。仅靠CD31染色无法证明内皮细胞增殖的存在。不过,在HI组中观察到了分叶核中性粒细胞。因此,炎症细胞浸润可能与肾小球细胞数量的增加有关。在HI - H2组中,肾小球增大情况以及肾小球细胞总数均有所减少。尽管我们无法通过免疫组织化学染色来识别内皮细胞和炎症细胞,但氢气可能减少了毛细血管内增生情况。

其次,在HI组中,近端小管上皮细胞(PTECs)出现肿胀,且小管管腔明显变窄。但是,内径与外径之比(Di/Do)仅反映近端小管管腔的狭窄程度,与肾小球肿胀程度或肾小球细胞数量并无直接关联。我们推测,近端小管管腔的狭窄以及管腔内压力的升高可能使肾小球负荷过重,进而导致肿胀的肾小球数量增加。这种近端小管上皮细胞肿胀的变化被认为是一种急性期变化。此外,此前在成年猪模型中的研究报道显示,在16周后会出现诸如肾小管萎缩等慢性变化,这表明我们在缺氧后第5天所评估的肾脏组织可能代表的是急性期情况。氢气似乎在一定程度上抑制了近端小管上皮细胞的肿胀,因为相较于HI组,并没有样本出现明显更低的内径与外径之比(Di/Do)。可能是缺氧导致了近端小管上皮细胞肿胀,进而通过某种机制引起上游肾小球增大。已有一些关于缺血再灌注损伤(IRI)导致肾小球增大的报道。对大鼠进行的电镜评估显示,肾小球中的内皮细胞、系膜细胞以及肾小管细胞均出现了肿胀。另有报道指出,由于肾小管狭窄或阻塞,有可能造成上游肾小球损伤。而且,新生大鼠间歇性缺氧刺激所导致的肾脏损伤可通过吸入氢气得以缓解。这种缺氧模型呈现出了与我们的研究相同的组织学特征,即肾小管管腔变窄以及肾小球增大。这些报道表明,缺氧刺激会引起近端小管上皮细胞肿胀,进而导致近端小管管腔狭窄以及继发性的肾小球增大。在我们的研究中,吸入氢气疗法改善了肾小球增大、毛细血管内增生以及近端小管上皮细胞肿胀的情况,这或许有助于减轻肾脏损伤。然而,近端小管管腔狭窄的定义尚不明确,而且本研究的数据不足以确定肾小管与肾小球之间的关系。因此,对此问题还需要进一步研究。尽管在本研究中,在给予氢气后出现了肾小管肿胀减轻以及肾小球细胞数量减少的情况,但据报道,吸入氢气疗法可通过对全身各种细胞产生抗氧化、抗炎以及抗凋亡作用,来保护多个器官。这些作用可能共同作用于肾小球和肾小管,以减轻新生儿期缺血性肾脏损伤。在表2中,我们列出了5项关于氢气疗法用于缺血再灌注损伤模型的研究报道,这些研究均是在大鼠身上开展的。尽管氢气给药条件各不相同,但5项研究中有4项显示,由于缺血再灌注损伤,血清尿素氮和肌酐升高以及肾小管间质区域出现损伤,而这些情况通过氢气疗法得到了缓解。这些研究中并没有对肾小球变化的描述。另一方面,西田等人的一项报道中,他们采用了与我们相同的吸入氢气疗法,除了发现缺血再灌注损伤导致的肾小管间质区域损伤外,还确定了诸如肾小球与鲍曼氏囊粘连等肾小球变化情况,而这些情况通过吸入氢气得以缓解。抗氧化、抗炎以及抗凋亡作用被证实为氢气发挥作用的机制。在新生儿脑病仔猪模型中,这些机制可能共同作用于肾小球和肾小管,以减轻肾脏损伤。 2 以往关于氢气疗法用于缺血再灌注损伤模型的研究尽管有许多关于啮齿动物新生儿脑病的研究报道,但鉴于仔猪在发育方面与人类更为相似,所以在围产期使用仔猪进行研究被认为是合适的。就肾脏而言,尚不清楚在围产期啮齿动物还是仔猪与人类更为相似。然而,众多急性肾损伤研究(包括缺血再灌注损伤研究)已表明,仔猪的解剖学、生理学特征、遗传背景以及免疫反应与人类的相似度要高于与啮齿动物的相似度。我们在本研究中关于新生儿脑病仔猪模型肾组织病理学损伤特征的研究结果具有重要意义。此外,在啮齿动物等小型动物身上模拟与复苏后的人类新生儿相似的情况在技术上可能存在困难,但在仔猪身上则是可行的,这意味着这些研究结果可能在临床上更具相关性。我们此前曾报道过窒息仔猪在遭受缺氧缺血损伤后出现肾纤维化的情况,尽管治疗性低温(TH)无法改善这种损伤。肾脏缺氧在病理生理上参与了急性肾损伤(AKI)向慢性肾脏病(CKD)的转变过程。在急性肾损伤发生后,可能由于肾小管细胞中血管内皮生长因子等血管因子表达减少,或者与周细胞脱离有关,导致毛细血管稀疏,进而引起肾脏缺氧。缺氧会损伤肾小管上皮细胞、激活成纤维细胞并引发炎症反应,所有这些都会导致肾小管间质纤维化。缺氧与肾小管间质纤维化形成恶性循环,最终导致病情进展为慢性肾脏病(CKD)。我们认为,慢性肾脏病(CKD)可能是由这种肾脏纤维化在后期引发的。另一方面,本研究着重于阐明急性肾损伤的发病机制。因此,在本研究中,我们聚焦于肾小球和近端小管,因为我们需要寻找其他并非纤维化且与急性肾损伤相关的发现。所以,与之前的研究不同,我们并未对肾脏纤维化情况进行检测。我们的新生仔猪模型呈现出组织病理学脑损伤,且能够存活5天。这是基于低幅整合脑电图(LAEEG)的持续时间以及将损伤期间的脑血容量作为控制损伤严重程度的参数,从而实现了均匀的损伤强度。然而,脑损伤情况仍存在差异,而且损伤后低幅整合脑电图(LAEEG)的持续时间与脑损伤的严重程度相关。在本研究中,HI组中肾小球细胞数量与损伤后低幅整合脑电图(LAEEG)的持续时间呈正相关,这与脑损伤情况类似,损伤后低幅整合脑电图(LAEEG)的持续时间反映了肾小球损伤的严重程度。然而,在氢气组中并未观察到这种关系,这可能表明氢气减少了肾小球细胞数量以及肾小球损伤。我们此前曾报道过吸入氢气联合治疗性低温对短期运动功能的神经保护作用、减少癫痫发作负担以及改善脑血流动力学和氧代谢变化的情况。尽管一些具有此类神经保护作用的治疗药物(如氙气和氩气)对其他器官并没有类似的器官保护作用,但很明显,氢气至少在本研究中对肾脏具有器官保护作用。可以证实,氢气是一种可安全用于新生儿的医用气体。尽管目前尚未有关于新生儿吸入氢气疗法的临床试验报道,但在成年心脏骤停后综合征患者中,吸入4%氢气和96%氧气的混合气体是安全的,不过并未对治疗结果产生影响。只要氢气浓度低于4%,几乎不可能发生着火情况。氢气比氙气、氩气等其他医用气体更为便宜,因此在临床应用中具有成本效益。我们的研究存在一些局限性。针对仔猪的免疫染色试剂准备不够完善,无法对肾小球炎症细胞进行染色,而这原本可以对肾小球内细胞增殖机制进行间接评估。其次,我们无法对复苏5天之后近端小管和增大的肾小球的病情进展情况进行评估。有必要开展进一步研究以确定肾脏的长期预后情况。

结论

在这个具有转化意义的窒息仔猪模型中,观察到在缺氧缺血(HI)损伤后第5天,由于肾小管管腔变窄,出现了肾小球增大且肾小球细胞数量增加的情况。吸入氢气能够抑制这种肾小球细胞数量的增加以及肾小管管腔变窄现象。这些结果表明,吸入氢气疗法可能具有减轻窒息新生儿肾脏损伤的潜力。

 

方法

伦理审批与动物准备

本研究方案已获香川大学动物护理与使用委员会批准(批准编号:15070 - 1),并按照《动物研究:体内实验报告规范》(ARRIVE)指南以及所有其他适用的指南和规定开展,与之前的研究一致。

动物模型与实验方案

选取20只出生24小时内的新生仔猪,对其进行麻醉及手术准备。使用面罩,以空气中含1% - 2%异氟烷(日本东京雅培公司的福仑(Forane®)吸入液)进行诱导麻醉。随后对每只仔猪进行气管插管,并使用婴儿呼吸机进行机械通气。用新生儿脐导管(日本东京阿童木医疗公司的婴儿留置喂食管)对脐静脉和脐动脉进行插管;脐静脉导管用于静脉滴注以及血压监测和采血。插管后,先用枸橼酸芬太尼对仔猪进行麻醉,初始剂量为10μg/kg,随后以5μg/kg/小时的速度持续输注,并用泮库溴铵使其肌肉松弛,初始剂量为100μg/kg,随后以100μg/kg/小时的速度持续输注。通过脐静脉以4 mL/kg/小时的速度持续输注维持液(电解质加2.7%葡萄糖[KN3B],日本大冢制药公司生产)(葡萄糖以2mg/kg/分钟的速度输注)。然后将每只仔猪放置在置于辐射保暖器下的铜网屏蔽笼内,以维持直肠温度在38.0°C ± 0.5°C。通过混合氧气和氮气来制备吸入气体,以达到实验所需的氧气浓度。调整通气参数,使动脉血氧分压(PaO₂)和动脉血二氧化碳分压(PaCO₂)维持在正常范围内。通过脐动脉导管测量并记录动脉血压。

缺氧缺血损伤方案

由于该方案已在我们之前的工作中有详细描述,在此仅提供缺氧缺血(HI)损伤方案的大纲。简要来说,在初始麻醉诱导稳定至少120分钟后,通过将呼吸机吸入氧浓度降低至4%来诱导缺氧。为获得低幅脑电图(LAEEG)模式(< 5μV),如有需要可进一步降低吸入氧浓度,调整时要避免引起心肺骤停。从出现低幅脑电图(LAEEG)开始,持续损伤30分钟。在损伤期间,通过降低(每次降低1%)或升高(每次升高1%)吸入氧分数(FiO₂)来维持低幅脑电图(LAEEG)、心率(> 130次/分钟)以及平均动脉血压(MABP)(> 70%的基线水平)。维持低幅脑电图(LAEEG) 20分钟。在30分钟损伤的最后10分钟内,如果平均动脉血压(MABP)超过基线水平的70%,则通过降低吸入氧分数(FiO₂)来诱导低血压。当脑血容量值降至30%以下和/或平均动脉血压(MABP)降至基线水平的70%以下时,进行复苏。通过使用100%氧气进行复苏来终止缺氧状态。使用碳酸氢钠纠正碱缺失(碱剩余低于 - 5.0 mEq/L),以维持pH值在7.3 - 7.5之间。在100%吸入氧分数(FiO₂)持续10分钟后,逐渐降低呼吸机频率和吸入氧分数(FiO₂),以维持血氧饱和度(SpO₂)在95% - 98%之间。

损伤后处理

在缺氧缺血(HI)损伤后,将20只仔猪随机分为三组:对照组(n = 6)、常温下遭受缺氧缺血损伤组(HI组,n = 8)以及遭受缺氧缺血损伤并进行氢气通气组(H₂组,吸入氢气浓度为2.1% - 2.7%,标记为HI - H₂组,n = 6)。仔猪脱离麻醉、撤下呼吸机并拔管后,让其恢复,并在保育箱中饲养5天。每隔6小时通过鼻胃管给仔猪喂食50 - 100 mL人工动物奶。临床上将有节律的病理性动作(抽搐)以及抽搐发作间隙持续的强直姿势认定为癫痫发作。如果出现癫痫发作,通过肌肉注射苯巴比妥(20mg/kg)对仔猪进行治疗。如果癫痫发作持续,则连续使用两次抗惊厥剂量进行治疗。如果连续使用两次抗惊厥剂量后癫痫发作仍持续,则对仔猪实施安乐死。对于氢气吸入,使用了两种气瓶:一种装有含3.8%氢气和96.2%氮气的混合气体;另一种装有100%氧气。氢气浓度取决于每只仔猪的氧气需求。因此,在治疗期间氢气浓度通常在2.1% - 2.7%之间(吸入氧分数(FiO₂)范围为0.21 - 0.4)。通过呼吸机输送氢气,持续24小时。使用便携式气体监测仪(日本理研计器株式会社的TP - 70D型)测量氢气浓度。治疗24小时后,再次将氢气 - 氮气混合气体替换为压缩空气。

组织病理学分析

在损伤后第5天对仔猪实施安乐死时,将其面部置于面罩中,进行吸入式麻醉。通过蒸发器引入麻醉剂异氟烷,让仔猪吸入蒸汽直至呼吸停止、死亡。用0.9%生理盐水和4%磷酸盐缓冲多聚甲醛对每只动物的肾脏进行灌注。将肾脏包埋在石蜡中并切片。切片(厚度为4μm)用苏木精 - 伊红(H&E)染色法和过碘酸 - 希夫(PAS)染色法进行染色。此外,将切片在柠檬酸盐缓冲液中煮沸20分钟以修复抗原,然后分别用抗α - 平滑肌肌动蛋白(αSMA)抗体(1:200,美国诺维斯生物公司,产品编号NBP2 - 34522,位于森特勒利亚)和CD31(1:50,英国阿贝克隆比公司,产品编号ab28364,位于剑桥)进行免疫染色,随后用苏木精进行细胞核染色。αSMA用于评估系膜细胞增殖情况,CD31用于评估内皮细胞增殖情况。在三个实验组中,于100倍放大倍数下对过碘酸 - 希夫(PAS)染色切片中的肾小球总数进行计数。在每个样本中随机选取10个视野,评估鲍曼氏间隙完全消失且伴有肾小球增大的肾小球与呈现正常组织学外观的肾小球的比例。测量每个样本中随机选取的50个肾小球的平均长轴长度。为评估近端小管管腔阻塞程度,在苏木精 - 伊红(H&E)染色切片中,针对每个样本随机选取的50个近端小管,计算其近端小管内径与外径之比(Di/Do)的百分比。在αSMA免疫染色切片中,对每个样本随机选取的10个肾小球中的肾小球细胞总数以及αSMA阳性细胞数量进行计数。并且在每个样本中对另外随机选取的10个肾小球中的CD31阳性细胞数量进行计数。



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