溶酶体作为细胞内关键的代谢与消化细胞器，其结构完整性和酶活性直接影响细胞的生理功能。溶酶体相关的荧光染料、溶酶体酶抑制剂、离子通道和pH 调节剂作为常用的工具分子，为解析溶酶体生物学功能、揭示与其相关的疾病机制提供了重要技术支撑。

图 1. Lysosome cell biology[1]

一、溶酶体相关的荧光染料

LysoTracker Red（溶酶体红色荧光探针）是经典的溶酶体相关染料，其核心结构由罗丹明荧光基团与脂肪族弱碱性侧链两个部分组成。脂肪族侧链使得LysoTracker Red（CAS No.：231946-72-8）具有膜通透性，能够自由穿过细胞膜进入细胞内部。而一旦进入酸性区室（如溶酶体，其腔内 pH 通常在4.5-5.0之间），该染料会被质子化（形成带正电荷的季铵盐结构），失去膜通透性，被“捕获”在酸性囊泡内并逐渐富集，产生红色荧光信号。LysoTracker Red（LysoTracker Red DND-99，AbMole，M21524）已成为评估溶酶体数量、分布、酸化状态以及功能完整性的重要工具。LysoTracker Red的最大激发和发射波长分别为577/590 nm。通过共聚焦或荧光显微镜，可直观显示溶酶体在细胞内的分布和形态变化。此外，LysoTracker Red支持与其它波长的染料共同染色细胞，例如，在 ADSCs（脂肪来源的干细胞）研究中，MitoTracker Red（线粒体红色荧光探针，AbMole，M19979）和Lyso-Tracker Red可同时染色以观察线粒体与溶酶体的形态。

Green DND-26（溶酶体绿色荧光探针，AbMole，M45073）具有与LysoTracker Red相似的作用机理，其荧光基团为荧光素衍生物。可在 490 nm 激发光下发射 511 nm 的绿色荧光。Green DND-26（CAS No.：220524-71-0）和LysoTracker Red形成互补，为溶酶体研究提供了灵活的工具选择。

二、溶酶体pH和离子通道调节剂

溶酶体功能的正常发挥依赖自身的酸性环境（pH 4.5-5.5），例如溶酶体内的许多蛋白酶仅在酸性条件下才会被激活。一旦溶酶体pH稳态失衡或离子通道功能紊乱，会导致细胞代谢失调、自噬异常，进而可能会诱发神经退行性疾病甚至溶酶体贮积症。

图 2. v-ATP酶通过依赖ATP的质子跨溶酶体膜运输促进溶酶体的酸化[2]

Bafilomycin A1（巴弗洛霉素A1，BafA1）是作用于V-ATPase的高选择性、强效抑制剂。V-ATPase是一种高度保守的多亚基膜结合质子泵，广泛分布于真核细胞的溶酶体、内体、高尔基体、网格蛋白包被囊泡等细胞器的膜表面[3]。Bafilomycin A1是从链霉菌中分离得到的天然大环内酯类化合物，Bafilomycin A1能结合V-ATPase的C亚基，阻断质子转运循环，导致溶酶体腔内pH显著升高（去酸化），破坏酸性水解酶活性环境，阻碍底物降解[3]。Bafilomycin A1（CAS No.：88899-55-2）还能引发溶酶体膜通透性增加，促使组织蛋白酶等溶酶体蛋白酶泄漏至胞质。Bafilomycin A1（BafA1）还能抑制自噬体－溶酶体融合，导致LC3-II及p62等自噬底物的累积，阻断自噬通量，因此在自噬研究中也备受关注。

Concanamycin A (Folimycin，AbMole，M7737)是一种由链霉菌产生的18元大环内酯类聚酮化合物，也是V-ATPase的抑制剂，Concanamycin A（刀豆素A）主要通过结合V-ATPase复合物的ATP6V0A2亚基，靶向质子转运结构域中的特异性口袋，阻断其质子泵功能，从而抑制跨膜质子转运。Concanamycin A（CAS No.：80890-47-7）可在纳摩尔浓度下抑制细胞内的V-ATPase，并阻断细胞自噬。在HEK293细胞中，Concanamycin A（0.1 μM）通过阻断自噬体-溶酶体融合，增加自噬相关的囊泡积累。在前列腺癌细胞（LNCaP、22Rv1）中，Concanamycin A（刀豆素A，10 nM）联合其他抑制剂（如Enzalutamide ）可协同降低雄激素受体（AR）信号通路的活性[4]。

甘氨鹅脱氧胆酸（Glycochenodeoxycholic acid, GCDCA，AbMole，M9408）是鹅脱氧胆酸（CDCA）与甘氨酸结合形成的共轭胆汁酸，GCDCA也能抑制溶酶体功能，表现为溶酶体内pH升高、蛋白水解能力下降。

ML-SA1（AbMole，M6983）是溶酶体膜上瞬时受体电位黏蛋白亚家族1型（TRPML1，也称MCOLN1）通道的选择性激动剂，TRPML是位于溶酶体上的非选择性阳离子通道，主要介导Ca²⁺和Zn²⁺释放，对维持溶酶体离子稳态、pH及膜功能至关重要。ML-SA1能特异性结合于TRPML1通道由跨膜区S5、S6及PH1结构域构成的疏水腔[5]，显著增强通道对钙离子的通透性，引发溶酶体钙离子外流，触发胞质钙信号级联通路[6]。此外，ML-SA1（CAS No.：332382-54-4）还可以促进溶酶体的酸化和溶酶体酶的活性。

Lys05（AbMole，M8783）是氯喹（Chloroquine，AbMole，M2510）的衍生物，其五氨基结构使自身的碱性要高于氯喹或羟基氯喹（Hydroxychloroquine），能高度富集于酸性溶酶体中，并诱导溶酶体的去酸化。同时Lys05会导致溶酶体标志酶酸性磷酸酶活性下降，并抑制组织蛋白酶 D 的成熟活化，彻底破坏溶酶体的降解功能。Lys05也是一种有效的自噬阻断剂，能中断细胞的晚期自噬过程。

EN6（ABM-4739，AbMole，M10277）是一种能共价修饰溶酶体V-ATPase进而激活自噬的小分子化合物，主要作用于V-ATPase的ATP6V1A亚基第277位半胱氨酸残基（Cys277）。正常情况下，溶酶体表面的v-ATPase与Ragulator-Rag GTPase复合物物理相互作用，后者负责将mTORC1招募至溶酶体进行激活。EN6（CAS No.：1808714-73-9）介导的ATP6V1A Cys277修饰能阻断Ragulator依赖的mTORC1向溶酶体的招募，并且增加溶酶体的酸化程度，提升组织蛋白酶（cathepsin）等水解酶的活性[7]。

1-Dodecylimidazole（1-十二烷基咪唑，AbMole，M58420）是一种溶酶体靶向性的去垢剂，它在中性pH下呈脂溶性可穿透生物膜，而在溶酶体酸性环境中可发生质子化并获得表面活性。1-Dodecylimidazole（N-Dodecylimidazole，CAS No.：4303-67-7）的积累能诱导溶酶体膜结构紊乱，最终引发溶酶体膜通透性增加、内容物泄漏以及溶酶体的氢离子进入胞质，并最终触发细胞的凋亡或坏死[8]。

Diphyllin（二叶草素，AbMole，M10325）是一种V-ATPase抑制剂，能导致溶酶体酸化受阻（pH升高）。 Diphyllin也具有自噬抑制活性：Diphyllin（CAS No.：22055-22-7）处理后的细胞中LC3-II水平升高，但p62/SQSTM1降解中断，证实其对晚期自噬的抑制。Diphyllin（二叶草素）还具有抗病毒的作用，能通过阻断内体酸化，抑制pH依赖性病毒（流感病毒、登革病毒、SARS-CoV-2、埃博拉病毒等）的包膜融合和细胞进入[9]。

ROC-325（AbMole，M6260）是一种自噬抑制剂，可引起溶酶体的脱酸。ROC-325（CAS No.：1859141-26-6）的分子结构中含有氯喹骨架和Lucanthone骨架，二者均可抑制自噬，并且中和溶酶体内的pH。此外，ROC-325还能诱导溶酶体膜通透性增加[10]。

三、溶酶体酶抑制剂

溶酶体含多种酸性水解酶，包括蛋白酶（如组织蛋白酶、肽酶，负责降解蛋白或者多肽）、 糖苷酶（负责碳水化合物与糖复合物的降解）、脂酶（如鞘脂酶、胆固醇酯酶等，负责降解脂质类物质）、核酸酶（负责降解核酸类分子）、磷酸酶（负责调控溶酶体膜磷脂组成，维持膜通透性）。小分子抑制剂具有膜穿透性强、作用快速等优点，是研究上述溶酶体酶的常用工具。

DC661（AbMole，M20648）是棕榈酰蛋白硫酯酶 1（PPT1）的抑制剂，该酶属于溶酶体酯酶家族，核心功能是催化棕榈酰化蛋白的去棕榈酰化反应，参与蛋白降解与再循环。DC661（CAS No.：1872387-43-3）的分子结构中含弱碱性哌啶基团（pKa≈5.1），在细胞质中性环境中呈疏水性，可通过自由扩散穿透细胞膜；进入溶酶体酸性腔室（pH4.5-5.0）后发生质子化，实现在溶酶体中的特异性富集[11]。DC661（AbMole，M20648）通过竞争性结合 PPT1 的催化活性中心（Ser115），阻断其与棕榈酰化蛋白底物的结合。研究表明：DC661能通过抑制PPT1诱导溶酶体去酸化与脂质过氧化，并导致溶酶体膜通透化[12]、阻断自噬小体与溶酶体的融合，干扰线粒体自噬等细胞过程[13]。

Lalistat 1（AbMole，M21211）是溶酶体酸性脂肪酶（Lysosomal Acid Lipase, LAL）的选择性抑制剂，能通过特异性阻断 LAL 的脂质水解活性，调控溶酶体脂质稳态与下游信号通路，能用于研究脂质代谢异常相关疾病的机理。Lalistat 1的分子结构中含有苯并恶嗪酮母核与带有羧酸基团的脂肪族侧链，其溶酶体靶向机制依赖分子侧链的羧酸基团，该基团能在溶酶体酸性腔室中发生质子化，从而滞留在溶酶体中；此外，Lalistat 1的苯并恶嗪酮母核能与LAL活性中心的Ser153 的羟基及 His373 的咪唑环结合，阻断LAL与脂质底物（如胆固醇酯、甘油三酯）的结合。Lalistat 1（CAS No.：501104-16-1）通过抑制LAL的脂质水解活性，引发溶酶体脂质积累，进而调控多重下游信号通路：例如诱导溶酶体脂质稳态失衡、激活NF-κB炎症通路等。Lalistat 2（AbMole，M6890）是Lalistat 1的衍生物，具有相似的作用机制和效果，由于亲脂性增强，Lalistat 2（CAS No.：1234569-09-5）的细胞膜和溶酶体膜穿透能力也更强[14]。

范例详解

1. Transl Psychiatry. 2021 Aug 5;11(1):421.

郑州大学第一附属医院的实验人员研究了阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）中轴突营养不良（axonal dystrophy）的机制，特别是探讨了BDNF（脑源性神经营养因子）信号通路、自噬体-溶酶体融合以及miR-204/BRUCE/STX17轴在其中的作用。结果表明：抑制miR-204可以通过阻断BRUCE与STX17的相互作用，增强自噬体-溶酶体融合，改善BDNF核内运输，从而减轻AD中的轴突营养不良。AbMole的Bafilomycin A1（Baf-A1，巴弗洛霉素A1，AbMole，M4953）在上述文章中被科研人员使用，它通过抑制V-ATPase的活性来阻断自噬体与溶酶体的融合。这种抑制作用被用来模拟溶酶体功能障碍，进而研究其对轴突营养不良的影响[15]。

图 3. Autophagosome–lysosome fusion mediates BDNF nuclear transport and axonal dystrophy[15]

2. Int J Mol Sci. 2021 Aug 16;22(16):8779.

华南师范大学的科研人员使用了AbMole的MG132 (AbMole, M1902) , Concanamycin A (Con A，Folimycin，刀豆素A，AbMole，M7737) 。实验人员研究了植物在缺铁条件下，自噬途径如何介导ESCRT组件中FREE1的降解。研究发现：FREE1是植物ESCRT复合物的特有成分，在缺铁时会被转运到液泡中降解，泛素化的FREE1蛋白的液泡转运由自噬途径介导。自噬缺陷突变体（atg5-1和atg7-2）积累更多的FREE1蛋白，并对缺铁表现出超敏反应，在缺铁条件下，自噬相关基因上调，促进FREE1的自噬降解，从而可能减轻FREE1对铁吸收的抑制作用。Concanamycin A 是一种液泡H+-ATP酶抑制剂，能显著阻断CHX处理后FREE1蛋白水平的下降，表明FREE1主要通过液泡依赖机制降解。

图 4. Autophagy-dependent degradation of FREE1[16]

参考文献及鸣谢

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[15] Zhang, L.; Fang, Y.; Zhao, X.; et al. BRUCE silencing leads to axonal dystrophy by repressing autophagosome-lysosome fusion in Alzheimer's disease. Translational psychiatry 2021, 11 (1), 421.

[16] Zhang, T.; Xiao, Z.; Liu, C.; et al. Autophagy Mediates the Degradation of Plant ESCRT Component FREE1 in Response to Iron Deficiency. International journal of molecular sciences 2021, 22 (16).