CEO这里是丁香精油的含义，为什么使用精油和氢气联合？本研究目的是确定这两种方法对于预防动物焦虑和抑郁是否具有联合效应，强强联合产生一加一大于二的作用或叠加效应。当然其前提是这两种方法都有作用，且两种方法的作用基础不一样。研究结果表明这两种方法能产生联合增强效应。设想一下，联合效应的研究能延申出几乎无限的研究课题，如果没有应用价值，这样的联合研究除了增加学术文章外就毫无意义了。

 Additive effect of clove essential oil combined with hydrogen inhalation improves psychological harm caused by lipopolysaccharide in mice | BMC Complementary Medicine and Therapies | Full Text

背景：心理焦虑和抑郁，以及记忆障碍，通常与炎症有关。丁香精油（CEO）的应用和氢气（H2）吸入已被证实对相关的心理障碍具有抗炎和缓解作用。本研究旨在探讨通过CEO和H2联合治疗改善类似焦虑的行为和认知功能的可能性。

方法：小鼠被给予脂多糖（LPS）以诱导炎症和氧化应激反应，导致心理障碍。利用这个动物模型，我们进行了实验来测试精油和H2吸入是否能改善由LPS引起的行为上的心理损害。随后，进行高架迷宫（EPM）、强迫游泳测试（FST）和被动回避（PA）测试，分别评估小鼠的焦虑、抑郁以及对电击的反应。此外，生化分析用于检查炎症和氧化应激标记物的表达水平。

结果：我们的结果显示，单独或组合使用CEO和H2吸入都能积极改善小鼠因炎症引起的焦虑、抑郁和认知记忆缺陷。在单一治疗组中，CEO在高架迷宫、强迫游泳和被动回避测试中显示出比H2吸入更好的结果，而两者的联合治疗提供了进一步的改善增强效果。大脑皮层的生化分析显示，CEO和H2疗法逆转了LPS诱导的炎症和氧化应激反应。

结论：我们的结果建议，CEO和H2的组合有可能治疗心理障碍或神经精神疾病。

介绍

认知功能的下降是一个关键的公共卫生问题，因为它在全球范围内导致了高社会负担。研究表明，许多社会人口学和生活方式因素与老年人群认知功能的变化有关 [1]。最近的研究表明，抑郁和焦虑与认知衰退有关 [2,3,4,5]。虽然许多因素在焦虑和抑郁的发展中起作用，但两者都与炎症增加和免疫系统的激活有关，从而影响神经系统。免疫系统的激活和炎症被发现与认知功能的下降有关。高水平的炎症会导致应激反应系统的激活，即下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，它负责控制我们的应激反应。HPA轴的慢性激活会导致皮质醇水平升高，随着时间的推移会减少海马体中的受体数量，而海马体是大脑中负责记忆的部分。

免疫系统的激活是对压力情况的正常反应，对于神经系统的正常工作至关重要。然而，当免疫系统被慢性激活时，它可以通过产生过多的炎症来造成伤害，这可能会对认知功能产生负面影响。慢性炎症是许多疾病的重要风险因素，包括阿尔茨海默病等神经退行性疾病 [6]。慢性炎症也被认为参与了抑郁和焦虑的发展 [7]，因为重度抑郁症（MDD）患者表现出高的炎症特征。炎症和自由基损伤已知参与越来越多的急性和慢性神经系统障碍和疾病。在啮齿类动物体内系统性给予脂多糖（LPS）已被提出用于生成类似抑郁行为的动物模型 [8]，许多与抑郁相关的不同途径已通过动物模型被识别 [9,10,11,12]。

许多植物在传统草药医学中被提到具有抗抑郁特性，研究试图确定它们在缓解抑郁障碍方面的有益特性。精油是从植物中提取的主要成分，含有具有治疗效果的活性成分。许多精油被发现对中枢神经系统具有生物活性 [13]。丁香精油（CEO；Eugenia caryophyllata）由于其多种生物特性而被证明对人类健康有益，包括抗菌、抗氧化、杀虫和抗病毒活性 [14]。研究表明，预先用CEO处理可以减少动物模型中的抑郁并增强运动活动 [15]。丁香被发现对治疗轻至中度抑郁有效 [16]，CEO被显示在分娩第一阶段减轻疼痛强度和焦虑 [17]。CEO的主要成分是桉叶油素，它通过抑制电压门控钙和钠通道而具有镇痛效果 [18]。CEO的抗氧化活性也被认为在使用于抗抑郁治疗和神经系统障碍治疗中的关键 [19]。

氢气（H2）具有抗氧化性质，因此被认为具有抗炎和抗凋亡性质。H2疗法被提议改善各种疾病的治疗，包括心血管疾病、中枢神经系统疾病、消化系统疾病、代谢综合征和癌症 [20]。最近的临床试验显示出令人鼓舞的结果，H2作为一种有效的疾病管理干预措施。例如，H2吸入已被证明可缓解癌症患者的放射疗法引起的骨髓损伤 [21]，保护心脏免受缺血再灌注损伤，如ST段抬高型心肌梗死患者 [22]，并在作为COVID-19患者的辅助治疗时带来益处 [23, 24]。此外，H2因其抗炎性质被建议用作类风湿关节炎的潜在新治疗方法，这是一种慢性炎症性自身免疫疾病 [25]。总的来说，H2可能在治疗各种疾病中具有重要意义。

本研究调查了通过同时利用具有抗菌和/或抗氧化活性的不同药物来改善大脑功能的可能性。使用由LPS诱导的心理障碍小鼠模型，我们进行了行为实验，并检查了是否给予CEO和吸入氢气可以改善炎症引起的焦虑、抑郁和认知记忆缺陷。这项研究旨在确定两种治疗一起使用是否能在治疗心理障碍中实现叠加效果。

材料与方法

GC-MS分析CEO成分验证

本研究中使用的CEO购自NOW® Foods（美国伊利诺伊州布卢明顿），并在屏东科技大学活性天然产物服务中心（台湾屏东）使用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）进行分析。成分检查使用的是具有30米长度、0.25毫米内径和0.25微米膜厚的硅毛细管HP-5MS柱，配合Agilent 6980 GC系统和5973网络质量选择性检测器。载气为氦气，恒定流速设定为1 mL/min。进样口温度为250°C。此外，炉温首先保持在40°C，然后以每分钟4°C的速度升至90°C，接着以每分钟10°C的速度升至220°C，并维持在220°C达25分钟。样品用己烷稀释10,000倍后，取1 mL稀释后的样品注入此系统中。5973网络质量选择性检测器设置为EI模式，能量为70 eV，质量范围从40到300 m/z。通过NIST 11库数据分析来验证成分，每个成分的百分比通过其峰面积相对于总化合物峰面积的比例来确定。

细胞培养、细胞毒性、抗炎和活性氧物种（ROS）测定

小鼠巨噬细胞样RAW 264.7细胞系由Tzou-Chi Huang博士（屏东科技大学，台湾屏东）提供，用于细胞实验。细胞在含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，并在37°C、5% CO2的湿润气氛中孵育。对于细胞毒性测试，将1×10^4个细胞/孔接种到96孔板中并孵育24小时。之后，用不同浓度的CEO（0-100 µg/mL DMSO）处理24小时，然后使用之前描述的MTT试验进行测定[26]。使用Forecast公式计算精油的IC10值。对于抗炎分析，将不同非毒性浓度的CEO处理到70%融合的RAW264.7细胞上2小时，随后加入1 µg/mL LPS（Sigma，美国密苏里州圣路易斯）再处理24小时。处理后，收集条件培养基和全细胞裂解物，分别使用小鼠IL-6 ELISA试剂盒（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）和小鼠TNF-α ELISA试剂盒（BioVision，Abcam，英国剑桥）分析白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。对于细胞内活性氧物种（ROS）检测，将CEO和LPS处理过的RAW264.7细胞加入10 µM DCF-DA孵育30分钟，然后用PBS洗涤，接着单独或结合非毒性浓度的CEO用0.5 mM H2O2处理2小时。使用荧光计（Turner Biosystems）检测DCF的荧光信号，激发波长为485 nm，发射波长为525 nm。

动物实验

在本研究的动物实验中，使用了8周龄的雄性C57BL/6小鼠作为动物模型，这些小鼠购自LASCO生物技术有限公司（台湾台北）。该项目已获得屏东科技大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（NPUST-110-110）。三十只小鼠被随机分为五组：未处理对照组（第1组）、腹腔注射LPS（5 mg/kg体重）（第2组）、LPS注射并通过口服灌胃针给予溶解在玉米油中的CEO（0.106 mL/kg体重，这是通过重复口服试验28天获得的LD50的1/50）[27]（第3组）、LPS注射并进行每天2小时的氢气吸入（第4组）以及LPS注射并给予CEO（0.106 mL/kg体重），同时进行每天2小时的氢气吸入（第5组）。经过一周的适应期后，根据上述分组对小鼠进行不同处理。为了诱导器官炎症和大脑功能障碍，在第26至28天（总共三天）注射LPS（图1A）[28]。

氢气吸入

用于吸入的氢气是73% H2和27% O2的混合物，以防止缺氧环境，由氢氧发生器（EPOCH，台湾高雄）产生。在实验中，小鼠被放入一个长20厘米、宽18厘米、高15厘米的密闭箱中，每天上午10点至中午12点以200 mL/min的速度供气（图1B）。

图1(A) 35天内五组不同处理的时间线。对于对照组（第1组）小鼠，LPS在第26-28天注射。行为测试在处死前进行。(B) 氢气吸入装置及实验示意图

高架迷宫（EPM）和强迫游泳测试（FST）

动物实验的第29天进行EPM，以评估小鼠的焦虑状态，而第31天进行FST，以评估类似抑郁的情况。EPM装置包括两个开放臂和两个封闭臂。在测试前，用70%乙醇清洁该装置，以去除残留气味。然后，将小鼠放置在EPM装置的中心，面向开放区域，自由探索五分钟。图像通过实验设备上方的数码相机捕捉，并使用AnyMaze跟踪系统软件进行分析。测量开放和封闭臂的总停留时间和进入次数，并计算开放臂的停留时间和进入次数的百分比。

此外，还记录了受保护伸展-注意姿势（pSAP）、未受保护头部下探（uHD）和站立等行为学参数的频率，以提高敏感性和精确度。根据EPM的验证焦虑评估方法[29]，受保护行为被定义为小鼠在封闭臂或迷宫中央区域表现出的行为。相反，如果小鼠在开放臂中，则定义为未受保护行为。对于FST，程序根据之前的研究进行了修改[30, 31]。使用高度为18厘米、直径为12.5厘米的硼硅酸盐玻璃游泳缸，装满1.5升室温水（25±1°C）。为了保持每次实验的水体积一致，游泳缸从底部标记到12.5厘米高度。小鼠被迫游泳6分钟，最后4分钟测量不动时间。如果小鼠失去逃逸导向活动或只是漂浮而不挣扎，并且只移动必要的部分以保持头部高于水面，则被认定为不动。

被动回避（PA）测试

PA测试方法遵循之前的研究[32]。该装置是一个带有透明塑料照明室和另一个不透明塑料暗室的盒子，两者尺寸相同（长19厘米，宽19厘米，高12厘米），并通过滑动门连接。两个室内的地板上都设有直径0.3厘米、间距1厘米的不锈钢棒，只有暗室的地板通电。在第一次测试中，当小鼠进入暗部时，它们的脚会受到冲击发生器产生的0.3 mA/秒电流的冲击。第一天，小鼠被放入光室训练5分钟以探索环境。随后在获取试验后24小时进行记忆测试。将单个小鼠放入光室，记录小鼠进入暗室的潜伏时间和电击次数（错误次数）[32]。

动物实验的生化分析

所有小鼠通过二氧化碳安乐死，收集大脑皮层。样品通过含有1%蛋白酶抑制剂混合物（Sigma, St. Louis, MO, USA）的放射免疫沉淀试验（RIPA）裂解缓冲液均质化。总蛋白通过Protein Assay Dye（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）分离并定量，按照制造商的说明进行操作。提取的蛋白质通过ELISA检测超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和乙酰胆碱（ACh），使用商业试剂盒（BioVision Abcam, Cambridge, UK）。另外，还检查了炎症性IL-6和TNF-α的含量。

统计

所有数据均在三个独立实验中进行，每个实验重复三次，并以平均值±标准差（SD）表示。细胞活力和生化分析的统计计算使用Student’s t检验。动物实验的数据使用SPSS软件版本20（IBM, Armonk, NY, USA）进行分析。使用单向方差分析（one-way ANOVA）进行Tukey事后分析。p < 0.05被认为在指示的组之间有显著差异。

结果

丁香精油（CEO）的化学成分

通过水蒸气蒸馏法从丁香芽中提取出具有丁香香气的清澈黄色液体CEO。GC-MS的结果见图2；表1。总的来说，7种主要成分构成了约99.06%的油。最丰富的成分是桉叶油醇（51.86%），其他成分包括α-法呢烯（12.61%）、乙酸丁子香酚酯（9.97%）、α-古巴烯（9.71%）、β-石竹烯（7.32%）、α-葎草烯（4.24%）和石竹烯氧化物（3.35%）。

图 2 CEO主要成分的GC-MS色谱和保留时间。

表 1 CEO的主要成分及其相对含量百分比

细胞培养系统中CEO的抗炎和抗氧化活性

首先，通过测定细胞在暴露于CEO 24小时后代谢MTT生成甲瓒的能力来确定细胞活力。如图3A所示，随着测试浓度范围的增加，细胞存活率下降。通过函数公式计算得出的IC10浓度为3.96 µg/mL，处理时间为24小时。在浓度超过12.5 µg/mL时出现显著的细胞毒性。图3B展示了CEO的抗炎和抗氧化活性。CEO在非细胞毒性的IC10和两倍IC10浓度下抑制了LPS诱导的IL-6和TNF-α分泌。此外，H2O2处理产生了更高水平的ROS；在IC10浓度下，CEO有效地阻断了H2O2诱导的ROS，而两倍IC10浓度显示出更明显的抑制效果。结果表明，CEO具有抗炎和抗氧化特性。

图 3 (A) CEO对RAW264.7细胞的细胞毒性反应。(B) CEO抑制LPS诱导的前炎性细胞因子和ROS。横轴代表细胞处理条件，CEO浓度为IC10或两倍IC10结合LPS或H2O2。左纵轴代表细胞因子浓度。右纵轴显示相对于介质对照的ROS水平倍数。星号表示与载体对照（A）或仅LPS或H2O2处理（B）相比有统计学显著差异。*p < 0.05, **p < 0.01

CEO给药和氢气吸入联合作用对改善抑郁、焦虑样行为和认知功能的叠加效应

精油对身心的治愈和舒缓作用早已为人所知。氢气吸入也被用来改善认知功能。接下来，我们测试了CEO喂养和氢气吸入是否能保护动物免受炎症引起的焦虑和认知障碍的影响，以及两种治疗方法的结合是否具有叠加效益。高架迷宫（EPM）在没有外部刺激的情况下进行，因此可以直接反映条件反应。同时，观察小鼠四肢的运动可以更准确地评估小鼠的情绪反应。图4A显示，平均而言，单独使用CEO喂养或氢气吸入具有改善焦虑的效果，与LPS处理组相比，开放臂停留时间和进入开放臂的次数增加。联合治疗的小鼠效果显著提高且更为突出。未保护头部下潜（uHD）和站立的频率增加反映了抗焦虑反应；然而，保护性注意姿势（pSAP）次数的增加表明小鼠更加焦虑。评估了小鼠的运动和姿态，发现精油喂养和氢气吸入改善了由LPS引起的器官炎症导致的焦虑反应。精油和氢气吸入的结合效果更为明显。图4B显示了各组小鼠的运动轨迹。此外，通过测量不动时间来评价每组小鼠在FST中的压抑反应。如图4C所示，与对照组小鼠相比，注射LPS的小鼠不动时间增加。CEO或氢气吸入比LPS处理的小鼠显示出显著更高的活动性。CEO和氢气吸入联合处理显示出更明显的效果，与对照组无异。

此外，采用被动回避（PA）测试了解CEO和氢气吸入在被动回避学习记忆障碍中的潜在效果。如表2所示，训练日潜伏时间和错误次数无显著差异。电击建立了记忆。与获取试验相比，各组在保留试验中的潜伏时间和错误次数显著增加。LPS处理的小鼠在保留试验中显示出最短的潜伏时间和最多的错误次数。与LPS处理的小鼠相比，CEO或氢气吸入显著增加了潜伏时间并减少了错误次数。CEO和氢气吸入联合使用产生了更显著的效果。综上所述，这些行为测试的结果证实，CEO或氢气吸入可以减少LPS引起的焦虑和抑郁，并改善记忆障碍。CEO和氢气吸入联合使用更有效。

图 4（A）通过10分钟的高架迷宫（EPM）测试进行焦虑评估。横轴是行为参数。左纵轴是开放区域停留时间的百分比和进入开放区域的次数。右纵轴显示未保护头部下潜（uHD）、保护性注意姿势（pSAP）和站立姿势的频率。(B) 小鼠在10分钟内的运动轨迹。“C”表示封闭臂，“O”表示开放臂。(C) 通过FST评估每组小鼠的平均不动时间。差异通过单因素方差分析后用Tukey检验进行分析。标有不同字母的条形图表示组间显著差异。

表2 CEO喂养和H2吸入对PA测试潜伏期和错误次数的影响

生化分析

使用ELISA分析了大脑皮层中前炎性细胞因子、抗氧化酶和神经递质乙酰胆碱的水平。如表3所示，LPS处理的小鼠IL-6和TNF-α水平增加了约三倍。相反，两种关键的抗氧化酶SOD和过氧化氢酶以及神经递质乙酰胆碱减少了50-60%。CEO或H2干预可以逆转LPS引起的这些脑生化标志物的趋势变化，并且重要的是，同时使用精油和氢气的干预效果更为显著。

表3 CEO和H2吸入对大脑皮层生化标志物的影响

数据以平均值±标准差表示。p<0.05被认为具有显著差异，并用不同字母标记各组之间的显著差异。

讨论

多项研究表明，心理障碍与炎症高度相关。此外，氧化应激和炎症与认知障碍有关，因此抗氧化状态较低的个体常常患有慢性炎症，更容易出现认知衰退[33, 34]。因此，例如，一些药物通过抑制炎症反应来预防阿尔茨海默病的发生，比如非甾体抗炎药（NSAIDs）[35]。除了西医治疗，近年来益生菌也被用来缓解抑郁、焦虑和其他心理障碍。此外，研究发现CEO具有抗抑郁作用，其主要成分桉叶油酚已被证明是一种抗氧化剂，能够减少诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）等炎症标志物的表达[36]。此外，氢气吸入疗法也因其选择性抗氧化潜力而成为一种多功能的治疗手段，可以与细胞中的有毒羟基自由基（HO•）和过氧亚硝酸根离子（ONOO−）相互作用。最近的临床研究还表明，H2疗法减轻了由缺血再灌注引发的器官损伤[22]，并有助于缓解住院COVID-19患者的呼吸道症状[37]。

基于此，本研究使用LPS诱导的心理障碍小鼠模型，调查了结合丁香精油（CEO）和氢气吸入作为治疗策略的潜在效果。CEO成分分析中桉叶油酚的含量超过50%。之前的研究表明，根据提取条件的不同，CEO中的桉叶油酚含量在50到70%不等[38,39,40,41]。尽管其他成分的类型和含量趋势不完全相同，但它们都属于丁香芽精油的成分。除了提取方法外，这些成分的轻微差异主要是由于栽培环境（如气候、土壤条件）、基因型、地理起源、收获期或丁香树的年龄[42,43,44,45]。在体外实验中，CEO处理减少了TNF-α、IL-6和ROS的表达，这表明它具有抗炎和抗氧化特性（图3）。在动物实验中，发现单独使用CEO或H2可以减少焦虑和抑郁样行为并改善认知功能。结果表明，当结合使用CEO喂养和氢气吸入时，效果具有叠加效应。尽管CEO中的桉叶油酚含量超过一半，但之前的研究表明桉叶油酚具有抗炎和抗氧化能力。表1的结果显示，除了桉叶油酚外，这种CEO还包含六种其他化合物，总比例接近一半。在这些化合物中，法尼烯倍半萜烯（α-法尼烯的一种衍生物）和α-葎草烯已被证明具有抗炎和抗阿尔茨海默病的效果[46,47]。α-古巴烯、β-石竹烯、乙酸桉油酚酯和石竹烯氧化物具有抗氧化和抗炎能力[48,49,50,51]。因此，这种CEO在RAW264.7细胞中减少炎症指标和ROS的能力是多种成分累积的结果，还是仅某些成分的效果，这需要进一步确认。

虽然焦虑、抑郁和认知障碍是不同的疾病，但它们也被发现与炎症相关因子密切相关，包括IL-2、TNF-α、干扰素-γ（INF-γ）和其他细胞因子。这些因子导致通过色氨酸代谢在神经调节中发挥关键作用的犬尿氨酸通路失衡[52, 53]。此外，一些促炎细胞因子还被发现通过下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴影响神经系统或内分泌系统，导致相关代谢途径和神经活性化合物分泌的失衡[54]。这揭示了这些疾病与炎症反应之间的相关性。此外，乙酰胆碱酯酶抑制剂可以减少小鼠模型中的神经疼痛[55]，这表明乙酰胆碱及其相关信号通路的激活可以作为疼痛的指标。因此，可以通过评估大脑皮层中的乙酰胆碱含量来确定不同治疗是否减轻了LPS诱导的炎症引起的疼痛，并作为后续行为评估的指标。目前，已经开发出干预性医疗策略来应对犬尿氨酸通路失衡，包括规律运动、选择性血清素再摄取抑制剂（SSRIs）以及犬尿氨酸氨基转移酶II（KAT II）抑制剂，以增加谷氨酸、多巴胺和乙酰胆碱相关分子的水平[52, 56]。除了以前的临床报告外，小鼠也被用作相关研究的动物模型[57, 58]。本研究的结果初步证实，丁香精油可以减少相关的炎症因子并增加抗氧化剂，进一步结合氢气吸入治疗，发现它可以改善与LPS诱导的炎症小鼠心理状态相关的几个行为指标，且对心理损伤疾病的累积治疗效果显著。需要进一步的研究来确认丁香精油和氢气联合治疗在炎症和心理障碍之间的相互作用，包括涉及的信号通路、细胞因子和炎症因子。

结论

总之，我们的研究表明，CEO或H2可以帮助减少小鼠大脑皮层中的炎症和氧化应激，这两者的结合具有叠加效应。此外，这两种联合治疗比单独使用CEO或H2更能改善焦虑和抑郁样行为及认知功能。炎症或氧化应激与认知障碍之间的关系仍需进一步探讨。这项研究可以为未来相关疾病的治疗策略提供依据。