关于新生儿肠道里有没有细菌的问题，我们终于有确切的答案了。

近日，由德国柏林夏里特医学院Thorsten Braun和加拿大麦克马斯特大学Deborah M. Sloboda领衔的研究团队，在《自然·微生物学》杂志上发表一篇重要研究成果 [1]。

他们在剖宫产婴儿屁股露出来的时候，立即用直肠拭子采集胎粪，实现了产前胎粪的收集，最大程度地避免了母体微生物的污染。

他们的研究结果表明，健康的婴儿在出生前肠道里不会定植微生物，新生儿胎粪的微生物谱反映的是出生时和出生后获得的菌群。

对于这一发现，Sloboda认为 [2] “婴儿的肠道定植发生在他们出生期间和之后，这意味着它不仅容易受到早期环境的影响，而且还可能提供一个潜在的干预窗口。”

胎粪采集方法示意图

新生儿肠道菌群的建立和构成，对肠道免疫系统的成熟和发育，以及肠道的代谢功能有着直接的影响。除此之外，新生儿肠菌还与某些后天疾病或慢性病，例如肥胖症、哮喘相关[3, 4]。还有一些菌株能够对抗成长过程中的其他肠道病原菌的感染，维持肠道菌群稳定 [5]。

这样看来，早早地收获优质的肠道菌群似乎能让你的健康赢在起跑线上。然而，科学家们关于这个起跑线到底在哪仍然存在争议。

婴儿出生前肠道中是否已经包含母亲来源的菌群？它的构成又是什么样的？搞清楚这些问题才能够更好的研究婴儿肠道菌群对后期健康状况的作用机制。

虽然科学家们已经在胎盘、羊水中检测到了细菌DNA [6, 7]，但这仍不能证明这些细菌在怀孕期间能够进入婴儿体内，而且由于测得的细菌量极低，也不能排除污染的可能。

另外有一些研究通过收集新生儿初次粪便（neonatal meconium）并分析其菌群结构，来反映婴儿出生前自母体获得的肠道菌群 [8, 9]。但这些菌群的来源并不明确，可能是母亲的生殖道、粪便、皮肤，甚至是空气、手术器械、床单的污染。

而且还有研究表明，新生儿初次排便的菌量和婴儿出生后的排便时间呈正相关 [10]，这暗示新生儿初次粪便的菌群结构容易受到后天摄入的微生物的影响。

因此，污染问题和尚不合理的样品收集方式使得新生儿出生前的菌群构成仍然是个谜。

论文截图

为了更准确的回答这一问题，Katherine M. Kennedy等人设计了一种收集产前胎粪（fetal meconium）的研究方法，这种方法用直肠拭子采集剖宫产且臀位出生婴儿的粪便。

由于婴儿没有通过生殖道，而且头部尚在母体内，生产过程中生殖道、母亲粪便中的细菌就不会通过婴儿口腔进入肠道，这样采集到的样品反映的是产前婴儿的肠道菌群。研究人员为了研究新生儿肠菌真是煞费苦心，也要感谢这些孕妈和可爱的宝宝对科学研究做出的贡献。

作为对照，研究人员还募集了一组孕妈收集新生儿初次粪便样品，以便对这两类样品的菌群结构加以对比。

除此之外，为了尽量减少生产过程中的污染，医务人员对生产时使用到的器具、床单进行了更为严格的消毒。产科医生还同时采集了母亲剖腹产前后创口处皮肤的菌群、血液、体液、空气样本等，还采集了这些婴儿成长过成中的粪便样本（infant stool）。

科学家们最终用于研究的有20例剖宫产胎粪样品，以及14例新生儿初次粪便样品（9例自然分娩，8例剖宫产）。所有母亲分娩时的平均年龄、新生儿平均体重大致相同，两个实验组产妇们的怀孕时长也相差不大。

孕妈和新生儿的各项基本信息

研究人员将部分样品分别在有氧或厌氧条件下培养。剩余的样品进行16S rRNA 测序，以确定菌群的成分和相对含量。

在经过120小时的培养后，7例胎粪样品不论是在有氧还是厌氧条件下都没有观测到任何活菌的生长。另外的13例胎粪样品在培养过程中长出了1-2株活菌，其中出现最多的是表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），另外还包含路邓葡萄球菌（Staphylococcus lugdunensis）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、贪婪丙酸杆菌（Propionibacterium avidum）、痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）。不过，母亲皮肤样品中培养出的也有这些菌株，由于没有找到粪便中常见的特征菌株，因此它们更有可能来自取样时皮肤处的沾染。

16S rRNA 测序的结果显示，胎粪样品中的基因序列片段数极低，而且人体自身的基因片段占一大部分。去掉真核细胞DNA序列片段后，真正属于细菌的基因片段数平均只有76.5，和空白对照（仅含有测序试剂的样品）的基因片段构成类似。

此外，研究人员分析胎粪样品的序列片段发现，这些片段代表的细菌多样性也极低，也和空白对照无差别，这也表明，胎粪中的细菌极有可能是试剂的污染导致的。而同时检测的新生儿初次粪便的细菌基因序列片段数和菌群多样性则很高，和幼儿成长时期粪便中菌群的多样性和构成比较一致。

空白对照、胎粪、新生儿初次粪便以及幼儿粪便菌群结构和多样性的相似性分析

那么16S rRNA 测序究竟从胎粪样品中检测到了哪些菌株呢？研究人员分析数据发现，20例样品全部含有盐单胞菌属（Halomonas）的序列，19例包含罗丹杆菌属（Rhodanobacter）序列，15例含有假单胞菌属（Pseudomonas）菌株，3例含有大肠杆菌/志贺氏菌（Escherichia/Shigella）。值得注意的是，上述菌株在空白对照样品中也检测到了。

研究人员仅在少数的样品（20例中有4例）中检测到了空白对照样品中不存在的拟杆菌属（Bacteroides）和葡萄球菌属（Staphylococcus），但是检测结果的准确度不高，例如同一个样品两次测序并不是都能检测到某一菌株，或者需要很高的PCR扩增循环数才能检测得到。

有氧或厌氧培养和16S rRNA测序结果共同表明，大部分胎粪中出现的菌株是母亲皮肤处的细菌或测序过程中的试剂污染，只有拟杆菌属（Bacteroides）是唯一可能存在于少数胎粪样品中的菌株，但细菌量非常低。

这些结果表明，婴儿在母亲子宫内至出生前，其肠道中几乎是一个无菌的环境，母亲在怀孕过程中也无法将菌群传递给胎儿，而分娩的过程才是新生儿菌群建立起始的关键时期，并且随着孩子的成长菌群差异也越来越大。

当然研究也存在一些缺陷，比如缺少羊水、胎盘等样品作为对照。还有就是胎粪中即使有菌群，由于其生物量低于检测所能达到的最低限度，也很难区分到底是污染还是出生前就已经携带的细菌（例如拟杆菌属），所以只能以空白对照样品作为参考，但这并不能完全排除胎粪中不存在这一细菌的可能。

值得肯定的是，胎粪的采集将新生儿肠道菌群的检测的时间点又向更早期推进了一步，更能说明产前婴儿肠道中的状态。众多阴性对照、空白对照的设置，也证明在检测生物量非常低的样品时，各种途径来源的污染对实验的结果甚至结论有着决定性的影响，对类似的研究颇有指导意义。

如此看来，想要在孕期给宝宝传递肠道菌群似乎是不可能的。面对近乎无菌的新生儿肠道，如何把握住婴儿出生时以及之后短暂的窗口时期，让益生菌抢先占领高地，大概是科学家们下一个亟待解决的问题。

参考文献：

1. Kennedy KM, Gerlach MJ, Adam T, et al. Fetal meconium does not have a detectable microbiota before birth [published online ahead of print, 2021 May 10]. Nat Microbiol. 2021;10.1038/s41564-021-00904-0. doi:10.1038/s41564-021-00904-0

2. https://www.eurekalert.org/pub_releases/2021-05/mu-bdn051021.php

3. Fujimura KE, Sitarik AR, Havstad S, et al. Neonatal gut microbiota associates with childhood multisensitized atopy and T cell differentiation. Nat Med. 2016;22(10):1187-1191. doi:10.1038/nm.4176

4. Soderborg TK, Clark SE, Mulligan CE, et al. The gut microbiota in infants of obese mothers increases inflammation and susceptibility to NAFLD [published correction appears in Nat Commun. 2019 Jul 1;10(1):2965]. Nat Commun. 2018;9(1):4462. Published 2018 Oct 26. doi:10.1038/s41467-018-06929-0

5. Gohir W, Ratcliffe EM, Sloboda DM. Of the bugs that shape us: maternal obesity, the gut microbiome, and long-term disease risk. Pediatr Res. 2015;77(1-2):196-204. doi:10.1038/pr.2014.169

6. Aagaard K, Ma J, Antony KM, Ganu R, Petrosino J, Versalovic J. The placenta harbors a unique microbiome. Sci Transl Med. 2014;6(237):237ra65. doi:10.1126/scitranslmed.3008599

7. Stinson L, Hallingström M, Barman M, et al. Comparison of Bacterial DNA Profiles in Mid-Trimester Amniotic Fluid Samples From Preterm and Term Deliveries. Front Microbiol. 2020;11:415. Published 2020 Mar 24. doi:10.3389/fmicb.2020.00415

8. Wang J, Zheng J, Shi W, et al. Dysbiosis of maternal and neonatal microbiota associated with gestational diabetes mellitus. Gut. 2018;67(9):1614-1625. doi:10.1136/gutjnl-2018-315988

9. Su M, Nie Y, Shao R, et al. Diversified gut microbiota in newborns of mothers with gestational diabetes mellitus. PLoS One. 2018;13(10):e0205695. Published 2018 Oct 17. doi:10.1371/journal.pone.0205695

10. Hall, I. C. & O’Toole, E. Bacterial flora of first specimens of meconium passed by fifty new-born infants. Am. J. Dis. Child. 1934;47(6):1279-1285. doi:10.1001/archpedi.1934.01960130103007