一种经皮传递氢气的测量工具，用于优化皮肤病局部治疗的医疗设备

众多研究已证明，氢气在皮肤病理中具有疗效，且没有归因的不良影响。然而，尚无正式证据表明氢气能够透过皮肤传递。本研究目的是证明这种传递，并表征皮肤中氢气的扩散系数。将大鼠腹部皮肤固定在扩散池的中心。在第一隔室中注入含有不同比例氢气和空气的混合气体。第二隔室包含空气或生理介质+空气。一个氢气传感器连接到第二隔室并记录氢气浓度。然后拟合一个双指数模型来描述氢气浓度。流量的平均值为0.40 nmol·s^−1·cm^−2，而氢气扩散系数的平均值为4.2×10^−5 cm^2·s^−1，这与水中氢气的扩散系数（D=4.58×10^−5 cm^2·s^−1）非常接近。我们的模型确认了设计新方法以传递氢气用于皮肤学应用的主要兴趣，因为在目标区域的局部氢气浓度将比口服给药高出几个数量级。

前言

氢气是一种在众多病理中具有潜在治疗兴趣的分子，尤其是那些具有炎症或氧化成分的病理。自20世纪70年代起，科学界开始对氢气的健康属性产生兴趣。

1975年，Dole团队首次在紫外线诱导的鳞状细胞癌小鼠模型上证明，暴露于2.5%氧气和97.5% 氢气的混合物中，压力为8大气压，持续2周，与在相同条件下暴露于2.5%氧气和97.5%氦气的安慰剂小鼠相比，肿瘤明显消退。

对氢气医学应用的真正重新关注始于2007年Ohsawa等人在《自然医学》上发表的领先论文。这项在大鼠脑梗塞模型上进行的研究显示，氢气疗法显著减少了脑坏死的面积。从那时起，全球范围内关于氢气作为药物候选的研究在许多医学专业中稳步增加，如神经学、病毒学、肿瘤学、心脏病学、肺病学、免疫学和皮肤学。

在皮肤病理学的背景下，已经进行了七项临床试验，并得出非常积极的结论。使用氢气水沐浴，被证明可以改善牛皮癣和副牛皮癣症状。接受氢气水沐浴的患者中有24.4%至少达到了银屑病面积严重度指数（PASI）评分改善75%，而对照组患者仅有2.9%（p=0.022）。两项研究调查了通过水解产生的氢化水对易长痘皮肤的局部应用的影响，似乎证明氢气在这一指标中的有趣属性，尽管存在方法论上的弱点。在常规治疗方案中添加口服或局部氢气被发现在治疗男性职业运动员的运动相关软组织损伤中可能有效。使用释放氢气的面膜被证明能显著提高参与者的皮肤密度，与标准商业化妆品样本相比。在一项前瞻性开放标签的第二阶段研究中，患者口服富氢水，对影响不同器官的慢性移植物抗宿主病有很大疗效。在这项研究中，与单独的标准护理相比，富氢水摄入减少了皮肤疾病严重程度评分66.7%。最后，通过管饲给予富氢水已被证明可以减少22名住院老年患者压疮的大小并促进愈合。这些临床试验证明了氢气对人类广泛皮肤疾病的治疗影响，这些疾病具有重大的公共卫生意义，且没有可归因于氢气的不良影响。五份涉及总共14名患者的临床报告还研究了氢气的各种给药方式（输液、吸入、富氢水摄入、局部应用和富氢水浴）在牛皮癣、寻常型天疱疮、慢性伤口、急性红斑病、皮肤斑点和内脏脂肪中的应用。这些临床案例的结论总是一样的：氢气有益效果且没有可归因的不良影响。

临床前研究还展示了氢气在各种动物模型中（如小鼠、狗和大鼠）的有趣属性，采用了不同的给药方式（富氢水、吸入、静脉或腹腔注射含氢生理盐水HRS以及产氢硅剂）。在这种情境下研究的实验性病理也是多种多样的：特应性皮炎[15,16,17]、皮肤伤口[18]、糖尿病伤口[19]、与缺血再灌注相关的皮肤损伤[20,21,22,23,24]、皮肤老化[25]、放射疗法产生的皮肤损伤[26,27]、炎症性和氧化性皮肤状况[28]以及与UVB相关的皮肤病变[29]。最后，体外研究也证明了氢气（溶解在DMEM中、掺入二氧化钛纳米棒、从硅材料释放）在不同实验性病理条件下的有效性（由UVB暴露引起的氧化应激损伤[30]、高葡萄糖暴露[31]和与UVA损伤相关的皮肤老化[32]）。如果氢气在所有被研究的病理中都有效，尽管它们表面上多样性，这是因为这种分子具有足够通用的抗炎和抗氧化特性，以在皮肤病学中找到众多应用。尽管有这种明显的疗效证据，但仍然没有正式的证据证明氢气可以透过皮肤传递。此外，关于如何传递氢气以实现最佳治疗效果，无论是在给药方式、剂量还是给药计划方面，都没有共识。

本研究的目的是表征氢气在皮肤中的扩散系数及其通过皮肤的流量。这代表了建立管理经皮给药氢气的药代动力学模型的第一步。最终目标将是开发一个评估氢气治疗新配方的模型。

研究方法

皮肤样本

本研究使用的皮肤样本取自11只大鼠（2只Fischer大鼠和9只Wischer大鼠，体重从200到410克）。这些大鼠已经参与了我们工作环境中其他经过验证的实验方案。在取样皮肤之前，它们通过注射钠戊巴比妥（200 mg/kg体重，腹腔内）被安乐死。腹部皮肤被剃毛，特别注意避免割伤和伤口。小心地切割了一个直径为3厘米的圆形腹部皮肤样本。两名独立的实验者通过视觉检查确保没有皮肤损伤。样本立即储存在改良的Tyrode缓冲液中（310 mOsm, HEPES 10 mM, pH = 7.4），在室温下保存，并在收集后最多五分钟内使用。

氢气制备

氢气气体是通过钙氢化物（Sigma Aldrich ref 208027）和水之间的反应产生的，化学反应如图23.1a所示。CaH2被临时在研钵中细磨。将得到的粉末30至100毫克放入一个10毫升的注射器中，1毫升的水放入另一个10毫升的注射器中。然后将这2个注射器连接到一个三通医疗开关上，同时连接一个空的50毫升注射器（见图23.1；a）。打开三通开关使CaH2与水混合形成纯净的氢气，并收集在50毫升的注射器中。为了产生10%（分数f = 0.1）和50%（分数f = 0.5）的氢气混合物，我们使用另一个50毫升的注射器将空气和这种纯净的氢气混合。

图23.1 研究方法示意图

实验设置

扩散实验在室温下使用并排扩散细胞装置（PermeGear）（见图23.1 a）进行。这个设备有两个隔间。Compartment1 是指引入含有氢气的气体混合物的隔间，处于大气压力下。Compartment2是监测氢气浓度的隔间，使用SKY2000气体检测器（ATO, USA）每5秒以ppm为单位进行监测，该检测器放置在与Compartment2连接的旁路中（旁路流速：0.375 L/min）（见图23.1b）。SKY2000传感器每天使用Quintron BreathTracker H 2 Plus®按照制造商的建议进行校准。

皮肤样本被夹在两个隔间之间，避免折叠和泄漏，皮肤的外表面面向Compartment1。该系统通过一个适应隔间外径的塑料紧固件固定。

第一批实验使用了两只Fischer大鼠的皮肤样本（，其中n∈{1, 2}表示皮肤样本编号），在Compartment1中注入纯氢气，在Compartment2中注入环境空气。在这一系列实验中，分析的空气总体积，包括Compartment2和旁路的体积，估计为30毫升（）。

第二批实验（）在Compartment1中使用了10%，50%或100%的氢气，在Compartment2中有5毫升搅拌的生理缓冲液（改良Tyrode）。分析的空气总体积估计为25毫升。9只Wistar大鼠的皮肤样本被用于实验。然后缓慢地将含有10%，50%或100% 氢气浓度的气体混合物注入Compartment1。在注射结束时开始在Compartment2中测量氢气。实验的总持续时间根据注入混合物的氢气浓度不同，从30到90分钟不等。

在  实验中对两室（气体/皮肤/空气）的氢气浓度进行建模

我们用下标i∈{1, 2, O}和j∈{1, 2, O}来表示与每个隔间相对应的变量（其中下标O表示隔间的外部，因此Compartment0表示环境空气）。

以下方程组模拟了隔间之间氢气的交换。环境空气中的氢气浓度被视为~550 ppb[33]，因此可以假设( cO(t) = 0 )。在此基础上，我们可以假设从Compartmenti泄漏的氢气与( ci )成正比。菲克定律指出，氢气通过皮肤的流量( J{ij} )是由Compartmenti和Compartmentj之间的氢气浓度梯度驱动的，即 J_ij = k_ij(ci - cj)，其中( k_ij )是根据皮肤厚度和氢气在皮肤中的扩散系数决定的传播系数。

因此

假设 c1相对于c2可以忽略不计是合理的，因为( c2(0) = 0 )，并且如结果部分所述，实验的持续时间不允许 p2 上升超过400 ppm（对应于( c2 = 17× 10^-6），而 p1保持大于10,000 ppm（对应于 c1 = 420× 10^-6），因此c1/c2>25。

因此

在Compartment2中测量到的氢气浓度是由氢气从Compartment1通过皮肤样本流动，以及从Compartment2泄漏的结果。

因此

在实验中用测量数据拟合模型（气体/皮肤/空气）

Compartment2中的泄漏比Compartment1中的泄漏更为重要，因为使用SKY2000传感器测量氢气意味着需要使用管道将气体从Compartment2内部循环到传感器的测量室。因此，k2O > k1O，以至于c > b（由于V1和V2没有很大差异）。因此，在某个时刻，存在tm，当t > tm时，有e^−bt 》e^−ct，以至于后者可以忽略不计：

tm是通过视觉观察Ln[p2(t)]的图表来定义的，作为t的值，在这个值上可以认为这个图表变成了一条直线（这是通过计算线性模型对所有的点ti > tm的Ln[p2(ti)]值的相关系数来验证的）。因此，对Ln[p2(t)]图表最后部分的线性拟合产生了系数d和b。我们现在可以估计系数c，因为从(23.13)我们得出 

为了估计系数c，因此我们将线性模型拟合到Ln[de^−bti−p2(ti)]的值上，并通过计算相应的相关系数来检查这个模型的适合度。最后，我们通过计算集合{p2(ti)}和{d e^−bti−e^−cti}之间的相关系数来验证完整模型的拟合度。

在 实验中估计氢气流Jij（气体/皮肤/空气）

现在我们已经估计出了系数b、c和d，我们可以解一个包含未知数k₁₂、k_1O、k_2O的线性方程组，即方程(23.10)至(23.12)。我们使用方程(23.14)从d中推导出a。我们得到

这就产生了隔室间氢气流动的值：

在实验中估计流J12（气体/皮肤/空气）

我们之前描述的模型不再适用，因为现在在Compartment2中我们有两种相态（改良的Tyrode液和空气）。液相的存在在氢气能在气相中被测量之前产生了一个延迟tm，因为氢气首先需要通过液相，然后需要使其在液体中的浓度与气体浓度平衡。此外，对于足够小的t值（t < tM），c1(t)可以被认为是几乎恒定的，因为在这段时间内，穿过皮肤或泄漏到外部的氢气量非常有限（所以我们可以假设对于t < tM，c1(t) ~ c1(0)）。最后，c2(0) = 0，tM可以选择得使得对于t < tM，c2(t)保持可以忽略不计。因此，对于tm < t < tM，方程(23.6)可以被简化为

为了估计tm和tM，我们直观地观察p2(t)的图表，并将tm和tM定义为图表保持线性假设的极限值（通过计算相关系数来验证这一假设）。应当注意的是，这些近似提供了对J12真实值的低估，因为我们没有考虑到氢气的泄漏。

研究结果

通过实验（气体/皮肤/空气）估计跨皮肤流动的估算

之前描述的双指数模型被应用于协议（Gas/Skin/Air）的两个独立实验中。表23.1显示了估计的经皮氢气流量。两个估计的特定流量分别是 = 0.48 nmol.s^-1.cm^-2和= 0.32 nmol.s^-1.cm^-2。图23.2展示了实验中实验数据与理论模型之间的拟合，相关系数非常高，r = 0.995（对于实验，我们得到了r = 0.999）。

使用实验（气体/皮肤/空气）估计通过皮肤的流动

这个实验在9个皮肤样本上进行，以f 1(0)的值为{1; 0.5; 0.1}。实验的原始数据如图23.3所示，仅供说明之用。对于每一个皮肤样本，根据之前描述的方法，选择了一个图形可以视觉上认为是线性的窗口，并拟合了一个线性模型。应用于窗口的线性模型如图23.4所示，作为一个例子。

讨论

第二组实验E（气体/皮肤/缓冲液/空气）的结果证实，氢气能够穿透皮肤。如图23.5所示，可以认为Compartment1中氢气的初始浓度f 1(0)与特定流量之间存在线性关系的假设是成立的（相关系数r = 0.985）。这与菲克定律所教导的内容一致（流量与两个隔间中浓度的差异成正比）。值得注意的是，实验中估计的特定流量大约是第一组实验（气体/皮肤/空气）所得估计值的7倍。实际上，在f_1(0) = 1的实验中，特定流量估计值的平均值为0.061 nmol.s^-1.cm^-2，而实验中的两个特定流量估计值为0.48 nmol.s^-1.cm^-2和的值0.32 nmol.s^-1.cm^-2。这是因为前面提到的原因，即用于估计实验中氢气流量的方法没有考虑泄漏，因此低估了经皮流量。用于解释实验的模型使我们能够考虑泄漏，并更准确地估计经皮流量。然后可以以以下方式估计氢气通过皮肤的扩散系数。在本研究中，通过光学显微镜估计皮肤厚度从0.40到0.95毫米不等，平均值为e = 0.8毫米，这与文献[34, 35]相符。设d1（相应地d2）为皮肤与Compartment1（相应地Compartment2）界面处皮肤中的氢气浓度。由于皮肤的盐度约为9 g.L^-1，室温为T = 20°C，氢气在皮肤中的溶解度可以估计为770 μmol.L^-1[36]。在实验中，f 1(0) = 1，并且f 2(0) = 0。因此，d1 = 770 μmol.L^-1且d2 = 0 μmol.L^-1。设Dns为实验中第n只大鼠皮肤的氢气扩散系数的估计值。菲克定律表明

考虑到获得的的估计值，我们得到 = 5 × 10^-5 cm^2.s^-1，以及 = 3.3 cm^2.s^-1。这些估计值与水中氢气的扩散系数（D = 4.58 × 10^-5 cm^2.s^-1，[37]）非常接近。因此我们可以得出结论，皮肤对氢气的阻碍作用不比水大。这些发现证实了经皮给药氢气可以是非常有效治疗皮肤或皮下病变的方法，因为局部氢气浓度将显著高于摄入富氢水。假设我们针对一个表面积为1 cm^2、深度为1 cm的皮肤病变，并且这个病变的表面在1小时内暴露于饱和氢气的液体中（例如，可以通过使用[3, 14]中的富氢水浴来实现）。应当注意，使用饱和氢气的水浴等同于我们将皮肤暴露于100%氢气的气体中，正如我们在实验中所做的。假设通过病变表面的氢气流量是我们在这些实验中估计的最小值， = 0.32 nmol.s^-1.cm^-2。在1小时内，1 cm^3体积的病变将接收到1.2 μmol的氢气。这与相同体积通过其他氢气给药方式接收到的量相比如何，是需要考虑的。Ito的团队报告说，摄入200 mL饱和氢气的水后，呼出气中的氢气浓度在大约45分钟内恢复到基线水平[38]。呼出气中氢气的最大峰值浓度约为25 ppm。在37°C下氢气的溶解度约为730 μmol.L^-1，这对应于静脉血中约18 nmol.L^-1的氢气浓度。对于一个70公斤的成年人，假设体内水分量为45 L，心输出量为5 L.min^-1。每升水分量由0.11 L.min^-1的心输出量灌注。如果我们考虑在45分钟内氢气静脉浓度保持在18 nmol.L^-1，这意味着在45分钟内，1 cm^3体积的目标接收到0.08 nmol的氢气，这比通过局部给药饱和氢气的水在1 cm^3皮肤病变中传递的量少了4个数量级。这解释了富氢水浴对皮肤病变（例如牛皮癣[3]）显著疗效的原因。

结论

我们已经证明了氢气透过皮肤的过程遵循菲克定律，并且获得了一个非常接近于水中氢气扩散系数的皮肤对氢气的扩散系数。这些发现确认了设计新方法传递氢气用于皮肤病学应用的重大兴趣，因为目标区域中的氢气局部浓度将比口服给药所能实现的浓度高出好几个数量级。