遗传, 2020, 42(10): 929-948 doi: 10.16288/j.yczz.20-107

真核生物起源研究进展

高志伟,1, 王龙,2

1. 南京大学匡亚明学院,南京 210023

2. 南京大学生命科学学院,医药生物技术国家重点实验室,南京 210023

Progress in elucidating the origin of eukaryotes

Zhiwei Gao,1, Long Wang,2

1. Kuang Yaming Honors School, Nanjing University, Nanjing210023, China

2. State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210023, China

摘要

作为重大进化谜题,真核生物起源的研究对于解码真核基因组、阐释真核细胞内部结构之间的关系有重要启示作用。在1977年美国微生物学家Carl Woese发现古细菌并提出三域生命之树之后,大量研究显示古细菌与真核生物在进化上存在着密切联系。21世纪以来,系统发育分析方法不断改进,泉古菌门(Crenarchaeota)、广古菌门(Euryarchaeota)之外与真核生物更加相似的新古细菌门类也相继被发现,这些证据更加支持将真核生物与古细菌合并为一域,形成二域生命之树。目前,通过宏基因组技术发现的Asgard古细菌是与真核生物进化距离最近的原核生物。然而,真核生物祖先的身份以及线粒体起源的时间等核心问题仍是学术界争论的焦点。本文结合近年来国内外研究成果,从生命之树的形态变化与真核生物演变的具体机制两个角度梳理了目前对真核生物起源的认知过程、现有水平和研究前景,以期为揭示真核生物起源进程的后续研究提供参考与指引。

关键词： 真核生物起源 ; 生命之树 ; 古细菌 ; 三域 ; 二域 ; 内共生 ; 线粒体 ; Asgard超门

Abstract

Knowledge of the origin of eukaryotes is key to broadening our understanding of the eukaryotic genome and the relationship among internal structures within a eukaryotic cell. Since the discovery of archaea in 1977 and the proposal of three-domain tree of life by the American microbiologist Carl Woese, the intimate relationship in evolution between eukaryotes and archaea has been demonstrated by considerable experiments and analyses. From the beginning of the 21st century, with the development of phylogenetic methods and the discovery of new archaeal phyla more related to eukaryotes, increasing evidence has shown that Eukarya and Archaea should be merged into one domain, leading to a two-domain tree of life. Nowadays, the Asgard superphylum discovered via metagenomic analysis is regarded as the closest prokaryotes to eukaryotes. Nevertheless, several key questions are still under debate, such as what the ancestors of the eukaryotes were and when mitochondria emerged. Here, we review the current research progress regarding the changes of the tree of life and the detailed eukaryotic evolutionary mechanism. We show that the recent findings have greatly improved our knowledge on the origin of eukaryotes, which will pave the way for future studies.

Keywords： eukaryogenesis ; tree of life ; archaea ; three domains ; two domains ; endosymbiosis ; mitochondria ; Asgard superphylum

PDF (1503KB) 元数据 多维度评价 相关文章 导出 EndNote| Ris| Bibtex  收藏本文

本文引用格式

高志伟, 王龙. 真核生物起源研究进展. 遗传[J], 2020, 42(10): 929-948 doi:10.16288/j.yczz.20-107

Zhiwei Gao. Progress in elucidating the origin of eukaryotes. Hereditas(Beijing)[J], 2020, 42(10): 929-948 doi:10.16288/j.yczz.20-107

http://www.chinagene.cn/article/2020/0253-9772/0253-9772-42-10-929.shtml

真核生物起源被称为生物界仅次于生命起源的第2大谜团[1]。加拿大著名微生物学家Roger Stanier曾指出：“原核生物与真核生物细胞之间的差异是当今世界中已发现的最大的单一不连续性”[2]。虽然许多原核生物已经具有带有膜的内部组织结构[3],但真核生物的复杂程度却远高于此。真核生物具有核膜包被的细胞核,将转录与翻译过程分隔开,为基因调控提供更多选择[4];众多细胞器组成的内膜系统使细胞具有精密高效的运输和代谢功能[5]。这些结构增强了真核生物的环境适应能力,使其演化为现存物种中数目占大多数的生命形式。

从原核到真核这一巨大转变通常在教科书中被过度简化为一个迅速的单一事件[6]。然而从时间上看,化石记录显示目前最早的真细菌[7,8]和古细菌化石距今约35亿年,相比之下,真核生物化石距今约18亿年[9],与利用分子钟计算的17~19亿年时间相一致[10],由此推算出的原核生物和真核生物的出现时间相差17亿年之久。阐释这一漫长历史过程中真核生物的演变历程对人们认知真核生物乃至人类自身的细胞和基因组结构至关重要。

真核生物的祖先是什么?真核生物演变的具体机制是什么?这两大核心问题也成为学界长久以来争论的焦点。其中,尤其是真核生物在生命之树上所处的关键节点位置,以及线粒体的起源问题上,依然存在有很大的分歧。近年来,与真核生物进化密切相关的Asgard古细菌超门的发现[11,12]以及其在实验室条件下培养研究的实现[13],为解决这一僵局带来了光明。因此,本文在回顾历史的基础上,重点聚焦近年来在该领域取得的重大研究进展,从生命之树和演化机制两个角度深入阐述真核生物的起源问题。

1 生命之树中的真核生物

1.1 古细菌的发现和三域生命之树的提出

1977年,美国微生物学家Carl Woese通过16S/18S rRNA序列系统发育分析偶然发现了古细菌。他们据此将原核生物分为两大类——真细菌和古细菌,并将真细菌、古细菌和真核生物各分为一个“域”(Domain),作为比“界”(Kingdom)高一级的分类系统,分别命名为细菌域(Bacteria)、古菌域(Archaea)和真核域(Eukarya)[14]。自此,真核生物在分类学中的位置迎来巨变,利用保守基因为所有细胞生命建立分类系统的方法开始流行。20世纪80年代末,基于基因重复(gene duplication)[15]和SSU rRNA[16]的研究发现真核生物虽与古细菌形态差异大,但属于姐妹群(sister groups),具有一个独立于真细菌之外的共同祖先。据此,Woese等[16]提出了著名的三域(three primary domains, 3D)生命之树(tree of life/ universal tree),包含细菌域、古菌域(分为泉古菌门和广古菌门)和真核域(图1)[17],长期以来得到各类教科书和文献的广泛认可[18]。

20世纪80年代到21世纪初,许多研究发现古细菌和真核生物在分子层面上高度相关,直接或间接地为Carl Woese的三域生命之树提供证明。在遗传信息复制、转录和翻译水平上,真核生物与古细菌具有许多真细菌不具有的相似性。例如,免疫学实验[19]和进化计算[20]都证明古细菌依赖于DNA的RNA聚合酶与真核生物的结构同源性。真核生物与古细菌的启动子和转录起始因子、30种共有的核糖体蛋白、翻译因子、DNA复制相关的部分酶、组蛋白等都体现出真细菌所缺乏的相似性[21]。此外,真核生物和古细菌具有多种相似的、维持细胞基本生存的酶和代谢通路,如液泡ATPase、分泌通路、辅酶A生物合成的部分酶以及嘧啶和精氨酸生物合成的部分酶等[21]。古细菌细胞分裂系统内的部分蛋白甚至与真核生物的内体分选复合体同源[22,23]。如此多的进化关联性使古细菌成为揭示真核生物起源的重要研究对象[24]。

当然,古细菌和真核生物之间也存在许多差别。最为显著的是膜脂,古细菌采用醚键相连,而真核生物采用酯键相连;古细菌的甘油磷酸骨架使用甘油-1-磷酸,而真核生物和真细菌使用甘油-3-磷酸,两者由不相关的酶合成。古细菌还拥有独特的产甲烷代谢途径、DNA拓扑异构酶和DNA聚合酶等[21]。此外,真核生物与真细菌也有代谢[25,26]和膜化学性质[27]的部分相似之处。

图1

图1   Carl Woese的生命之树

Carl Woese依据16S/18S rRNA系统发育分析发现古细菌后,将自然界中的生物分为真核域、细菌域和古菌域三域。根据文献[17]修改绘制。

Fig. 1   Tree of life proposed by Carl Woese

1.2 二域与三域的争端

虽然Carl Woese提出的三域系统(图2A)受到广泛认可,但同时期,Lake等[28]依据核糖体结构证据、Rivera和Lake[29]依据延伸因子EF-1α同系物保守区有共同氨基酸插入的证据,提出真核生物是泉古菌门的一个姐妹群,即真核生物是从古细菌域之内产生的,是二级域,而一级域仅为真细菌和古细菌,形成二域(two primary domains, 2D)生命之树(图2B)。人们对应地提出了许多演化模型支持二域系统,实质均为古细菌与细菌之间的相互作用[30],如支持泉古菌门(Crenarchaeota)与细菌相互作用的泉古菌假说(eocyte hypothesis)[28,29],广古菌门(Euryarchaeota)与细菌相互作用的氢假说(hydrogen hypothesis)[31]和互养共栖假说(syntrophic hypothesis)[32]等。

图2

图2   三域与二域生命之树的对比

A：三域系统;B：二域系统。AB图中的1、2、3分别对应真核域、古菌域和细菌域的最近共同祖先;真核域与古菌域是两个距离遥远的姐妹群,具有一个最近共同祖先4。B图中真核域的最近共同祖先1直接产生自古菌域内,所以古菌域的最近共同祖先2同时也是古菌域和真核域的最近共同祖先,这与A图的情况不同。根据文献[21]修改绘制。

Fig. 2   Comparison between the two-domain and three-domain tree of life

21世纪的第一个10年中,生物信息学蓬勃发展。从系统发育重建的角度看,三域与二域的争端依然激烈。在2003~2009年发表的7篇文献中,通过真核生物、真细菌、古细菌物种取样,测定基因组中的系统发生信号(phylogenetic signal)标记,进行大规模系统发育学分析,3篇文献得出三域系统结果[33,34,35],4篇文献得出二域系统结果[36,37,38,39]。7篇文献采用的数据和方法比较如表1所示。

表1   2003~2009年间发表的7篇阐释生命之树中古细菌与真核生物关系的文章比较

Table 1  Comparison among results from seven publications elucidating the relationship between eukaryotes and archaea in tree of life, published from 2003 to 2009

3D：三域系统;2D：二域系统;HGT：水平基因转移。表格根据Gribaldo等[21]的综述拓展。

新窗口打开| 下载CSV

值得注意的是,上述7篇文献使用数据在很大程度上有重叠,大多基于蛋白相邻类的聚簇(Cluster of Orthologous Groups of proteins, COG)数据库,最终却得到了截然不同的结论,集中体现了系统发育学方法在解决真核生物起源时面临的典型难题：

(1)长期的碱基替换导致基因组中遗留的系统发育信号很微弱,若使用单基因位点或较短的16S rRNA、18S rRNA分析跨域的物种,背景噪声大,可以得到的有效信息很少,如前述Harris等[33]与Yutin等[35]两文的方法正如此。同时,单个基因可能受基因特异性事件影响(如基因重复、丢失和转移),不能反映真实的物种进化情况[40,41]。

(2)为解决单基因信号微弱的问题,许多研究采用了分散基因串联(concatenation)的方法[34,38,39],即将多个不连续的基因直接串联组合为“普遍基因”(universal gene),序列对齐后再统一分析。但此举的局限性在于真核生物起源分析的范围广,真核生物、古细菌和真细菌3个类群跨域分析时很可能将非同源蛋白强制对齐,在组合基因时人为引入偏差[21]。此外,可供大范围跨域分析的“普遍基因”本身数量也十分有限。

(3)同样为解决单基因信号微弱的问题,有研究采用全基因组比对,但局限性在于可用的全基因组数据比单基因数据少,且计算更加复杂。选取物种数少时,结果受抽样本身影响大,例如Rivera和Lake[36]仅仅使用了7个全基因组,偶然误差较大。但该方法随着未来基因组数据的快速增加和组学分析方法的不断进步,有望提供更多可靠的信息。

(4)不同物种间的水平基因转移(horizontal gene transfer, HGT)和基因丢失都可能抹去进化印记。HGT和基因丢失可能发生在真核生物进化的各个阶段(图3),机制包括转化、转导和接合等[42,43,44]。在Cox等[38]的研究中,检测到选取的80个基因有30个受到HGT影响,数据舍弃不用。Akanni等[45]利用超树方法分析了392个真细菌和51个古细菌基因组,在古细菌进化树基部发现了两个来自真细菌的大规模HGT,基因来源涉及δ-变形杆菌、梭菌和放线菌。对此,Cotton等[46]和Cohen等[47]认为,与转录、翻译相关的核心基因的负选择压大,受HGT的影响应比一般代谢通路的基因小,是更加合适的分析对象。

图3

图3   真核生物进化过程中的水平基因转移(HGT)与基因丢失

HGT可能发生在古细菌祖先→FECA→LECA→现存真核生物演化进程中的各个阶段。线粒体和叶绿体的内共生过程也为HGT的发生提供条件。HGT和基因丢失均能削弱现存生物基因组中遗留的系统发育信号。根据文献[17]修改绘制。

Fig. 3   HGT and gene loss during the evolution of eukaryotes

(5)长支吸引(long branch attraction, LBA),由于不同域间的基因差别可能很大,在同源性高的物种之外可能形成进化距离遥远但仍然相互靠近的长支,造成偏差[48,49]。早在1999年,Tourasse等[50]便认为三域树结果是受LBA影响产生的。

(6)建立的模型本身设计过于简单,模拟能力差[48]。

近10年来,随着模型的复杂化和基因数据的积累,人们尽量规避上述6点对结果的影响。2011~ 2013年发表的3篇文献结果都支持二域系统[48,51,52]。2014年,Rochette等[53]的系统发育分析显示,真核生物与古细菌间的联系比真细菌紧密得多,但与泉古菌门和广古菌门没有密切联系,真核生物分支接近古细菌并很可能从中发出。与此同时,泉古菌和广古菌以外古细菌门类的发现为二域系统提供了更多的支持,相关内容将在下一部分阐述。

1.3 新古细菌类群的发现对生命之树的影响

2004年,Venter等[54]首次采用不经实验室培养直接测定环境中微小生物基因组的“全基因组鸟枪测序”方法,即通常所说的宏基因组(metagenome)技术,研究海水中的微生物样本,发现了148个新细菌种类和120万个此前未知的基因。此后,人们不断利用宏基因组技术发现多个泉古菌门、广古菌门之外的古细菌新门,为生命之树带来巨大变化。

2008年后,奇古菌门(Thaumarchaeota)[55]、初古菌门(Korarchaeota)[56]、曙古菌门(Aigarchaeota)[57]相继被发现。其中奇古菌门是被发现的第一个新古细菌门类,而曙古菌门是第一个完全由宏基因组学数据重建的基因组,并且发现了与真核生物同源的泛素系统。依据16S rRNA测序结果,这3个新门与泉古菌门一起归为一个单系群(monophyletic group),称为“TACK”超门(TACK superphylum)或变形古菌(Proteoarchaeota)[58,59]。通过改进的最大似然估计或贝叶斯网络模型,人们发现真核生物从TACK超门内分支出来或是TACK超门的一个姐妹群(图4A)[17,60]。这表明真核生物分支是从古细菌域内发出的,支持上一部分所叙述的二域系统,否定三域系统。新发现的TACK超家族成员含有大量一般只在真核生物中表达或与其相关的真核生物标志蛋白(eukaryotic signature proteins, ESPs),如肌动蛋白、微管蛋白的古细菌同源物、转录翻译因子类似的蛋白等[11]。TACK超门成为追溯真核细胞起源的重要研究材料。

2014年以来,通过改进的宏基因组技术——解码宏基因组(genome-resolved metagenomics),人们又在TACK超门中发现新的古细菌门：深古菌门(Bathyarchaeota)、地古菌门(Geoarchaeota)和韦斯特古菌门(Verstraetearchaeota) (图4B)[17]。广古菌门外还存在着一个深枝DPANN超门(DPANN superphylum),包含丙盐古菌门(Diapherotrites)、小古菌门(Parvarchaeota)、谜古菌门(Aenigmarchaeota)、纳古菌门(Nanoarchaeota)和纳盐古菌门(Nanohaloarchaeota) (图4B)[17]。这些发现极大地丰富了生命之树中古细菌的分支。

近5年来的一个重要突破是发现了与真核生物遗传关系更近的Asgard古细菌。Asgard古细菌大多生活在海底,分类上原先属于海洋底栖类群B (Marine Benthic Group B, MBG-B)、古代古细菌群(Ancient Archaeal Group, AAG)、深海古细菌群(Deep-sea Archaeal Group, DSAG)和海洋热液喷口群(Marine Hydrothermal Vent Group)[61]。2015年,瑞典乌普萨拉大学Ettema课题组在北冰洋Loki’s Castle附近的海底沉积物中利用宏基因组技术重建出一种新的古细菌基因组,命名为洛基古菌门(Lokiarchaea),蛋白质组中的重要部分(175个蛋白质,占比3.3%)都与真核蛋白相似,为ESPs,参与膜的变形和细胞形状的形成过程[11]。此后,又发现了与Lokiarchaea门相近的3个新门：奥丁古菌门(Odinarchaeota)、索尔古菌门(Thorarchaeota)和海姆达尔古菌门(Heimdallarchaeota)[12,62]。这4个新门被一并命名为Asgard超门(Asgard superphylum)[11,12] (图4B),是真核生物的姐妹群。其中,海姆达尔古菌门与真核生物距离最近[63]。

图4

图4   发现新门类古细菌后的生命之树

A：新发现TACK超门古细菌。真核生物是TACK超门的一个姐妹群,或者直接从TACK超门中产生。B：新发现DPANN超门和Asgard超门古细菌。DPANN超门形成古细菌的一个深枝,Asgard超门与真核生物进化距离最近,真核生物是Asgard超门的一个姐妹群,或者直接从Asgard超门中产生。根据文献[17]修改绘制。

Fig. 4   Tree of life after the discovery of new archaeal phyla

不过,新的发现也引发了学术界的争议。一方面,Da Cunha等[64]指出,Ettema课题组的取样存在污染,最终结果也因为取到演化速度快的序列而造成LBA效应,并且去除数据集中的蛋白延伸因子EF2便足够破坏真核生物与Lokiarchaea的密切关系。他们认为Lokiarchaea和Asgard超门是广古菌门的姐妹群,而非真核生物的姐妹群,且真核生物为单系群,根源通往TACK超门中Thaumarchaeota的分支,最终结果是三域系统。Ettema课题组的Spang等对此进行了反驳,认为没有证据表明取样污染,去除EF2依然能够证明Asgard与真核生物属于一个单系群,而Da Cunha等使用了不合适的方法导致三域系统结果[65]。此后双方仍有争论,但未有结果[66,67]。最近,Williams等[49]针对Da Cunha等[64]的结果,使用相同软件的不同最大似然方法包分析相同数据,得到与原文不同的二域系统结果;他们进一步使用多个新模型分析35个基因的对齐结果,真核生物均与Asgard古细菌形成姐妹群;基于“超树”和基因合并对齐方法分析3000多个古细菌和真核生物基因的结果显示真核生物是从古细菌域内产生的,因此认为“生命之树”应当为二域系统。另一方面,Harish等[68,69,70]以蛋白质折叠作为分析对象,将前人证明三域系统的模型[71,72]扩展为非平稳模型(non- stationary model),推算出的生命之树树根将细胞生命分为无核生物(Akaryote,即古细菌与真细菌)和真核生物二域,形成了一个与此前二域、三域生命之树均不同的二域系统(图5)。分析结果还指出,Asgard古细菌与所有其他的古细菌是姐妹群,难以作为一个整体处理。这一结论说明细胞生命内最深层次的分裂位于原核与真核之间。相比常用的蛋白质氨基酸序列[49],Harish等[73]认为蛋白质结构域在生化角度上非冗余和更保守,更适合作为进化标记进行系统发育学分析。然而,这个新的二域生命之树是选取不同进化分子标记的结果,违背了此前众多研究所证明的真核生物与古细菌间的密切关系,因此争论依然存在。

对于Asgard古细菌与真核生物的密切关系也存在不同解读。Fournier和Poole[74]便试图以现代哺乳动物的祖先合弓纲(Synapsida)与现代爬行动物的进化关系作为平行案例,说明仅从真核生物与Asgard古细菌的谱系关系无法解决二域/三域争论,此外还应确定古细菌和真细菌之间的根源。

图5

图5   有争议的新二域生命之树

依据蛋白质折叠分析结果构建的生命之树将生物分为真核生物和无核生物两域。根据文献[73]修改绘制。

Fig. 5   The controversial new two-domain tree of life

虽有上述争论,但发现新的、进化上更接近于真核生物的Asgard种类依然是重要的研究方向。Seitz等[75]发现了新的Asgard古细菌海拉古菌门(Helarchaeota)。深圳大学李猛课题组利用开源数据库中的现有数据分析Asgard古细菌16S rRNA序列,发现了5个此前未知的Asgard亚组(subgroup),并且为Asgard古细菌的转录活性混合营养型生活方式提供了证据[76]。他们利用几个沿海沉积物样本重建出15个基因组,其中包括一个新的Asgard门类“Gerdarchaeota”[77]。最近,他们设计的新SSU rRNA引物完成了Asgard中一种不能与通用引物匹配的新类群的扩增工作[78]。Ettema课题组未发表的结果也显示发现了5个新Asgard类群,其中Idunnarchaeota是目前与真核生物最接近的类群[79]。

总之,随着模型的复杂化、基因序列和蛋白质序列数据的积累以及新门类古细菌的发现,学术界对于生命之树的争论已逐渐由三域系统向二域系统学说倾斜。主流观点认为真核生物产生自古细菌域内,Asgard超门是目前与其进化距离最接近的古细菌。在未来,生命之树的形态以及真核生物的定位仍可能不断改变,但Carl Woese的三域生命之树仍将长期存在于教科书与人们的脑海中。

2 真核生物的起源机制

2.1 真核生物起源机制的研究现状

关于真核生物的起源,首先需要明确的两个概念是FECA和LECA。FECA (first eukaryotic common ancestor)指所有真核生物的最早共同祖先;而LECA (last eukaryotic common ancestor)指所有现存真核生物距今最近的共同祖先[17]。FECA与LECA间的阶段常被称为进化树上的茎期(stem phase)[80]。大量原生生物和多细胞生物的基因组学和细胞生物学研究已证明,LECA拥有现代真核生物的大部分遗传和细胞结构特征,如细胞核、线粒体、细胞骨架、囊泡和运输系统、细胞周期等[6]。保守估计LECA基因组有至少4000~5000个基因[80,81]。

从理论上分析,原核生物向真核生物的转变大致涉及以下方面：由厌氧向兼性厌氧、好氧代谢方式的转变,共生与内共生,吞噬作用的产生,基因组嵌合体的变化,细胞核的出现,信号通路的复杂化,被膜细胞器的出现,细胞周期的出现,细胞体积的增大等等[1]。研究真核生物起源机制的关键在于以FECA和LECA为坐标,理清茎期中这些进化事件的先后关系和具体过程。

结合实验数据与理论分析,一些局部的问题已经得到充分阐释,例如GTPase、longins、COPs和ESCRT-III复合物等真核生物标志性蛋白的进化历程,内膜系统和核孔复合物等真核细胞结构的组建过程已在大量综述中有详尽描述[6,82,83]。

然而,从整体上解决真核生物的起源机制始终绕不开线粒体的起源问题(图6)[6,84]。作为细胞的能量工厂,线粒体为真核生物在“大氧化事件”后在有氧环境中的辐射进化提供了必要条件;真核生物内膜系统与细胞核的产生也与线粒体的内共生密切相关。

2.2 线粒体与真核生物起源

线粒体普遍存在于现代真核生物体内,且随不同物种展现出丰富的多样性[85]。许多真核生物(多营寄生生活)为适应厌氧环境,将线粒体简化为线粒体相关细胞器(mitochondrion-related organelles, MROs)[86,87]。极端的例子如Monocercomonoides sp. 的线粒体已完全丧失[88]。但学界普遍认为线粒体的简化丧失是发生在LECA之后比较新的进化行为,LECA拥有线粒体结构[30,81,89]。

图6

图6   线粒体内共生是引发真核生物起源的重要事件

现有的主流观点认为一种类似于现存Asgard超门的古细菌宿主内共生一种α-变形菌后形成胞内的线粒体,原核细胞逐渐演化为真核细胞。根据文献[6]修改绘制。

Fig. 6   The endosymbiosis of mitochondrion was an important event in eukaryogenesis

真核生物祖先最初通过内共生途径获得线粒体。1905年,俄国植物学家Konstantin Mereschkowsky便提出叶绿体由内共生形成的构想;20世纪20年代,Wallin将此推广至线粒体[90]。40多年后,美国生物学家Lynn Sagan (后来的Lynn Margulis)重拾内共生理论,在著名的On the Origin of Mitosing Cells一文中提出真核生物的细胞器包括线粒体和叶绿体在内都是由内共生细菌演化而来的[91],引发巨大争议。不过,随后对于线粒体、叶绿体的基因和蛋白的分析显示它们都拥有与真核谱系相距甚远的原核特征,分别对应α-变形菌和蓝细菌,为内共生学说提供了佐证[92,93,94]。后来在Symbiosis in Cell Evolution一书中,Margulis正式提出线粒体是原始真核生物吞噬革兰氏阴性好氧细菌后,通过长期内共生作用形成的[90],逐渐得到学术界的广泛认可。自此,线粒体的内共生起源成为真核生物起源研究的核心点。

2.2.1 线粒体内共生的早期与晚期之争

长期以来,学界在线粒体内共生发生的时间问题上存在争论。主要观点分为两派：一派认为宿主吞噬好氧的α-变形菌前,已经先通过不同途径形成细胞核,成为具有真核细胞特征(含细胞核、动态细胞骨架、内膜系统)的过渡体,具有原始吞噬功能等,被称为晚期线粒体模型(“Mito-late” models);另一派认为,宿主首先与好氧的α-变形菌内共生形成带有线粒体的原核细胞,随后促进原核细胞演化出细胞核、内膜系统等真核生物特征,被称为早期线粒体模型(“Mito-early” models)。

20世纪80年代,研究者在现存真核生物中发现了不含线粒体的物种,如贾第虫属(Giardia)、毛滴虫属(Trichomonas)等,大多是寄生虫。英国演化生物学家Cavalier-Smith将它们归类为源真核生物(archezoans)[95],祖先是细胞内部已具有复杂结构而尚未内共生线粒体的初级真核生物,属于真核生物树中的早期分支谱系[96]。传统的晚期线粒体假说认为,细胞内部的复杂结构以及吞噬营养能力是线粒体起源的前提,细胞核的出现是为了避免细胞骨架牵拉对DNA的损伤[97,98]。基于此的真核生物起源机制有很多,几个影响深远的模型如(图7,A~D)所示[32,97,99~101]。内共生学说提出者Margulis本人认为吞噬宿主是一种类似现代Thermoplasma spp. (属于广古菌门)的嗜酸无壁古细菌,细胞核在嵌合细胞形成后自发进化形成(图7A)[100,102];著名的互养共栖假说(图7B)认为真核生物来自产甲烷菌与δ-变形杆菌的共生作用[32];Cavalier-Smith本人则认为真核生物与古细菌演化自一个共同祖先,真核域与古菌域归属于新壁总域(Neomura) (图7D)[98]。

但是,针对Cavalier-Smith提出的源真核生物概念,21世纪以来的研究表明,此前发现的所有不含线粒体的真核生物均含有产氢体(hydrogenosome)或mitosome等细胞器,与线粒体同源,是上文所说的MROs[1,30,105]。早期支持源真核生物概念的研究也被认为受到分析偏差影响,导致源真核生物概念不再流行[30]。

此后,另一派早期线粒体假说获得了许多拥护者。几个经典的Mito-early模型如(图7,E~G)所示[31,103,104],相似之处在于都是一对古细菌和真细菌首先形成共生关系,真细菌是古细菌代谢产物的受体,随后内共生,形成细胞核等其他结构,其中包含著名的氢假说(图7E)。

早期线粒体假说最有力的论据在于现存生物中尚未发现不含线粒体或其同源物的真核细胞过渡形态,这似乎暗示线粒体的内共生应发生在一个较早的时期,很可能早于细胞核。Von Dohlen等[106]在非吞噬作用的原核细胞体内发现存在其他原核细胞的现象也表明,内共生或许不需要真核生物祖先拥有复杂的吞噬营养系统。

从线粒体与真核细胞其他结构的关系角度也支持早期线粒体假说。Martin等[4,107~110]提出了对线粒体、细胞核和真核细胞分裂形式出现顺序的推测。在线粒体始祖进入宿主胞质形成内共生体后,两者间的基因重组和启动子的相互关联导致内共生体(原始线粒体)基因在宿主细胞质内表达[107]。这种嵌合的原核基因组模糊了宿主与内共生体间的区别,彼此出现基因片段交换,如从线粒体基因组向宿主基因组转移II型内含子等。然而,原核生物的共转录翻译机制无法解决内含子剪接速度比蛋白翻译速度慢从而产生缺陷肽链的矛盾,细胞核的出现则为转录和翻译提供了物理屏障[4]。随后染色体被局限在细胞核内,失去与细胞膜的接触,在细胞分裂时无法自动分离,使细胞体积较原核生物显著增加[108]。同时,胞质内由于富含线粒体产生的ATP,蛋白表达水平显著升高。为解决染色体分离问题,可能出现了依赖于微管的染色体分离方式,最终形成减数分裂、真核细胞周期和有丝分裂过程[109,110]。此外,线粒体早期内共生释放外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs)的过程也有利于解释真核生物内膜系统的快速形成[111],详细机制可参阅McBride[112]的综述。

图7

图7   有关线粒体起源的模型

A~D为晚期线粒体模型,E~G为早期线粒体模型。A：Margulis认为古细菌宿主热原体菌(Thermoplasma)首先与螺旋菌(Spirochaete)内共生,逐渐演化出细胞核,后形成线粒体[100]。B：互养共栖假说,产甲烷古细菌与δ-变形菌在代谢上存在氢的交换。一个产甲烷菌被多个δ-变形菌包围后,δ-变形菌间的相互作用促进胞质融合,形成内质网、细胞核等结构,δ-变形菌基因组随着基因的转移逐渐消失,线粒体的内共生最后发生[32]。C：内生核假说,泉古菌与G-真细菌互相作用,泉古菌形成细胞核,真细菌形成细胞质,再与α-变形菌内共生形成线粒体[101]。D：Cavalier-Smith认为真核生物与古细菌演化自一个共同祖先,同属新壁总域[97,99]。E：氢假说,宿主是严格依赖氢且严格自养的厌氧古细菌,共生体能进行有氧呼吸,但通过厌氧异养代谢为宿主提供氢气[31]。F：古细菌宿主在形成真核细胞的其他复杂结构前首先与耗氧的α-变形菌内共生形成线粒体[103]。G：基于硫元素的代谢循环,宿主是产H2S的古细菌,线粒体祖先是耗H2S的α-变形菌[104]。根据文献[30]修改绘制。

Fig. 7   Models of the origin of mitochondrion

近10年来,有关Mito-late和Mito-early模型的问题仍有争论。延续Mito-early假说风潮,主流观念认为线粒体祖先先于宿主吞噬作用出现,直接侵入古细菌细胞内发生内共生,导致真核细胞的产生[53,113]。然而,发现Asgard古细菌Lokiarchaeota后,基因组重建出大量细胞骨架相关的ESPs,开启了具有吞噬作用的原核生物谱系从古细菌域内部进化的可能性,支持Mito-late模型[11,114]。但后续基于宏基因组重建的研究显示,Asgard古细菌不具备吞噬营养功能,吞噬作用的形成涉及来自古细菌、真细菌以及真核生物新基因的组合[115],宿主是否具有吞噬功能依然未知。不过,限于主流观念大多是依据对当今真核生物组织和功能方面的观察所作的进化推断,始终缺乏确切的实验分析证据,Hampl等[116]便认为没有充分的理由肯定线粒体产生于细胞吞噬作用之前。

总的来说,目前Mito-early假说更为流行,但也面临着其他一些无法解释的现象：真核生物的嵌合性基因组中,大多数来自细菌的基因无法回溯到线粒体的祖先α-变形菌。2016年,Pittis和Gabaldón[2,117]首次通过比较真核生物与距离最近的原核生物蛋白间的亲缘距离,发现α-变形菌与真细菌来源蛋白之间的进化距离短于真细菌与古细菌来源蛋白之间的进化距离,推测线粒体内共生前,真核细胞祖先可能已与其他真细菌内共生形成嵌合基因组,胞内有内质网和高尔基体,但还不是进化成熟的真核细胞。Ettema[118]将其称为介于Mito-early和Mito-late间的中期线粒体(Mito-intermediate)假说。但此结果引发许多质疑。William和Nelson-Sathi[119]认为作者采用了错误的统计和分析方法;Esposti也认为Pittis和Gabaldón的方法早已被证明失准[53],低估了α-变形菌祖先对真核生物谱系的影响[120]。此外,目前认为与真核生物祖先关系最密切的Asgard古细菌本身也存在大量其他真细菌基因[17]。又鉴于位于现存α-变形菌纲深枝的磁球菌(Magnetococcus)具有一个α-变形菌成分仅占1/3的嵌合基因组,Esposti[120]推测久远的线粒体祖先本身很可能就是一个嵌合基因组,而非仅有α-变形菌的血统[121],所以Pittis与Gabaldón的最终结论显得有些草率。

至今,线粒体内共生的早期与晚期之争依旧无法定论,不过可以确定的是,线粒体的内共生发生在TACK和Asgard古细菌基因组中所编码的ESPs基因出现之后。若真如Esposti所说,线粒体祖先是一个嵌合基因组的话,这段长达30余年的争论便可以画上句号。

2.2.2 线粒体祖先的确定

探索线粒体始祖细菌的性质有助于人们了解具体的内共生过程。长久以来,线粒体祖先与α-变形菌纲相关的结论为学术界广泛接受[93],但与其中哪一谱系更加接近的问题始终没有解决,给重建线粒体与现存α-变形菌谱系的最近祖先(last common ancestor)带来困难。

大量通过单基因或全基因组基因串联建树的结果常常将线粒体与立克次氏体目(Rickettsiales)相关联[122,123]。而当引入Pelagibacterales目(SAR11)基因组数据作系统发育分析时,则发现Pelagibacterales目是线粒体-立克次氏体目一枝的姐妹群[124],或直接是线粒体的姐妹群[125]。后来的分析表明,这些结果是受到线粒体和Pelagibacterales目之间趋同相似性影响带来的偏差[126,127]。随后,依赖于核基因编辑和线粒体基因编辑的线粒体蛋白数据库的分析结果支持线粒体发源自立克次氏体目内[128,129]。

但是,上述将线粒体与立克次氏体目关联的研究也存在缺陷。第一,线粒体、立克次氏体目以及上文提到的Pelagibacterales目(SAR11)与其他α-变形菌纲的物种相比进化更加迅速且已经失去了许多基因,在基因组层面A+T占比颇高,很容易招致LBA偏差[89]。对此,一些研究的应对措施是选用较早由线粒体基因组转移到核基因组的基因进行分析[128],但不可忽视的一点是前文所提到的核基因组中存在的碱基替换、基因丢失和HGT问题。第二,推测的立克次氏体目在地球上的存在时间不够长,目内处于主干地位的Wolbachia属仅有大约5亿年历史[120]。第三,立克次氏体目的代谢方式也与线粒体差别很大,普遍不存在现代真核生物的厌氧性状,不编码调节线粒体嵴的MICOS蛋白和功能等同于线粒体ATP合酶抑制亚基的相关结构[120]。

另一种通过单基因数据集和多基因串联数据集推断网络的方法将线粒体与其他α-变形菌纲分支相连,如红螺菌目(Rhodospirillales)的红螺菌属(Rhodospirillum)和根瘤菌目(Rhizobiales)的苍白杆菌属(Ochrobactrum)[89]。从代谢相似性来看,有分析认为线粒体可能更加接近于红螺菌属[120]。还有研究认为线粒体来自α-变形菌纲内的一个独立深枝[127]。

2018年,Martijn等[130]通过宏基因组重建得到12个α-变形菌纲谱系(包含几个新发现的谱系),将线粒体放在了这些谱系的进化分支之外,是所有测序的α-变形菌纲序列的姐妹群,与此前的众多结果存在矛盾。然而,2019年Fan等[131]的结果则又显著支持线粒体来源于α-变形菌纲内的传统观点,并指出Martijn等在规避异源基因的处理时可能存在模型过度拟合的缺陷。

形成这一僵局的原因来自多方面。首先,许多现存的α-变形菌纲生物受到与其他细菌之间的双向水平基因转移(HGT)影响[132],线粒体始祖本身甚至可能就有一个嵌合体基因组[120];其次,线粒体基因在进化上比一般自由生活的细菌更加迅速[128],且线粒体基因组向核基因的转移与时间呈现非线性关系[133],为模型的建立带来困难;最后,α-变形菌纲作为一个成员变异性极大的纲,现存成员间的进化关系仍在调整,例如Muñoz-Gómez等[134]的研究已将Holosporales目从“广义的立克次氏体目”(Rickettsiales sensu lato)中分离出来。环境微生物基因组的测定也在不断发现新的α-变形菌纲物种。

综上,线粒体始祖的判定仍是探索真核生物起源道路上亟需解决的问题。

2.2.3 古细菌宿主的确定

长期以来的系统发育基因组学研究已经基本确定线粒体内共生的宿主与古细菌相关[84]。宏基因组技术出现之前,古细菌分为广古菌门和泉古菌门两门。宿主身份有颇多说法。泉古菌假说支持宿主属于泉古菌门[28,29];氢假说(图7E)[31]与互养共栖假说(图7B)[32]支持宿主属于广古菌门中的产甲烷菌(methanogens);Searcy等[135]与Margulis等[100]支持宿主属于广古菌门中的热原体菌(Thermoplasma) (图7A)。这些模型虽彼此对立,但共同点是线粒体内共生仅涉及一个古细菌宿主和一个真细菌内共生体。然而,与此不同的其他一些模型则认为宿主是两种原核生物的嵌合体,这些观点被统一称作三元假说(ternary hypothesis)。其中较为流行的是内生核假说(endokaryotic hypothesis) (图7C),推测宿主的细胞核起源于一种古细菌,而细胞质起源于一种真细菌,以此解释真核生物基因组中无法追溯到α-变形菌纲的细菌来源基因[101,136]。然而,后期的系统发育检验并没有发现这样一个细菌谱系,这表明内生核假说缺乏证据支持[53]。面对众多模型长期不可调和的僵局,2012年,Godd[137]提出了另一种三元假说。在融合纳古菌属(Nanoarchaeum) (当时未独立为门,属于广古菌门)和燃球菌属(Ignicoccus) (属于泉古菌门)两种古细菌的基因组后,Godd发现可以解释当时的大部分数据,提出宿主可能是两种古细菌的嵌合体(chimera)。这一设想具有很强的创新性,但仍然需要大量的系统发育分析和细胞学研究检验才能令人信服。

在结合宏基因组和单细胞基因组分析技术发现TACK超门和Asgard超门以后,内共生宿主的身份逐渐明朗,也基本消除了第三个原始真核生物谱系存在的可能性[11,17]。Asgard古细菌中大量ESPs的出现同时否定了其他一些有关病毒影响真核生物起源的理论。这些理论认为真核生物的大量基因,甚至细胞核本身都来自核质大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses, NCLDVs)[138,139],其基于的证据主要是在NCLDVs中发现了许多与真核生物相关的基因。而如今Asgard古细菌中大量ESPs的发现以及随后纠正的系统发育分析则表明,NCLDVs中的真核样基因实际来自于真核生物病毒的HGT。病毒的高进化速率为此前的系统发育重建带来偏差,导致了NCLDVs是真核生物基因甚至是细胞核源头的判断。事实上,NCLDVs可能是Asgard古细菌或相关谱系的古老成员[90]。

如今,对Asgard古细菌的分析研究已经成为了解真核生物祖先的重要手段。Asgard超门呈现出丰富的代谢方式。宏基因组重建分析推测Asgard超门普遍存在氮和硫代谢循环[61],不能进行吞噬作用[115],Lokiarchaeota存在依赖氢的代谢途径[140],Thorarchaeota存在依赖无机碳和有机碳的混合代谢以及产乙酸途径[62,141],Lokiarchaeota和Thorarchaeota存在卤代有机物代谢途径[142],Heimdallarchaeota存在光能营养途径[143,144],Helarchaeota存在厌氧碳氢化合物代谢途径[75],部分Lokiarchaeota编码镍铁氢化酶[142]。基于这些代谢研究提出的真核生物起源新模型也不断涌现,如电子或氢从有机异养古细菌宿主流向细菌共生体的“逆流模型”(reverse flow model) (图8A)[145]。此外,对水底生物垫内Asgard古细菌与周围其他细菌的基因组综合研究也有助于阐释线粒体祖先与宿主内共生前的共生关系,例如Saghaï等[146]便利用16S/18S rRNA宏条形码和多元统计分析技术,在盐沼池水中发现了Lokiarchaeota与此前知之甚少的细菌门类TA06间的强正相关关系,可能存在共生作用。

图8

图8   真核生物起源的逆流模型与E3模型的对比

A：逆流模型;B：E3模型。两个模型的共同点是异养古细菌宿主与α-变形菌内共生形成线粒体;不同点在于E3模型比逆流模型多引入了一个共生菌——硫酸盐还原细菌。

Fig. 8   Comparison between reverse flow model and E3 model

由于大量Asgard古细菌的研究结论都只是基于宏基因组分析的结果,细胞生物学层面的研究验证便显得尤为重要。然而,Asgard古细菌的生长环境大多处于海底沉积物中,且可能依赖其他共生细菌生存,这为Asgard古细菌的分离培养和蛋白的提纯带来巨大困难,相关工作开展缓慢。Akıl和Robinson[147]取得了标志性成果。他们利用质粒载体表达Asgard古细菌的前纤维蛋白编码基因,发现表达产物能够成功与哺乳动物的肌动蛋白结合,即使相距2、30亿年的进化距离依旧与哺乳动物的相关蛋白呈现结构和功能的相似性,这为Asgard超门与真核生物的相似性提供了一个细胞学证据。

近年来,对Asgard古细菌的研究终于迎来里程碑式的成果。日本科学家Imachi等[13]花费12年时间利用连续流动生物反应器,成功从深海沉积物中分离,并首次在实验室环境下提纯培养出一个Asgard古细菌菌株MK-D1,属于Lokiarchaeota。该研究的原始目的是寻找甲烷降解菌[148]。分离到的Lokiarchaeota门古细菌生长缓慢,滞后期长达3~6个月,二倍扩增需14~25天。进一步观察显示,这是一种小型厌氧球菌,细胞可以形成凸起结构、气泡和胞外小泡,没有明显的真核样细胞器,具备厌氧代谢氨基酸的能力,依赖共生菌一起生存。Imachi等据此提出了新的真核生物起源模型——纠缠-吞噬-内生(entangle-engulf-endogenize, E3)模型：厌氧古细菌宿主与一种硫酸盐还原细菌共生,共生细菌是宿主氨基酸代谢产生的脂肪酸和氢气的受体,随后宿主与另一好氧细菌内共生形成线粒体,共涉及3种原核生物。这与此前仅涉及两个原核生物的“逆流模型”[145]存在不同(图8)。逆流模型认为古细菌代谢产生的氢气直接被线粒体祖先消耗,无需引入假设的另一个共生伴侣(图8A),而E3模型中的线粒体起源是处于共生关系下的厌氧宿主古细菌对环境中氧气浓度增加的适应行为(图8B)。

在未来,有关古细菌宿主的研究无疑将借鉴Imachi等的经验,从环境中发现并在实验室条件下培养研究与真核生物进化距离更近的微生物。

3 结语与展望

近几十年来对真核生物起源的研究积累了大量数据、模型和观点,这是一个涉及进化生物学、微生物学、生物化学、分子生物学、细胞生物学和古生物学等多领域的宏大问题。新技术的发明(如16S/18S rRNA测序、基因组测序、宏基因组测序和单细胞全基因组测序)、新物种的发现(如古细菌域、TACK超门和Asgard超门)以及分析方法的改进不断推动我们对于真核生物起源的认知。

然而争论依然存在,主流观点将生命之树上的真核生物分支放在古细菌域内,从Asgard超门内发出或是Asgard超门的姐妹群,对应二域系统生命之树;真核生物的始祖是一个类似Asgard超门的古细菌,在与一种α-变形菌纲细菌内共生形成线粒体后促进其他细胞内部结构的进化。

未来的研究重点,一方面在于改进系统发育分析方法,并延续环境微生物的宏基因组重建分析工作。在确定古细菌宿主的角度上,发现新的Asgard古细菌,甚至是其他与真核生物更接近的古细菌新门类。在确定线粒体祖先的角度上,亟需理清α-变形菌纲的谱系关系。目前可获取到基因组数据的α-变形菌纲物种大多与医学与农业相关,或者是部分可在实验室条件下分离培养的菌种[120,130],可能存在一定的取样偏差,不一定能完全代表现存α-变形菌的多样性。因此,在海水、地下水和土壤等环境中发现未培养微生物,扩展α-变形菌纲物种数的工作可能仍是重中之重。此外,发展基因树-物种树(gene tree-species tree)综合分析[149]等更加复杂的计算方法也有望为线粒体的祖先提供更加精确的定位。另一方面,实验室中的细胞生物学研究亟需跟进。在确定古细菌宿主的角度上,借鉴Imachi等[13]的工作,实验室条件下直接培养Asgard古细菌进行基因组测序可以避免宏基因组重建时的误差,直接观察细胞形态和代谢过程。但这面临两个问题,一是需要改进生物反应器系统,缩短Asgard古细菌的分离提纯时间;二是需要研究自然条件下Asgard古细菌的生活环境和共生细菌等,摸索其在实验室中的最适培养条件,加快繁殖速度以供实验需求。在确定线粒体祖先的角度上,Hu[150]通过冷冻电镜发现HeLa细胞线粒体存在与许多现存α-变形菌纲生物相似的出芽增殖方式,不同于传统主流观点所描述的二分裂增殖方式,而这一现象难以在常用的荧光显微镜下观察到。此结果说明或许可以将新一代显微成像技术应用于线粒体祖先的研究中,从形态学层面比较线粒体与立克次氏体等现存α-变形菌的异同,为系统发育学分析提供必要补充。此外,实验室内对真核细胞进化某些步骤的直接模拟实验也有利于我们还原真核生物始祖的内共生效应和细胞器的进化历程。相关研究工作已在开展之中,例如2018年Mehta等[151]报道的在酵母胞质内培养大肠杆菌多达120天的工作。

最后,值得提出的一点是,现在采用的Asgard古细菌等研究对象并不古老,也同真核生物一样走过了十几亿年的辐射进化历程。现存代谢方式丰富多样的Asgard古细菌不可能完全代表原始的真核生物。未来的目标将是通过分析大量现存与即将涌现的数据,提出一个适用于所有真核生物特征的真核生物起源模型。

致谢

本文在撰稿及写作过程中得到南京大学生命科学学院杨四海教授的悉心指导,特此表示由衷的感谢。