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皮下植入镁片释放氢气减少心肌梗塞损伤【哈医大】

已有 584 次阅读 2024-5-18 06:55 |个人分类:氢气生物学|系统分类:科研笔记

心肌梗死(MI)是一种严重影响全球人类健康的心血管疾病。尽管在MI的医疗治疗方面取得了进展,但创新疗法对于提高受影响患者的治疗效果至关重要。

最近,氢气因其抗炎和抗氧化特性而成为MI的潜在治疗剂,它能够中和自由基。目前,吸入是氢气最常用的给药途径。然而,吸入的氢气浓度被限制在4%以下以防止燃烧,这限制了在目标器官中获得更高浓度的氢气。此外,氢气在体内容易扩散,意味着其半衰期短,需要持续摄入氢气,这限制了氢气吸入疗法的疗效。因此,迫切需要一种新方法来克服这些限制。

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镁是一种生物相容性材料,其合金作为可植入材料在临床实践中已广泛使用。值得注意的是,镁具有在接触体内水分时产生氢气的独特能力,反应如下:Mg + 2H2O → Mg(OH)2 + H2。因此,镁作为一种体内产氢器,可以连续产生高浓度的氢气。先前研究表明,皮下植入镁可在体内形成一个富氢腔室,由于氢气的高扩散能力,它可以轻易穿透身体组织到达目标部位。

在本研究中,我们调查了基于镁植入的氢气疗法对MI大鼠模型的安全性和有效性。我们的结果表明,基于镁植入的氢气疗法是治疗MI的一种安全有效的治疗选择。这种方法减轻了线粒体功能障碍产生的自由基,减少了炎症反应,并抑制了心肌细胞凋亡。结果,它改善了心脏功能并减少了心脏损伤。总体而言,我们的发现表明,镁植入是一种比传统氢气吸入疗法更有效的MI治疗方法。

 

材料与方法

材料准备和灭菌

从中国东莞瑞合瑞标标准金属材料有限公司获取镁片。将高纯度(99.995%)的镁锭通过多道次室温拉拔、退火技术和线切割电火花加工成2×2×1毫米的片状。为了去除有机物,使用丙酮对镁片表面进行10分钟的清洗,随后用无水乙醇在超声波设备中清洗10分钟。植入前,镁片用75%乙醇消毒,并使用紫外线曝光30分钟对镁片表面进行消毒。使用高精度电子天平(灵敏度0.1毫克)测量镁片植入前后的质量变化。

 

MI大鼠模型

从北京维通利华实验动物技术有限公司获得体重190-210克的雄性Sprague-Dawley大鼠。所有实验方案均经哈尔滨医科大学机构动物护理和使用委员会批准(IACUC-2021112)。所有动物程序均按照动物伦理处理的相关指南执行。所有动物方法均按照ARRIVE指南执行。为诱发MI,将大鼠插管并用1%戊巴比妥溶液(40毫克/千克)麻醉,并且腹膜内注射布洛芬(0.05毫克/千克)以提供围手术期镇痛。进行左侧肋间胸切开术以部分暴露心脏,并使用6-0尼龙缝线结扎左前降支冠状动脉以引起缺血。通过包括左心室受影响部分的突然苍白和麻痹以及心电图上的ST-T段升高等即时变化来确认MI的发生。假手术(对照)组进行相同的手术程序但不结扎左前降支冠状动脉。在所有实验中腹膜内注射青霉素钠(80,000 U/鼠)以防止术后感染。7天后,对大鼠进行取样。

 

镁植入程序

在麻醉后,将镁植入组的大鼠固定在加热垫上。按照外科指南,沿背部皮肤中线做一个20毫米的纵向切口。创建一个皮下袋,并插入一块镁片(20×20×1毫米)。在缝合前用稀释的青霉素溶液冲洗口袋。假手术组的大鼠进行相同的程序,但没有植入镁。

 

心脏结构和功能的超声心动图评估

使用配备S12-4(4-12 MHz)探头的Philips高分辨率HD11 XE超声系统(荷兰飞利浦医疗超声)进行心脏功能评估的超声心动图检查。一位专门从事心脏成像的心脏病专家进行了所有超声心动图评估。在左侧卧位的胸骨旁短轴视图中使用M模式超声心动图评估左心室功能。为了检查左心室收缩功能,测量了射血分数(EF)和缩短分数(FS)。此外,还测量了左心室舒张末期内径(LVIDd)和左心室收缩末期内径(LVIDs),以评估心脏结构的变化。分析中使用了三个连续心动周期的平均值。还使用该设备探索了皮下气腔的结构。

 

皮下气腔的X射线评估

在麻醉后,将大鼠放置在专用垫上的俯卧姿势,并使用先进的card3040检查模式进行数字减影血管造影(Artis zee ceiling,德国西门子)。辐射头精确旋转到镁片的切线位置,能够准确记录气腔和带有镁片的图像区域。

 

吸入4%氢气

4%氢气吸入组的大鼠每天通过自制装置吸入4%(体积比)氢气3小时,来自氢气发生器的氢气和来自空气发生器的空气通过流量计调节,在一个塑料箱中混合。使用氢气探测器(XP-3140,日本New Cosmos Electric有限公司)验证混合气体中的氢气浓度。对照组、模型组和镁植入组的大鼠同时通过类似装置吸入来自空气发生器的空气。

 

心脏中的氢气浓度监测

使用20%乌拉坦(7 mL/kg)通过腹膜内注射对大鼠进行麻醉,并在氢气监测过程中使用呼吸机支持。使用配备感应阳极(尖端直径:50 μm)的Clark型氢气微传感器(Unisense,丹麦奥胡斯)实时监测器官中的氢气浓度。将微传感器的尖端小心地插入暴露的心脏、肝脏和脾脏1毫米深。通过参考在标准大气压和25°C温度下产生的氢气饱和盐水所产生的校准曲线,对氢气传感器的负电流输出进行校准,以确定局部氢气浓度。

 

透射电子显微镜(TEM)

立即在4°C下用2.5%戊二醛固定左心室游离壁心肌的新鲜样本(约1立方毫米)过夜。随后,从固定的块状物中获得超薄切片,并按照标准的TEM程序进行处理。

 

扫描电子显微镜(SEM)和能量色散X射线光谱(EDS)

使用配备EDS的Hitachi SU5000 SEM对样品的表面形态和化学成分进行表征。将植入皮下的20×20×2毫米矩形镁样品首先用1200目硅碳化物砂纸打磨,然后在丙酮、乙醇和去离子水中分别超声清洗10分钟以去除表面杂质和有机残留物。取出后,再次用丙酮、乙醇和去离子水冲洗样品,然后使用SEM-EDS系统进行表征。

 

2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)染色和梗死面积测量

麻醉后,吸氢心肌梗死组(MI+氢气组)和镁植入心肌梗死组(MI+镁组)开胸。心脏迅速在-20°C下冷冻15分钟,然后从顶端到底部分成五个轴向切片(2毫米)。将切片在37°C下用2% TTC(Solarbio,北京,中国)孵育20分钟。存活的心肌组织在视觉上呈现红色,而非存活的心肌组织呈现白色。然后将心脏切片用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤三次,并使用数码相机成像。随后,使用Image J软件(版本8.4,美国国立卫生研究院)量化整个左心室区域和梗死区域的面积。

 

气压和气腔面积的评估

使用手动眼压计评估气腔的压力。将气腔内的最高点标准化为检查的焦点。选择镁片的长轴视图的X光片进行分析。使用Image J软件评估气腔的面积。所有记录的数据至少分析了三只大鼠。

 

组织病理学、免疫荧光、活性氧(ROS)检测和TUNEL染色

用苏木精和伊红(H&E)染色固定的心脏组织样本。使用免疫荧光染色探索心脏组织样本中8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)的表达。处理后,样品与兔抗8-OHdG抗体(1:1000,Bioss,bs-1278R,北京,中国)孵化过夜。对于ROS检测,BBoxiProbe® DHE荧光探针用于ROS稀释1000倍与蒸馏水,10微米厚的冷冻切片用200微升洗涤溶液处理,然后去除洗涤溶液并添加200微升染色溶液。切片在37°C下暗处孵育30分钟,然后用PBS洗涤。根据制造商的说明,进行TUNEL染色(Roche,美国)以确定心脏组织的凋亡情况。简要地说,冷冻组织切片用4%甲醛固定,用0.1% Triton X-100渗透,并在37°C下用TUNEL反应混合物处理1小时。所有染色的切片都用荧光显微镜(Olympus,东京,日本)成像。随机选择三个视野进行观察。所有图像都以盲法检查。

 

丙二醛(MDA)

丙二醛(MDA)是脂质过氧化的产物,通常用来评估细胞和组织的氧化应激程度。我们测量了大鼠心脏组织中的MDA水平,以评估氧化应激的程度。使用商业试剂盒(BC0025,Solarbio)按照制造商的说明测量MDA。

 

酶联免疫吸附测定(ELISA)

收集心脏和外周血样本后,通过在1000×g离心10分钟迅速且小心地分离血清和红细胞。使用商业ELISA试剂盒根据制造商的说明,确定了外周血中肿瘤坏死因子(TNF)-α(Abbkine,武汉,中国)、白细胞介素(IL)-1β(Abbkine)、IL-6(Abbkine)、心肌钙蛋白I(cTnI)(南京建成生物工程研究所,南京,中国)和脑利钠肽(BNP)(南京建成生物工程研究所)的浓度。

 

 

生化和电解质检测

使用全自动生化分析系统(ARCHITECT c16000,Abbott,美国)进行了血尿素氮(BUN)和尿酸(UA)的生化测试,并测量了钠、氯、钾、镁和钙。

 

线粒体膜电位(MMP)的测定

使用线粒体提取试剂盒(SM0020,Solarbio)从心脏组织中提取线粒体。按照制造商的说明进行MMP测定。使用5 µM JC-1(Beyotime,上海,中国)确定MMP。用JC-1洗涤缓冲液冲洗后,使用显微镜(Olympus)测量荧光。

 

蛋白质印迹分析

使用RIPA缓冲液(Beyotime)提取总蛋白。每个组至少含有5 μg蛋白的样本通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。封闭后,将PVDF膜与各种一抗在4°C下孵育过夜,包括抗Bax(1:1000,ab182733,Abcam,美国)、Bcl-2(1:1000,ab182858,Abcam)、裂解型caspase-3(1:1000,19677-1-AP,Proteintech,中国)、裂解型caspase-9(1:1000,ab184786,Abcam)、细胞色素c(1:1000,ab133504,Abcam)和GAPDH(1:4000,AB2000,Abways,中国)。膜与相应的结合二抗(1:2000,ZSGB-BIO,ZB-2301,北京,中国)孵育。由于目标蛋白分子量相近需要洗脱和重新孵育,所以需要切割膜。然后,通过增强化学发光(Vazyme,南京,中国)使膜显影。使用Image Lab软件6.1(Bio-Rad Laboratories Co., Ltd. US)对蛋白进行定量。

 

统计分析

使用Shapiro–Wilk检验分析数据是否呈正态分布。符合正态分布且方差相等的两组数据可以使用独立样本t检验进行比较。使用单因素方差分析,随后进行最小显著差异事后检验来评估各组之间的差异。连续参数呈正态分布,数据以均值±标准差(SD)表示。P值<0.05被认为具有统计学意义。所有数据均使用GraphPad Prism 9.0.0 for Windows(GraphPad Software Inc., US)进行分析(补充信息)。

 

结果

镁降解和植入后气腔形成

每只大鼠经过无菌手术进行皮下植入一片镁片(2000 mg)。选择纯度超过99.9%的镁以避免其他添加元素对身体产生未知影响。镁植入后1天可见气腔出现(图1A),并在第3、5、7天观察到气腔形态增大。X射线透射成像显示气体量增加(图1B)。同时,气腔的表面张力逐渐增加(图1C)。在第5天和第7天,气腔的张力和面积都显著增加。在植入物周围的组织间隙中观察到气体渗透和皮下多室气腔的结构(图1D)。为了研究镁植入物在体内的降解情况,我们在四个时间点(1、3、5、7天)取出植入的镁片并用丙酮和酒精清洗。植入的镁片在体内降解速率从第5天到第7天显著增加(图1E)。SEM-EDS提供了有关植入镁片的表面形态和化学成分以及其与周围组织相互作用的信息(图1F)。植入的镁片的EDS分析显示存在镁、碳、氧和氯。无论是植入还是未植入的切片,镁峰都是最突出的,表明所使用的镁片纯度高。植入和未植入的镁片中都存在碳和氧,这可能是由于暴露于环境中导致的表面污染或氧化产物。氯的存在可能表明形成了氯化钙,这是炎症的常见副产品。此外,氯的检测表明发生了局部腐蚀,这一点通过镁片表面的腐蚀坑的形成得到了支持。

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图1在大鼠体内植入镁片后,镁发生降解并形成气腔。植入镁片后,气腔的X射线影像随时间变化。X射线中心线与镁片长轴平行投影。时间点为1、3、5和7天(A)。同时记录了气腔张力的变化,并测量了气腔横截面积(n=5)(B,C)。第7天气腔的超声检查。黄色箭头指向的黑色区域代表皮下多腔气腔结构(D)。植入后镁片质量的变化(E)。通过照片、扫描电子显微镜(SEM)图像、能量色散X射线光谱(EDS)以及氧、镁、碳、氯和钙的元素映射来研究植入前(0天)和植入后镁片的腐蚀情况。在特定时间点(1、3、5和7天)系统地取出镁片并进行彻底清洗(F)。EDS,能量色散X射线光谱;SEM,扫描电子显微镜。数据以均值±标准差表示。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。

 

气腔中氢气扩散到器官中

我们通过无菌手术程序暴露器官,允许使用氢电极直接测量氢气浓度(图2A)。用于氢气吸入的方法与镁片植入不同。氢是一种高度可渗透的气体分子,但它不能在体内储存长时间。吸入4%的氢气后,心脏中的氢气浓度迅速增加,大约在5分钟内达到30μmol/L的平稳状态(图2B)。停止吸入氢气后,心脏中的氢气浓度在5分钟内迅速降至基线(图2D)。令人惊讶的是,镁片植入后立即可以检测到心脏中的氢气浓度,并在大约15分钟后缓慢达到平稳状态。尽管氢气浓度的增加比吸入氢气慢,但镁片植入后心脏中的氢气浓度达到了45μmol/L,这比吸入氢气时心脏中达到的最高氢气浓度30μmol/L还要高(图2C)。我们测量了镁片植入后气腔中的氢气浓度,仅记录气腔最高点的数据显示。氢气浓度曲线与心脏中的氢气浓度相似,显示缓慢增加并在大约15分钟时达到平稳状态(图2E)。为了探索镁片植入后氢气的产生以及器官中氢气浓度的稳定性,我们在镁植入后的1、3、5和7天测量了心脏、肝脏、脾脏和气腔中的氢气浓度(图2F-I)。心脏、肝脏和脾脏中的氢气浓度随时间呈上升趋势,且在第5天和第7天所有器官都显示出显著的氢气浓度增加。

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图2腔内的氢气扩散到大鼠的器官中。拍摄高分辨率照片以记录在麻醉的大鼠进行手术并有呼吸支持的情况下检测器官中氢气浓度的过程(A)。在吸入4%氢气期间(n=3),特别是在开始吸入氢气时(B)和停止后(D),测量了大鼠心脏中的氢气浓度。在镁片植入后评估了气腔(C)和心脏(E)中的氢气浓度(n=3)。在镁片植入后的1、3、5和7天,测量了气腔和肝脏、心脏及脾脏组织中的氢气浓度(F-I)。数据以均值±标准差表示。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。

 

镁片植入的生物相容性

为了研究镁片植入的安全性和可行性,将大鼠分为两组。在镁植入组中,将镁片皮下植入大鼠背部。在假手术组中,大鼠仅在背部进行浅表切口,未植入任何镁片。我们对参与镁代谢的相关器官进行H&E染色,包括心脏、肺、肾、肝和脾。同时测量血清电解质和器官功能代谢指标的变化,以探究镁植入对大鼠组织学和血清生化的影响。镁植入组和假手术组的心、肝、脾、肾和肺H&E染色显示无显著病理差异。特别是,肝脏组织显示规则的肝小叶结构,肝细胞大小形状一致,核为圆形或椭圆形,细胞质中散布着小空泡或油滴。脾由红白髓区域组成,脾小体大小/形状均匀,未观察到异常结构或炎症反应。肾小管上皮紧密排列刷状缘,细胞基部有纵向条纹。肾小球呈明确的球形结构,直径约100μm,被含有毛细血管网的囊包裹。观察到完整的红细胞通过肾小球,未见炎性细胞浸润或纤维化形成。肺组织显示规则的肺泡结构,肺泡壁薄而有序,未见肺泡塌陷、充血或水肿(图3A)。在1周内,两组大鼠在饮食、活动或睡眠方面均未表现出明显异常。体重变化曲线在两组之间相似(图3B)。我们比较了镁植入组和假手术组之间的钾、钠、氯、钙、镁、血尿素氮、肌酐和尿酸的血清浓度。这些参数没有显著差异。然而,我们确实观察到镁植入组的血清镁浓度与假手术组相比并没有增加(图3C–E)。

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图3镁片植入后的组织学发现和电解质维持。在镁植入后7天,从假手术组和镁植入组的大鼠身上采集心、肺、肾、肝和脾进行H&E染色(A)。镁片植入后7天内大鼠体重变化(B)。镁片植入后7天的血清Cr、BUN、UA、K+、Ca2+、Mg2+、Na+和Cl−变化(C–E)。数据以均值±标准差呈现,n=5,血尿素氮;Ca2+钙,Cl−氯,Cr肌酐,H&E苏木精-伊红,K+钾,Mg2+镁,Na+钠,UA尿酸。数据以均值±标准差呈现,并通过单因素方差分析进行分析。

 

镁植入减少心肌梗死并改善心脏功能

我们使用TTC染色评估三组大鼠的梗死面积:MI(心肌梗死),MI+氢气和MI+镁。通过将心脏组织等距离切成五个层面以确保各组之间梗死面积的可比性。在MI后7天,MI+氢气和MI+镁组的梗死面积均显著小于单独MI组。MI+镁组(0.03321±0.007746)的梗死面积减少比MI+氢气组(0.1351±0.04981)更为显著(P<0.05)(图4A,B)。在MI后7天获得的大鼠心脏组织病理学检查显示不同程度的坏死和心肌纤维排列紊乱,与假手术组相比,还观察到肿胀、水肿和明显的炎性细胞浸润。单独MI组炎性细胞浸润最明显,其次是MI+氢气组,而MI+镁组炎性细胞浸润最少(图4C)。cTnI被认为是心肌损伤的重要生物标志物。与假手术组相比,MI的大鼠cTnI显著增加(P<0.001)。与单独MI组相比,MI+氢气和MI+镁组的cTnI均显著降低(P<0.001)。镁片植入降低cTnI的效果优于氢气吸入(图4D)。我们在MI后7天使用二维和M型超声心动图评估所有组的收缩功能(图4E)。氢气吸入和镁片植入都显著改善了左室收缩功能。心力衰竭生物标志物BNP的诊断结果与超声心动图的发现一致(图4F)。EF(图4G)、FS(图4H)、收缩末期容积(图4I)和LVIDs(图4J)的汇总数据表明,在MI后7天,与单独MI组相比,MI+氢气组和MI+镁组均有显著改善。此外,MI+镁组在EF和FS方面的效果优于MI+氢气组。这些发现表明,与氢气吸入相比,镁植入在MI后对心脏功能的改善效果更佳。

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图 4镁片植入对大鼠心脏功能和心肌结构的影响。各组代表性TTC染色图像及定量分析(A,B)。各组代表性H&E染色图像。比例尺:50 µm。箭头指示炎性细胞浸润(C)。心脏损伤标志物cTnI的血清浓度(D)。从假手术、MI、MI+氢气和MI+镁组获得的代表性M型超声心动图(E)。作为心力衰竭血清生物标志物的BNP浓度(F)。每组动物的超声心动图测量汇总数据,包括EF(G)、LVIDs(H)、ESV(I)和FS(J)。数据以均值±标准差表示(每组n=5只大鼠)。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。BNP脑利钠肽,cTnI心肌钙蛋白I,EF射血分数,ESV收缩末期容积,FS短缩分数,LVIDs收缩末期左室内径,H&E苏木精和伊红,MI心肌梗死,TTC 2,3,5-三苯基四唑氯化物。

 

在镁片植入后,对心肌梗死大鼠的线粒体损伤、炎症和氧化应激的改善

我们使用冰冻切片和ROS敏感探针检查了镁植入对心肌梗死大鼠总ROS水平的影响(图5A)。使用Image J软件在背景扣除后对ROS荧光进行了定量。与假手术组相比,MI组显示出显著增加的ROS荧光,而MI+氢气组和MI+镁组都显示出显著减少的ROS荧光。值得注意的是,MI+镁组显示出更明显的ROS减少(图5C)。通过8-OHdG的免疫组织化学染色评估了细胞内核酸氧化应激水平的变化(图5B)。与假手术组相比,MI组心肌细胞中8-OHdG的阳性染色显著增加,表明氧化应激造成了损害。MI+氢气组和MI+镁组心肌细胞中8-OHdG的阳性染色较弱,表明氢气吸入和镁片植入在一定程度上缓解了氧化应激。值得注意的是,在MI+镁组心肌细胞中,8-OHdG的阳性染色显著减少,表明镁植入对氧化应激有更强的抑制作用(图5D)。还定量了MDA浓度,以评估术后第7天血清中脂质过氧化的变化(图5E)。与8-OHdG染色和总ROS水平的结果相似,MI+镁组显示出更强的抗脂质过氧化效果(P<0.001)。此外,通过定量血清中的炎症因子(包括TNF-α、IL-1β和IL-6)来评估每组的炎症程度(图5F-H)。MI组显示出明显升高的炎症因子浓度。然而,在氢气吸入和镁植入后,炎症因子的浓度降低。值得注意的是,与MI+氢气组相比,MI+镁组的TNF-α和IL-1β浓度显著降低(分别P<0.001和P<0.01),表明镁植入展现出更强大的抗炎效果。我们同时使用JC-1探针测量了心肌组织中MMP的变化。当MMP正常时,JC-1以聚集状态存在(红色荧光),当MMP降低时,JC-1单体增加,显示绿色荧光(图5I)。在MI组中,JC-1的荧光强度显著降低,表明MMP降低。在MI+氢气组中,JC-1的荧光强度相对稳定,而在MI+镁组中MMP的变化比MI+氢气组更为明显(P<0.05)(图5J)。使用电子显微镜对所有组的心肌细胞进行了进一步的超微结构分析。MI组表现出严重的线粒体肿胀和肌肉纤维紊乱。相比之下,MI+氢气组和MI+镁组都显示出线粒体形态的显著改善和部分肌肉纤维结构的恢复。特别是,MI+镁组显示出比MI+氢气组更大的改善,线粒体肿胀减少,形态接近正常状态,并且肌肉纤维紊乱的恢复更为广泛(图5K)。这些发现表明,镁植入改善了急性MI大鼠的氧化应激、炎症和线粒体损伤。

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图5镁植入对心肌梗死大鼠心脏氧化应激、炎症和线粒体损伤的影响。代表性的大鼠心肌组织用绿色荧光探针染色的总ROS半定量和统计分析的光镜照片,比例尺:50 µm(A,C)。各组代表性8-OHdG染色图像及定量分析(B,D)。大鼠心肌组织MDA含量(E)。大鼠心肌组织细胞因子定量(TNF-α、IL-1β和IL-6)(F-H)。用JC-1染色的纯化线粒体中MMP的变化。红色和绿色荧光分别代表JC-1的聚集态和单体态(I)。计算红绿荧光强度的比值(J)。大鼠心脏组织的电子显微镜图像。黄色箭头指向线粒体。放大倍数:×2000(K)。数据以均值±标准差呈现。使用学生t检验进行组间比较,n=5,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001。IL白细胞介素,MDA丙二醛,MMP线粒体膜电位,MI心肌梗死,ROS活性氧物种,TNF肿瘤坏死因子,8-OHdG 8-羟基-2'-脱氧鸟苷。

 

镁植入减少了心肌梗死大鼠的细胞凋亡

TUNEL检测显示,与假手术组相比,心肌梗死组大鼠心肌组织中TUNEL阳性细胞数量增加(图6A),表明MI诱导了心肌细胞凋亡。与仅MI组相比,MI+氢气和MI+镁组的TUNEL阳性细胞数量减少,表明两种干预措施都减少了心肌细胞凋亡。值得注意的是,镁植入在减少TUNEL阳性细胞数量方面比氢气吸入更有效,表明镁植入在减少心肌细胞凋亡方面更为有效。同时,我们通过Western blot分析测量了所有组别中包括Bax、Bcl-2、细胞色素c、裂解的caspase-3和裂解的caspase-9在内的凋亡相关蛋白的表达(图6B)。结果显示,与假手术组相比,MI组中Bax和细胞色素c的表达显著增高(图6C),表明内在凋亡途径被激活。相比之下,Bcl-2的表达下调(图6D)。氢气吸入或镁植入治疗部分恢复了促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间的平衡,这通过Bax和细胞色素c表达的降低(图6E)以及Bcl-2表达的增加得到证明。此外,在MI+氢气和MI+镁组中,caspase 3和caspase 9的激活也受到抑制,表明凋亡级联反应受到抑制(图6F-G)。这些结果表明,MI诱导了心肌细胞凋亡,而氢气吸入和镁植入都减少了心肌细胞凋亡,镁植入的效果更为显著。说明镁植入在治疗大鼠心肌梗死中产生氢气分子的治疗效果的示意图(图7)。

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图 6镁片植入对心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡的影响。通过双染法评估各组心肌细胞的死亡情况。凋亡细胞(TUNEL阳性细胞)用TUNEL染成红色,心肌细胞核用DAPI标记为蓝色(A)。进行Western blot分析以测量裂解的caspase-9、裂解的caspase-3、Bcl-2、Bax和细胞色素c的表达。GAPDH用作加载对照(B)。裂解的caspase 9、裂解的caspase 3、Bcl-2、Bax和细胞色素c/GAPDH的光密度结果以至少三次独立实验的均值±标准差呈现。数据通过单向方差分析进行处理(C-G)。*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001,****p < 0.0001,n = 3,MI代表心肌梗死。

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图7镁片植入产生的氢气及其对线粒体凋亡途径影响的示意图。镁片植入产生的氢气改善了大鼠心肌梗死后的心脏氧化应激和凋亡。MI代表心肌梗死。

 

讨论

氢气已被证实在心肌梗死(MI)中具有治疗效果。对于急性MI患者,氢气可以安全有效地用于预防不良的左心室重塑。分子氢选择性地中和有毒自由基,不会干扰生理性活性氧(ROS)。氢气的治疗效果显示出浓度-反应关系,但由于当氢气浓度超过5%时存在燃烧风险的安全考虑,目前吸入氢气的浓度限制在2-4%,这限制了其治疗潜力。为了克服这一限制,研究探索了新的氢气给药方法,例如使用纳米载体向体内输送大量氢气或在超声引导下将氢气加载到微泡中并在心脏位置快速释放。这些方法增加了目标器官中的氢气浓度,并显示出与简单的氢气吸入相比更好的效果。然而,这些方法复杂且成本高昂,而且氢气的作用持续时间仍然很短,需要重复注射。在本研究中,我们提出了一种通过体内镁植入产生内源性氢气的新方法,以克服现有方法的局限性。

基于化学反应方程式Mg + 2H2O → Mg(OH)2 + H2,Mg(OH)2在体内高氯环境中不稳定,因为它与氯离子反应形成柔软的氯化镁膜。此外,它还会与体内的碳酸盐和磷酸盐反应,并附着到有机物质上,使得体内反应比镁与模拟体液(如林格氏溶液)的反应更为复杂。通常,镁植入体内后的反应速率在第一周内增加,在第5-7天达到高峰,然后逐渐降低。本研究显示,镁植入后,X射线成像可见气腔随时间明显扩大,镁片的气腔面积和张力在5天后显著增加。皮下观察到多个含气腔。我们选择1周作为研究的终点,以避免由于气腔过度扩大而可能对器官氢气浓度造成的干扰。这一点很重要,因为以前的研究表明,允许肺气肿扩大会增加动物的死亡率。在1周内,动物的体重没有出现异常变化,表明它们的食欲和活力在目前的研究中没有受到显著影响。在固定时间点取出的镁片显示出不同程度的腐蚀。在终点(7天),镁片的质量减少了四分之一(从2.025 ± 0.03989克减少到1.502 ± 0.1086克),表明产生了约500毫升纯氢气。

氢气是一种潜在的抗氧化剂,展现出优异的分布特性,并具有穿透生物膜和扩散进入细胞质的物理能力。氢气能迅速扩散到细胞质、细胞核和线粒体中。此外,氢气还能穿过血脑屏障。这一特点是大多数抗氧化化合物所不具备的。然而,氢气的高扩散能力是一把双刃剑,这意味着氢气不能在目标器官中长期停留。一项先前的研究显示,大鼠血液和组织中的氢气浓度在吸入氢气后30分钟达到峰值,然后在30至60分钟内逐渐降低。在本研究中,我们比较了氢气吸入与镁植入产生的氢气。我们采用了通常使用的每天3小时吸入4%氢气的方法。我们发现,无论是吸入的氢气还是镁植入产生的氢气都容易在器官内循环,并被氢电极检测到。在吸入4%的氢气后,心脏中的氢气浓度在5分钟内达到饱和。在常温常压下,4%氢气在体内0.9%氯化钠流体环境中的最大饱和浓度约为30μmol/L。当停止摄入氢气时,心脏中的氢气浓度在5分钟内恢复到基线,表明氢气迅速从组织中逃逸。镁片植入后,氢气也能迅速产生,并立即在皮肤和器官中被检测到,如前所示。皮下植入的镁片在15分钟内形成一个高浓度的氢气区域。氢气沿浓度梯度迅速扩散到周围器官。在15分钟内,心脏中的氢气达到50μmol/L的平台浓度。这个浓度高于吸入4%氢气所达到的饱和氢浓度。在一个体重200克、正常活动的大鼠中,呼吸率大约为每分钟100次,每次呼吸的潮气量为0.3毫升。在终点,通过呼吸途径可以获得约1500毫升纯氢气。然而,与氧气不同,由于缺乏丰富的氢化酶和储氢蛋白,氢气在体内的快速高效利用受到限制。氧气的生物利用率大约为20-25%。然而,目前还没有关于氢气生物利用率的数据。尽管如此,理论上,它应该远低于氧气。此外,氢气在体内不可储存且迅速逃逸,因此其利用依赖于不间断和持续的摄入。尽管镁植入并没有显示出总氢气摄入量的优势,但由腐蚀的镁片形成的局部氢气浓度梯度使氢气能够轻易地沿其浓度梯度扩散到周围器官。镁片植入后,心脏中的短期氢气浓度(50μmol/L)显著高于吸入所达到的心脏氢气浓度(30μmol/L)。在接下来的1天、3天、5天和7天,各个器官中的氢气浓度显著增加,表明这种扩散效应随着镁片植入时间的延长而逐渐增强。这些发现还表明,镁片植入至少可以维持一周的连续有效氢气释放,涵盖了MI的整个急性期。我们也监测了不同时间点气囊中氢气的浓度。尽管没有统计学意义,但总体氢气浓度呈上升趋势,这可能是由于气囊表面积大,导致产生的氢气与周围环境过度交换所致。总体而言,目标器官的益处无疑依赖于其氢气浓度和氢气暴露的持续时间。我们认为,就目标器官可达到的氢气浓度和达到该浓度后的暴露时间而言,镁植入产氢优于氢气吸入。

镁植入的安全性也是一个重要的考虑因素。大量研究已经证实了镁的良好安全特性,它广泛应用于心血管、肌肉骨骼和肿瘤学领域。此外,在儿童成长阶段进行镁植入已证明具有极佳的安全性。即使在不利条件下,如肾功能不全,镁植入也不会导致镁离子积累。在本研究中,心肌梗死后1周采集血样,与健康对照组(假手术组)相比,没有发现镁离子积累的证据。所有动物的钠、氯、钙和钾浓度均正常,表明没有电解质紊乱。此外,代表肾脏排泄功能的指标,如BUN(血尿素氮)、肌酐和尿酸等,均未见差异,表明镁植入后的代谢反应在人体可承受范围内。对H&E染色的组织切片进行组织病理学检查,未发现肺、肝或脾的细胞形态有显著变化,表明镁植入并未引起器官毒性。

由于镁植入提供了丰富且持续的氢气产生,心肌梗死区域的组织学评估和超声心动图显示,MI+镁组对缺血性心肌损伤的保护效果更为有效,并且梗死面积更小。随之而来的是,与MI+氢组相比,左心室功能得到了更好的保护。即使在完全冠状动脉闭塞的患者中,氢气吸入也能有效提高MI“风险区”的氢气浓度,而目标器官中更高的氢气浓度意味着更好的治疗效果。预计镁植入能够为器官提供更持久和更高浓度的氢气,比氢气吸入具有更优越的保护效果。从机制角度来看,在缺氧的心肌细胞中,线粒体内膜的通透性增加,导致活性氧不受控制地释放,氧化还原平衡被打破,细胞凋亡,心肌细胞数量减少,随后发生心肌重塑和收缩功能障碍。氢气可以改善心肌梗死中的氧化损伤。其抗氧化效应可能与维持氧化应激下心肌细胞内线粒体含量和功能的保扩作用密切相关。心肌梗死后,心肌细胞的线粒体会受损,表现出肿胀、碎裂和纤维化形态,并伴有降低的MMP(线粒体膜电位)。然而,无论是MI+氢组还是MI+镁组都表现出改善的线粒体和肌原纤维结构,以及更稳定的MMP,由于氢气产量更高,MI+镁组的改善更为显著。

ROS(活性氧)介导的线粒体损伤在心肌梗死(MI)中扮演着重要角色31。高反应性和过量的ROS能迅速压倒内源性抗氧化防御系统,触发炎症反应32。MI后心力衰竭中的氧化应激主要是由于ROS生成增强,而不是心脏的抗氧化防御能力下降33。这导致细胞损伤,通过破坏脂质、蛋白质、DNA和RNA,以及MI后异常的线粒体DNA复制/转录和修复34。在线粒体内形成的大部分超氧阴离子不能穿过细胞膜,使得线粒体RNA成为ROS介导损伤的脆弱目标35。相比之下,氢气能迅速扩散穿过细胞膜和脂质双层,到达最有可能产生ROS的细胞核和线粒体36。氢气消耗可能与哺乳动物氧自由基的产生密切相关37。本研究表明,镁植入对线粒体RNA具有强大的保护作用。我们检测到ROS并确认了氢气对过量ROS的中和效果。MI+镁组比MI+氢组表现出更显著的细胞内ROS减少,这与MI+镁组中氢气浓度更高的趋势一致。此外,镁植入显著降低了梗死区域中8-OHdG和MDA的水平,表明镁植入的抗氧化效果至少部分是通过ROS清除来指导的。我们认为,这种有益效果主要是由于氢气的中和特性,它打破了线粒体功能障碍、过量ROS释放、炎症和细胞损伤的有害循环。

氢气已被证明能减少细胞凋亡35。其抗凋亡效果以浓度依赖的方式发生38。凋亡是一个持续的过程,通过镁植入产生的持续产氢足以覆盖MI急性期的凋亡过程39。本研究检查了四组大鼠中凋亡蛋白表达(Bax、Bcl-2、细胞色素c、裂解的caspase 9和裂解的caspase 3)的变化。结果显示,与假手术组(对照;无MI)相比,MI组表现出Bax、细胞色素c、裂解的caspase-9和裂解的caspase-3表达上调,以及Bcl-2表达下调,表明凋亡信号增强。相对于MI组,MI+氢组和MI+镁组在不同程度上逆转了Bax的上调和Bcl-2的下调,反映了氢气保护线粒体完整性的能力,镁植入后效果更强,与线粒体电镜结果一致。细胞色素c、裂解的caspase-9和裂解的caspase-3表达的上调表明内在凋亡途径激活,这与之前的发现一致17。与MI+氢组相比,MI+镁组在减少细胞色素c、裂解的caspase-9和裂解的caspase-3表达方面表现出更显著的降低。总体结果表明,与氢气吸入相比,镁植入更有效地抑制心肌细胞凋亡,通过上调Bcl-2和下调Bax、细胞色素c、裂解的caspase-3和裂解的caspase-9表达,从而可能阻断线粒体凋亡途径。

结论

总之,我们使用大鼠MI模型评估了镁植入产氢与氢气吸入的治疗效果。镁植入克服了氢气吸入在目标器官可达到的氢气浓度和暴露持续时间方面的一些限制。镁植入允许持续稳定的氢气产生,使目标器官达到比氢气吸入可能的更高氢气浓度。通过减少MI中的ROS介导的线粒体损伤、氧化应激和凋亡,这种方法可能为MI的治疗提供了新的见解。

局限性

这项研究有一些局限性需要注意。由于超过1周的气囊扩大对实验动物的影响,我们只获得了镁植入对MI影响的数据,时间限于1周内。尽管1周覆盖了MI的急性期,但我们无法获得镁数据来检查镁植入在MI亚急性和慢性阶段的效果。此外,器官浓度的微电极测量在很大程度上受到测量位置的影响。尽管测量位置是统一的,但每个动物的器官解剖结构可能有所不同;因此,数据波动是不可避免的。此外,我们在体重在190至210克之间的大鼠中植入了2克镁片,相当于它们体重的1%。这个实验代表了从镁植入产氢治疗心肌梗死的初步探索。需要注意的是,在人类实验中存在许多限制,例如个体耐受性和代谢差异。当将实验结果应用于人类治疗时,必须进行进一步的研究和剂量及效果评估。



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