氢气对高氧诱导视网膜病变作用的动物实验研究

早产儿视网膜病变临床上比较常见，对患者视力影响巨大，但目前常规治疗方法如激光和抗血管增殖疗法都存在明显缺陷，寻找更安全有效的防治工具和方法非常必要。氢气是新发现的一种抗氧化抗炎症分子，独特的高安全性和扩散性使之有希望用于眼科疾病，是否能作为早产儿视网膜病变的方法值得探讨。本研究是天津多家眼科医疗机构联合开展的实验研究，初步结果发现，使用氢气不会干扰新生动物眼部生理结构，但能预防高氧气诱导的视网膜典型病变，减少血管增生，这一发现为将氢气用于早产儿视网膜病变临床试验奠定了关键证据基础。未来在这种眼科疾病治疗的应用中，还可以考虑采用局部使用氢气和氢气溶液的方法。

背景

早产儿视网膜病变（ROP）是一种发生在早产儿视网膜上的增生性视网膜血管疾病，是儿童失明的主要原因。如今，抗VEGF和视网膜光凝术是治疗ROP的主流方法，但它们会产生各种并发症。氢气（H2）被广泛认为是一种有用的神经保护和抗氧化治疗方法，用于缺氧缺血性疾病且无毒副作用。然而，氢气是否在ROP的进程中提供生理性血管生成促进、新生血管抑制和胶质细胞保护作用尚不清楚。本研究旨在探讨氢气对氧诱导性视网膜病变（OIR）小鼠视网膜中视网膜血管生成、新生血管和神经胶质功能障碍的影响。

方法

在本研究中，7天大的野生型（WT）或Nrf2缺陷型（Nrf2−/−）小鼠暴露于75%氧气中5天，然后返回正常空气条件。进行了不同阶段的氢气（H2）吸入处理。分析并比较了血管闭塞、新生血管和血管渗漏。通过常规HE染色视网膜切片计数新生血管内皮核的数量。使用DyLight 594标记的GSL I-isolectin B4（IB4）以及针对增殖细胞核抗原（PCNA）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和Iba-1的一抗进行免疫组化。使用蛋白质印迹法测量NF-E2相关因子2（Nrf2）、血管内皮生长因子（VEGF）、Notch1、Dll4和HIF-1α的表达。此外，还测量了NQO1、HO-1、Notch1、Hey1、Hey2和Dll4等靶基因的表达。将用氢气处理的缺氧条件下的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）用作体外模型。使用RT-PCR评估Nrf2、Notch/Dll4及靶基因的mRNA表达。使用免疫荧光染色观察活性氧物种（ROS）的表达。

结果

我们的结果表明，3-4%的氢气不会干扰视网膜生理性血管生成，但可改善OIR小鼠中的血管闭塞和新生血管。此外，氢气防止了由氧诱导损伤引起的视网膜星形胶质细胞密度降低，并逆转了形态和功能变化。另外，氢气吸入减少了小胶质细胞的激活，特别是在OIR小鼠的新生血管区域。氢气通过促进Nrf2激活和抑制Dll4诱导的Notch信号通路，在体内发挥保护性血管再生作用。此外，氢气通过负调节Dll4/Notch通路并通过Nrf2途径减少ROS水平，促进缺氧条件下HUVECs的增殖，这与我们在体内的发现一致。此外，视网膜氧感应机制（HIF-1α/VEGF）也参与了氢介导的视网膜再血管化和新生血管抑制。

结论

总的来说，我们的结果提示氢气可能是治疗POR的有希望的治疗剂，其在人ROP中的有益效应可能涉及激活Nrf2-Notch轴以及HIF-1α/VEGF通路。

Molecular hydrogen promotes retinal vascular regeneration and attenuates neovascularization and neuroglial dysfunction in oxygen-induced retinopathy mice | Biological Research | Full Text (biomedcentral.com)

图形摘要

研究背景

早产儿视网膜病变（ROP）是早产儿的主要眼病和婴儿失明的主要原因[1]。该疾病出生后期有两个阶段。第一阶段，由于母胎相互作用中断和高氧引起生长因子表达受抑制，导致视网膜血管化停滞。随后，除了代谢活跃外，视网膜在返回相对低氧环境后变得缺氧，由多种因素诱导的大量增殖（第二阶段），导致反复的视网膜前出血、纤维瘢痕形成、牵引和视网膜脱离[2]。后一阶段是导致ROP的重要因素[3]。氧化应激和炎症也在ROP的发展中起作用，因为产生和消除活性氧物种和炎症细胞因子之间的失衡发生了[4]。为了更好地理解ROP的分子机制，研究人员使用一种称为氧诱导性视网膜病变（OIR）的小鼠模型，该模型模仿了ROP的临床特征[5]。

作为ROP最有效的治疗方法，激光治疗已经主要取代了当前的冷冻治疗法[6]。不幸的是，这些治疗有着周边视觉永久性丧失和近视高发的缺点[7]。众所周知，血管内皮生长因子（VEGF）是生理性和病理性血管生成的关键调节因子。大量研究支持像VEGF这样的血管生成因子引起ROP的各个阶段[8]。因此，作为一种替代方案，抗血管内皮生长因子药物（抗VEGF）治疗也是ROP的一个有前景的治疗方法[9]。然而，使用抗VEGF药物，特别是在早产儿中，与高复发率和潜在的全身副作用有关。未成熟的视网膜对VEGF更敏感，这导致血眼屏障（BRB）的破坏[10]。更严重的是，它可能进入全身循环并抑制新生儿重要器官中的VEGF受体[11, 12]。这些临床治疗的局限性迫切需要新的治疗策略来治疗或预防ROP，以更高的效率减少复发。增强视网膜血管的生理发育而不产生副作用的治疗已成为近期研究的热点话题。

在过去的十年里，氢分子（H2）被认为是一种新型的治疗性医用气体。2007年，Ohsawa等人在大鼠脑梗塞模型中发现了氢气诱导的保护作用，并强调了其清除气态自由基的能力[13]。氢气具有独特的性质，包括快速扩散到组织中、穿透血脑屏障和血视网膜屏障的能力，以及选择性清除高毒性的ROS，特别是羟基自由基和过氧亚硝酸盐[14]。在细胞水平上，氢气可以进入线粒体，甚至在某些条件下转移到细胞核。除了其ROS清除能力外，氢气还被发现具有抗凋亡、细胞保护和抗炎特性。值得注意的是，氢气可以通过气态扩散轻松穿透目标组织和细胞，而不影响pH或氧饱和度等生理参数[15]。这些独特特性使得氢气成为潜在治疗眼部疾病，特别是影响视网膜的疾病的治疗剂的探索对象。使用光毒性模型的研究表明，氢气可以有效清除自由基并缓解氧化应激，从而防止年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性和糖尿病视网膜病变等条件下的视网膜损伤。氢气还在管理创伤性视神经病变和通过保持抗氧化能力延缓白内障形成方面显示出积极效果。此外，氢气通过减少NF-κB磷酸化和VEGF蛋白水平，展现出治疗角膜碱烧伤的潜在用途。鉴于其强大的抗氧化、抗炎活性和良好的安全性档案，氢气可能成为早产儿视网膜病变（ROP）和其他眼部疾病的宝贵治疗方法[16]。

NF-E2相关因子2（Nrf2）是一种主要的应激反应转录因子，以其细胞内在的细胞保护功能而闻名。Nrf2最为人所知的是作为哺乳动物细胞中调控氧化还原稳态的主调节器[17, 18]。以前的研究报告称，Nrf2的激活保护视网膜免受氧化应激和炎症反应的伤害[19]。此外，Nrf2直接影响正常和缺血视网膜中的视网膜血管生成[20]。因此，Nrf2信号传导已成为ROP潜在治疗剂的一个有希望的目标。分子氢（H2）具有抗氧化和抗炎特性，与Nrf2信号通路的激活密切相关[21, 22]。存在于哺乳动物中的Notch通路对身体的各种组织有着多样的影响。它调节许多胚胎和出生后的发展事件，包括增殖、凋亡、边界形成和细胞命运决定。具体来说，增加Dll4/Notch信号传导会导致血管芽生的抑制。Nrf2的激活在调节Dll4/Notch信号传导中起着至关重要的作用，这对于促进新血管的生长是必需的[20]。此外，一些研究表明，缺氧期间由于ROS升高，缺氧诱导因子-1α（Hif-1α）被稳定并积累。随后，它转移到核中，结合组成性表达的β亚单位（Hif-1β），形成HIF-1[21]。HIF-1结合在编码对缺氧应激反应所需的蛋白质的许多基因上的缺氧反应元件上，例如VEGF[23]。

基于上述内容，我们旨在研究这样一个假设：氢气吸入通过调节Nrf2-notch轴和抑制HIF-1α/VEGF途径，减轻OIR小鼠的血管闭塞和新血管形成，并促进视网膜的再血管化。