文 章 信 息

期刊名称：Grassland Research 《草地研究（英文）》

英文标题：Management strategies to improve the nitrogen use efficiency in grasslands and the protein quality in grass silages: Lessons from a practical study on dairy farms in Flanders

中文标题：提高草地氮素利用效率和青贮牧草蛋白质质量的管理策略：来自Flanders地区奶牛场的实践研究

第一作者：Tine Van den Bossche，农产水研究所，梅莱，比利时

通讯作者：Karen Goossens，农产水研究所，梅莱，比利时

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编译者：苏楷淇 兰州大学草地农业科技学院  在读博士生

说明：该文仅代表编译者对论文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。

 摘 要 

研究背景——草原是反刍动物的主要饲料来源。法律对氮肥的限制迫使农民优化草地氮素利用效率(NUE)和青贮牧草的蛋白质质量。

研究方法——本研究包括Flanders地区10个奶牛场的草地数据。单块三叶草草坪由混合种子组成。首次施用前取样土壤和肥料，分析测定植株速效氮含量。计算每个可能地区的年氮肥利用效率(n=28)。在青贮前采集预枯萎草样本(n=65)，在同一农田采集青贮草样本(n=41)。

研究结果——与纯草地相比，三叶草田的氮肥输入量较低(75比265 kg ha^-1)，从而提高了氮肥利用效率。青贮牧草的蛋白质品质与预荒漠草的有机物消化率、糖含量和干物质含量呈正相关。相反，粗灰分含量则体现相反的作用。

研究结论——这些结果强调了三叶草的重要性和潜力，以及优化草地管理以提高草地氮肥利用效率和青贮饲料蛋白质品质的现实可行性。

关键词——三叶草、草地、青贮草、管理、氮素利用效率、蛋白质品质

  背  景 

由于欧洲饲料蛋白质的自给率较低，因此需要从欧盟以外进口大量富含蛋白质的饲料，以满足对高质量蛋白质来源的需求(Murphy-Bokern et al., 2017; Taube et al., 2014)。然而，草原提供了宝贵的当地植物蛋白来源，当牛食用这些植物蛋白时，可以有效地转化为人类可食用的蛋白质(De Cuyper et al., 2022; Peyraud, 2014; Wilkinson & Lee, 2018)。随着未来粮食需求的增加，提高草地系统的效率和质量以确保可持续和有竞争力的反刍动物生产变得至关重要(Lüscher et al., 2014; Taube et al., 2014)。

草原具有多种功能。它们是家养反刍动物和野生食草动物的主要饲料来源。此外，它们还提供调节和社会生态系统服务，包括水土保护(如，通过永久土壤的覆盖防止地表侵蚀)、碳封存以及通过提供野生动物栖息地来支持生物多样性。此外，草原景观为社会提供了审美吸引力和娱乐机会(Carlier, 2010; Hopkins & Holz, 2005; Peyraud, 2017)。到2020年，全球约有31.8亿公顷的土地是草原，占欧洲农业用地面积的38%。然而，在过去30年中，欧洲草原面积由于农业实践和土地利用被削减(粮农组织FAO, 2022; Peyraud, 2017)。在比利时，草原占农业用地面积的35%，约为215901公顷。然而，自1990年以来，比利时的草原面积也减少了5% (STATBEL, 2022)。

多年来，以植物多样性高为特征的草原的粗放管理被更集约的管理所取代(Isselstein et al., 2005)。新品种和新技术提高了草地的产量和质量，但最大的提高是通过施肥实现的(Carlier, 2010; Egan et al., 2019; Martínez-Dalmau et al., 2021)。迄今为止，世界范围内氮肥使用量的增加趋势仍在增加，尽管作物对肥料的反应通常用米切利希的收益递减定律来建模，该定律指出植物不能无限生长，并且存在最大产量(Martínez-Dalmauet al., 2021)。这种高水平的施肥是不可持续的，因为近一半的氮肥没有被作物利用，而是通过挥发、径流或淋失而损失。这些损失分别通过酸化和富营养化(造成生物多样性丧失)以及对空气、土壤和水质的影响，对陆地和水生生态系统以及人类健康造成不利影响(Martínez-Dalmau et al, 2021; de Vries, 2021)。为了解决这些问题，欧盟成员国正在对草地和其他作物的氮肥施用实施法律限制(Carlier, 2010)。

环境影响、成本增加以及对无机和有机肥料总氮投入的更严格立法重新燃起了人们对植物多样性草原和豆科植物的兴趣，尤其是三叶草方面。三叶草与根瘤菌共生，通过增加有效氮、减少肥料等对氮输入的需求来固定大气氮的能力对草地有益(Bruinenberg et al., 2002; Carlier, 2010; Harris & Ratnieks, 2022)。多年生黑麦草(Lolium perenne L.)等禾草物种与白三叶草(Trifolium repens L.)等饲草豆科植物的混合可以改善油料结构，有利于访花昆虫，通过肥料减少对氮的输入需求，并通过生态位互补和更有效地利用可用资源提高生产力(Harris & Ratnieks, 2022)。后者通常用养分利用效率来表示，反映作物在一定产量下对施用养分的回收能力(Martínez-Dalmau et al., 2021)。具体而言，氮利用效率(NUE)对土壤氮有效性和外源氮输入的变化均有响应(Egan et al., 2019)。与其他作物相比，单作草地即使在高施氮量下也能更有效地吸收氮。草地的临界点出现在270 kg N ha^-1的有效施氮量。此时，干物质(DM)产量得到优化，但与此同时，NO₃-N°残基开始上升，导致NUE随后降低(D'Haene et al., 2014)。此外，施氮增加了草的粗蛋白质(CP)含量(Abts et al., 2015;Elgersma et al., 2006)。然而，CP与小肠消化真蛋白(DVE)含量(有效蛋白)呈曲线关系(van Vuuren, 1993)。因此，最大的挑战在于寻找氮肥、DM产量和DVE含量之间的最佳平衡，而不是一味的追求最大值。‘

为了达到法定的氮肥标准，农民必须优先提高牧草对氮的利用，其次是提高牧草的蛋白质质量。Ramírez和Reheul(2009)对Flanders地区奶牛场氮素利用效率统计模型的研究表明，氮素利用效率随着“每公顷肥料含氮公斤数”的增加而降低。因此，要实现更好的蛋白质产量，可以将三叶草加入草混合物中(这降低了人工施氮的需求)，并考虑肥料类型、土壤氮供应能力、氮分等因素和施氮时间。此外，每公顷草地蛋白质产量的变化强调了实现更好的蛋白质质量的巨大潜力(Peyraud, 2017)。提高蛋白质质量可以通过与收获时的生长阶段、时间、预萎蔫和潜在的青贮添加剂相关的最佳收获实践来获得。然而，实践上的主要的挑战在于提高每公顷可消化蛋白产量，同时最大限度地提高草地的氮肥利用效率。因此，本研究旨在对Flanders地区10个奶牛场的53块草地进行草地管理评价，探讨优化草地氮肥利用率和青贮牧草蛋白质质量的最佳实践。

  材料和方法 

草地选取和数据收集：

在2020年的生长季节，西佛兰德斯省10个比利时奶牛场的53块草地被选为研究对象。

这些农场是从Inagro网络中精心挑选出来的，以确保它们在Flanders地区的奶牛场中具有代表性(基于土壤类型、管理、地理位置和其他特征)。在每个农场，选择4-7块临时草地(0.58-15.65公顷)，主要种植多年生黑麦草、意大利黑麦草(Lolium multiflorum Lam.)、三叶草(Trifolium pratense L.或T. repens L.)，以及少量其他物种(timothy(Phleum pratense L.)或高羊茅(Festuca arundinacea (Schreb.))，在生长季节进行随机选择。第一次割草(4月15日至5月20日割草)时，所选田地的表面至少占农场割草总面积的60%。两个农场(共10块草场)实行有机管理。

在整个实验过程中，收集各种数据。测定了53块草地的土壤特征、混合种子组成、施氮量和每割草预枯草产量。对于每次割草，在青贮之前从预枯萎的草中提取三到六个样本(详情如下)。这个汇集的草样本可能包含来自农场内一个或多个领域的草，在同一天修剪和青贮。表1提供了五次割草的概述，指出了第一次和最后一次割草的日期、唯一草样本的数量以及与这些草样本相关联的田地的数量。当青贮草可以与特定的预枯萎草样品相关联时，对其进行采样(不考虑含有不同切口的青贮草)。

表1 概述第一次和最后一次割草日期，独特的预枯萎草样本数量，以及与这些预枯萎草样本相关的田地数量。

为了建立有关土壤性质或管理的现场数据与从多个领域获得的预枯萎草样本之间的联系，计算了这些参数的平均值，并根据草样本产生的各个领域的表面积分配了权重。此外，在可能的情况下，还对每个地块的整个生长季节进行了评价。在53块地中，有28块地可以对整个生长季节进行评价。由于第一次刈割后放牧(n = 4)、第一次刈割后种植另一种作物(n = 10)、缺少草样(n = 8)或缺少草产量(n = 3)， 25块草地无法进行评估。此外，来自一个或多个草地的65个不同采伐的预枯萎草样本和41个可与单个预枯萎草样本相关联的青贮草样本。该实验设计概述如图1所示。

图1 实验设计概述，显示了考虑到的农场、草地和样本的数量。

混合种子中的白三叶：

根据混合种子信息，对纯草地和草三叶草地进行了区分。白/红三叶草在混合种子中的比例在7% ~ 48%之间。在第二次和第三次切割之前，在每个田地中视觉上确认了三叶草的存在。当混合种中三叶草的平均比例(以田面加权)超过7%，与单田最小三叶草比例一致时，即为草-三叶草。

气候记录：

实验年是比利时有史以来最温暖的一年(1833年测量，Ukkel)，年平均气温为12.2°C(正常:11°C[1990-2020])。此外，4月和5月非常干燥，阳光充足，8月5日至16日出现了强烈的热浪。此外，2020年降水量也低于平均水平，为731.9 mm(正常值:837.1 mm[1990-2020])，仅有169天降水(正常值:190天[1990-2020])(KMI, 2021)。图2显示了2020年气温和降雨量与1990-2020年平均值的对比。

图2 2020年比利时天气(降雨量和温度)与1990年至2020年的平均值(KMI, 2021年)。

土壤取样和分析:

在草生长季节开始(2 - 3月)第一次施肥前，采集10 cm表层土壤样品。对于每个田地(最多5公顷)，以“W”型模式行走的方式采集了40个子样本，这些样本汇集在一起用于后续分析。在分析之前，土壤样品在40°C下干燥，轻轻研磨并筛选(2mm)以去除砾石，残茬和根。然后将125g土壤放入标准玻璃罐中，在室温下进行平衡，并在气候控制的房间中使用Q-行间傅立叶变换近红外光谱（Q-interline Fourier transform near-infrared spectroscopy ）(FT-NIRS)进行重复扫描。这样就可以测定总氮(kg N ha^-1)和植株速效氮(kg N ha^-1)。为此，利用FT-NIRS测定溶解总氮和溶解有机氮，并根据CaCl₂方法进行校准(Houba et al., 2000)。

总溶解N为溶解的有机N+NO₃+NH₄。因此，总NO₃和NH₄(植物有效氮)是根据FT-NIRS结果计算的，而不是单独确定的。总溶解氮的校准曲线基于来自不同土壤类型(轻砂到重粘土，有和没有沙砾)的近56000个样品，R2为0.99，性能偏差比(RPD)为8.6。溶解有机氮校正曲线基于4400多个不同土壤类型(轻砂到重粘土，是否存在沙砾)的样品，R2为0.89,RPD为2.8。

预枯萎草产量：

在收获时，通过称重称重桥上的第一辆青贮拖车和计算从每个田地装载的青贮拖车的数量来估计每个割地和田地的预枯草产量。然而，一个农场无法遵守协议并提供草产量。因此，该农场提供的田地(n = 3)的数据被排除在全年评估(如上所述)的数据分析之外。

预枯萎草和青贮草的取样和分析：

在关闭筒仓之前，共收集了69个预枯萎草样本(表1)。从筒仓顶部的三到六个位置(取决于筒仓的长度和高度)采集钻孔样本，并将其汇总以供后续分析。草青贮样品(n = 41)在储存至少37天后通过抓取样品或钻取样品进行采集。在青贮料切割边缘的9个地方以“W”形模式采集抓斗样本或在筒仓上的3个地方采集钻孔样本。子样本合并以作进一步分析。最终，65个预枯萎草样本可用于数据分析。

每个预枯萎的草或草青贮样品的亚样品在65°C的通风烘箱中干燥，然后通过1 mm筛网研磨(Wiley, Rheotec)。残留水分测定在103°C干燥(EC, 1971b)。粗灰分在550°C (ISO:5984, 2002)下焚烧得到。CP (N × 6.25)采用凯氏定氮法(ISO:5983-2, 2005)测定。用石油醚提取粗脂肪(ISO:6492, 1999)。中性洗涤纤维(NDF)含量用Ankom纤维分析仪Ankom Fiber Analyzer 用α-淀粉酶和亚硫酸钠测定，并在无灰基础上表现(Van Soest et al., 1991)。酸性洗涤纤维(ADF)含量采用Ankom纤维分析仪Ankom Fiber Analyzer 测定，以不含灰分表示;然后用硫酸处理残渣，得到酸性洗涤剂木质素(ADL) (Van Soest et al., 1991)。糖用40%乙醇提取，并根据Luff Schoorl方法(EC, 1971a)进行分析。按照Van Es,(1978)程序，根据纤维素酶对有机质(OM)的消化率(De Boever et al., 1986)和新鲜牧草粗灰分含量，用多元回归方程(De Boever, 1999)估算了泌乳净能(NE_L)含量，而对于青贮牧草，DM和CP含量是额外的变量(De Boever, 2020)。

依据荷兰蛋白质系统(Van Duinkerken et al., 2011)，收集37种草青贮的化学成分、纤维素酶消化率和蛋白质溶解度数据集，根据CVB (2004) (De Boever, 2020)的方案，在3头奶牛的瘤胃降解特性中原位测定了DVE的含量和瘤胃降解蛋白质平衡(OEB)，使用自己开发的回归方程进行了估算。从100 g草青贮水提物中，分析了草青贮发酵特性:pH值、氨组分(NH3-N/总N)(ISO 5983-2，未预先破坏)、乳酸(酶)(Gawehn, 1984)、挥发性脂肪酸和醇(Jouany, 1981)。

氮肥：

在每个农场第一次施用肥料前，在生长季节开始时(2 - 3月)取样粪便。为了获得有代表性的样品，在地窖中机械混合粪便后取10个亚样品。利用粪便管通过栅格的开口收集亚样本。然后将这些子样本合并在一个桶中，并在池样中均质以进行分析(BAM/del3/01-A, 2019)。对每个农场汇集的粪便样本进行DM分析(BAM/deel3/03, 2021;BAM/deel4/ 03,2021)和N含量(BAM/deel3/06,2021)。每个农民在整个生长季节记录了他们的肥料和粪肥管理的田间数据(施用日期、数量和肥料类型)。根据Hoeks(2012)的NUE系数，计算了每块地每次割草的有效氮总量。

青贮添加剂的应用:

农民提供了每种割草青贮饲料的青贮添加剂应用信息。所使用的青贮添加剂均属于Bonsilage产品。

数据收集及分析:

根据收集到的数据编制了三个数据集。第一个数据集包含了整个生长季节监测的28个草地的数据，所以是四到五次切割，没有放牧或丢失数据。第二个数据集(n = 65)包含预枯萎草样本的数据。第三个数据集(n = 41)包括青贮草样本及其对应的预枯萎草样本的数据。对于第一个数据集，根据预枯草样品的产量和DM、N、NE_L和DEV 含量，计算不同刈割的预枯草产量变量(DM、N、NE_L和DVE产量)。

将每年每块地不同刈割的产量变量和氮肥用量相加。预枯萎草的化学成分(DM、CP、糖、粗灰分、NDF、ADF和ADL)和营养价值(NEL、DVE、OEB和可发酵OM [FOM])变量根据每期DM草产量加权计算。此外，在整个生长季节中，重新计算了每个地块的总和净氮肥利用效率:

CP和DVE输出的N值分别除以因子6.25。采用以混合种子植物成分(纯草vs草三叶草)为自变量的线性回归模型对草地各变量进行分析。变量以均数±SEM表示。

第二个数据集包含预枯萎草样品(n = 65)的化学组成(DM、CP、糖、粗灰分、NDF、ADF、ADL)和营养价值(OM消化率[%]、NEL、DVE、OEB和瘤胃FOM)变量。第三个数据集包含发酵特性(pH、氨氮分数[%]、乳酸、乙酸、丁酸、醇类和发酵产物[乳酸、乙酸、丁酸和醇类总和])、化学成分(DM、CP、糖、粗灰分、NDF、ADF、ADL)和营养价值(OM消化率[%]、NEL、DVE、OEB、和FOM)变量(n = 41)以及相应预枯草样本的化学成分和营养价值变量。

这两个数据集用于阐明优化青贮牧草蛋白质品质(DVE)的最佳实践。因此，计算Pearson相关系数，评估草青贮DVE含量与土壤和肥料中植物速效氮、预枯草组成变量(DM、CP、DVE、糖、粗灰分、NDF)和OM消化率(%)以及草青贮组成变量(糖、pH、氨氮分数、发酵产物)之间的线性关系。采用以割草为固定效应的统计模型，考察割草1、割草2 +割草3、割草4 +割草5对预枯萎草DM、糖、OM消化率(%)、粗灰分、CP和DVE含量的影响。此外，还利用包含相关因子变量为固定效应的统计模型确定了农场管理(有机vs常规)、草地植物成分(纯草vs含三叶草的草)和青贮添加剂(是否添加)对青贮DVE含量的影响。

建立了基于预枯草组成预测青贮牧草DVE含量的多元线性回归公式。首先，计算预枯萎草单项变量(DM、CP、糖、粗灰分、NDF、ADF、ADL、OM消化率[%]、DVE、OEB、NEL和FOM)与草料DVE含量的相关性。其次，计算所有显著变量之间的Pearson相关性，当r<-0.60或r>0.60时，认为两个变量独立。最后，采用正演逐步回归方法，得到预测青贮牧草DVE含量的独立预枯草变量的最佳组合。

所有统计分析均使用统计软件R(版本4.1.2,https://www.r-project.org)(软件包lsmeans, lme4, ggplot2)进行。根据所用模型残差的图形评价(直方图和分位数-分位数图)，假设分析结果充分正态分布。p≤0.05认为差异显著，0.05<p≤0.10认为有趋势。

 结 果 

草地、预枯草和青贮草的变异性:

为符合法定氮肥标准，农民应提高草地氮素利用率，提高草地蛋白质品质。28个草地的一般数据如表2所示。这包括整个生长季节的天数、刈割间隔、土壤和肥料中的植物有效氮、DM、N、NE_L和DVE产量以及总和净氮肥利用效率。

表2 草地总生长期、刈割间隔、土壤和肥料氮素有效性、DN、氮素、NEL和DVE产量、总氮肥利用效率和净氮肥利用效率的描述性统计(最小值、平均值、最大值、标准差)(n = 28)。

缩写:DVE，小肠消化的真蛋白;NEL:泌乳净能;NUE氮素利用效率;

a每个场地的草生长季节确定在2020年2月15日开始。全年草地评价仅包含四次或五次割草的草地。

b NEL (Van Es, 1978)根据有机物的化学成分和纤维素酶消化率(De Boever et al.， 1986)用回归方程(De Boever, 1999)估算。

c DVE (Van Duinkerken et al.， 2011)是根据自己开发的回归方程估算的，该方程基于化学分析和纤维素酶消化率，这些数据来自37种草青贮的数据集，其中的瘤胃降解特征是在3头瘘管奶牛中原位测定的。

d见数据选择与分析部分式(1)。

e见数据选择与分析部分式(2)。

预枯萎草样品(n = 65)的化学成分和OM消化率以及青贮草样品(n = 41)的营养价值的描述性统计(最小、均值、最大、标准差)如表3所示。预枯草样品中约9%的DM含量极低(≤300 g kg^-1DM)，这些青贮料均在10月20日后刈割。此外，20%的青贮料粗灰分含量超过125 g kg^-1DM，表明土壤受到污染。这些结果均出现在不同割草期。

表3 鲜草样品(n = 65)化学成分和青贮草样品(n = 41)营养价值的描述性统计(最小、均值、最大、标准差)a。

缩写:ADF，酸性洗涤纤维;ADL:酸性洗涤木质素;DM:干物质;DVE，小肠消化的真蛋白;FOM:可发酵有机物;NDF，中性洗涤纤维;NEL:泌乳净能;OEB，瘤胃降解蛋白平衡；

a变量表示为g kg^-1DM。

b NEL (Van Es, 1978)根据有机物的化学成分和纤维素酶消化率(De Boever et al., 1986)用回归方程(De Boever, 1999)估算。

c DVE、OEB和FOM (Van Duinkerken et al., 2011)是利用自己开发的回归方程估算的，该回归方程基于37种草青贮的化学分析和纤维素酶消化率数据集，其中的瘤胃降解特征是在3头瘘管奶牛的原位测定的。

草地氮素利用效率研究:

混合种中纯草(n = 13)和含三叶草(n = 15)的草地的总效率和净效率如图3所示。

草和三叶草田的总利用率(107%对73%，p<0.01)和净利用率(48%对32%，p<0.01)都高于纯草田。决定NUE的变量(土壤中植物有效氮、肥料中植物有效氮、DM产量、平均CP和DVE含量以及N产量)在纯草田(n = 13)和草加三叶草田(n = 15)之间的差异见表4。

纯草田与三叶草田土壤有效氮含量(p = 0.27)、DVE含量(p = 0.64)、OEB含量(p = 0.12)、总氮产量(p = 0.36)和净氮产量(p = 0.20)差异均无统计学意义。草和三叶草田的干物质产量有较高的趋势(p = 0.08)，CP含量有较低的趋势(p = 0.06)。草-三叶草田肥料中植株速效氮(p = 0.03)和NEL含量(p = 0.05)均低于纯草田。此外，有机农场(仅提供草-三叶草田)(46 kg N ha^-1年^-1, n = 8)与常规农场(242 kg N ha^-1年^-1,n= 20)相比，肥料中的植物速效氮也较低(p<0.01)。

图3 在整个生长季节(2020年)，测定纯草地(n=13)与三叶草地(n=15)的总氮和净氮利用效率(NUE)(%)。总氮利用效率和净氮利用效率分别由肠道消化的粗蛋白质和真蛋白质的氮输出除以氮输入(土壤中的有效氮和肥料中的有效氮)计算。纯草田与混种苜蓿田两两比较的p值。字母(a, b)表示均值差异显著，p≤0.05。

表4 在整个生长季节(2020年)，决定没有三叶草(n=13)和混合种子中有三叶草(n=15)的草地的总和净氮肥利用效率的变量

注:总氮产量和净氮产量分别由肠内消化的粗蛋白质和真蛋白质计算。

缩写:DVE，小肠消化的真蛋白;NEL:泌乳净能;氮素利用效率;OEB:瘤胃降解蛋白平衡；

a 最大的SEM值

b 混合种中纯草田与三叶草田两两比较的p值。当p≤0.05时，平均值有显著差异;当0.05<p≤0.10时，平均值有差异的趋势。

c DVE和OEB (Van Duinkerken et al., 2011)是使用自己开发的回归方程估算的，该方程基于化学分析和纤维素酶消化率，这些数据来自37种草青贮的数据集，其中的瘤胃降解特征是在3头瘘管奶牛的原位测定的。

d NEL (Van Es, 1978)是根据有机物的化学成分和纤维素酶消化率(De Boever et al., 1986)用回归方程(De Boever, 1999)估算的。

e 基于粗蛋白质含量的总氮产量和基于DVE含量的净氮产量。

图4表示了纯草田与混合三叶草田的DM产量与肥料中植物有效氮的关系。随着草田和草三叶草田速效氮的增加，干物质产量显著增加(p=0.04)。图4中的虚线表示DM平均产量(11 t ha^-1;表2)所有田和植物速效氮的肥料与草和草与三叶草田的DM产量相关。结果表明，草和三叶草田需用75 kg N ha⁻¹的氮肥即可达到DM平均产量，而纯草田需用265 kg N ha⁻¹的氮肥即可达到DM平均产量。

图4 在没有(n=13)和有三叶草混合种子(n=15)的情况下，干物质（DM）产量（ton N ha^-1）与肥料中植物有效氮（kg N ha^-1）的关系。虚线表示所有田的平均干物质产量（11 t ha^-1）以及与草和三叶草田的干物质产量相关的肥料的植株有效氮。

DVE产量与肥料中植物有效氮的关系见附加信息S1:图S1为纯草田与混合三叶草田的对比。随着草田和草三叶草田速效氮的增加，DVE产量显著增加（p=0.003）。

S1中的虚线:图S1表示平均产量(759 kg ha^-1;表3)所有田和植物有效氮的肥料与草和草与三叶草田的DM产量相关。数据表明，在纯草和三叶草田，施肥100 kg N ha⁻¹即可达到平均DVE产量，而在纯草田，施肥250 kg N ha⁻¹即可达到平均DVE产量。

氮素产量与植物从肥料中获得的有效氮素的关系见S1:图S2，是纯草田与混合三叶草田的情况。氮素产量有随草肥速效氮增加而增加的趋势（p=0.08），草三叶草田氮素产量显著增加（p=0.01）。图S2中的虚线表示平均氮素产量（272 kg ha^-1；表3）所有田和植物速效氮的肥料与草和草与三叶草田的DM产量相关。结果表明，草和三叶草田氮素平均产量为110 kg N ha^-1，而纯草田氮素需要量为250 kg。

青贮牧草的蛋白质品质:

牧草青贮DVE含量（n=41）与植物速效氮土壤、植物速效氮肥料、预枯草的化学组成和饲用价值(DM、CP、NDF、糖、OM消化率、粗灰分)以及牧草青贮化学组成和品质(糖、pH、氨氮组分、发酵产物)之间的线性关系(Pearson相关)如图5所示。

青贮牧草DVE含量与预枯草粗灰分含量(p = 0.02)、青贮牧草NH3-N组分(p<0.01)、青贮牧草发酵产物(p<0.01)呈负相关。与预枯萎草DM (p <0.01)、OM消化率(p = 0.03)、青贮草糖含量(p <0.01)、青贮草pH (p <0.01)呈显著正相关。青贮牧草DVE与土壤中植物有效氮呈负相关(p = 0.08)，与肥料中植物有效氮呈正相关(p = 0.10)，与预枯草CP含量呈正相关(p = 0.07)。预枯草DM含量与青贮pH呈显著正相关(p < 0.01)，与青贮NH3-N分数和发酵产物呈显著负相关(p < 0.01)。

图5 青贮草小肠消化真蛋白质(DVE)与土壤植物速效氮(N)、肥料植物速效氮、预枯草化学组成及饲用价值(干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维、糖、有机物消化率、粗灰分)和青贮草化学组成及品质(糖、pH、氨氮组分、发酵产物)的相关图。蓝色标题表示该参数显著(p≤0.05)，与草料青贮DVE呈正相关。红色标题表示该参数与草料青贮DVE呈显著负相关(p≤0.05)。橙色标题表示与牧草青贮DVE呈显著相关(0.05<p≤0.10)。

此外，割草(1、2 + 3、4 + 5)对预枯草DM、糖、消化率、粗灰分、CP和DVE含量的影响如图6所示。

DM含量差异不显著(p > 0.05)，但变异在第4 + 5次割草时增加。第4 + 5次割草的含糖量低于第1次割草(p < 0.01)和第2 + 3次割草(p < 0.01)。与第2次和第3次割草相比，第1次割草的糖含量也更高(p =0.07)。第2 + 3次割草的OM消化率低于第1次(p < 0.01)和第4 + 5次(p < 0.01)。第4 + 5次割草的粗灰分含量高于第1次割草(p < 0.01)和第2 + 3次割草(p < 0.01)。第4 + 5次采草的CP含量高于第1次采草(p < 0.01)和第2 + 3次采草(p < 0.01)。第1次采草的DVE含量高于第2次+ 3次采草(p < 0.01)，第4次+ 5次采草的DVE含量高于第2次和第3次采草(p = 0.06)。

图6割草效果(第一次割草，2020年4月15日至2020年6月3日，n = 18;第二次+第三次削减，2020年5月20日至2020年9月12日，n = 25;第4 + 5期，2020年8月12日~ 2020年11月7日，n = 22)对预枯草小肠中干物质、糖、有机物消化率、粗灰分、粗蛋白质和真蛋白质的消化率进行测定。DM，干物质。草割(1、2、3、4、5)之间两两比较的P值。字母(a, b)表示均值差异显著，p≤0.05。

预测草料青贮DVE含量的最佳多元线性回归(R2 = 0.78, p<0.01) (n = 41)为:

y = DVE草料青贮(g kg⁻¹ DM)， x1 =预枯萎草DM (g kg⁻¹ DM)， x2 =预枯萎草CP (g kg⁻¹ DM)， x3 =预枯萎草OM消化率(%)。

最后，草地管理(有机vs传统)、混合种子的植物成分(草vs加三叶草的草)和青贮饲料添加剂(无论是否添加)对青贮牧草DVE含量的因子效应如图7所示。与有机农场的青贮牧草相比，传统农场的青贮牧草通常具有更高的DVE含量(61比52 g kg^-1 DM, p < 0.01)。纯草田的青贮草料与草和三叶草田的青贮草料相比，DVE含量更高(62比56 g kg^-1 DM, p = 0.06)。添加青贮添加剂的青贮与未添加青贮添加剂的青贮相比，DVE含量没有差异(58 vs 61 g kg⁻¹ DM, p = 0.30)。

图7 农场管理(有机，n = 8 vs常规，n = 33)、种子混合物的植物成分(草，n = 25 vs草加三叶草，n = 16)和青贮添加剂(添加，n = 15 vs不添加，n = 26)对青贮草小肠消化的真蛋白质含量的影响。有机田与常规田、纯草田与混种苜蓿田、添加或不添加青贮添加剂的青贮草地的两两比较p值。字母(a, b)表示均值差异显著，p≤0.05。字母(A, B)表示当0.05 < p≤0.10时，平均值趋于差异。

 讨   论 

草地产量和饲用价值受到遗传(如物种和品种)和环境(如天气条件、季节、土壤类型、土壤质量、施肥和刈割管理)因素的影响(Elgersma et al., 2006年)。这一实际试验数据的可变性表明，不同田地之间的草地管理存在差异。这使我们能够得出最佳实践，以获得具有高氮肥利用率的草地和具有高蛋白质质量(DVE)的青贮草。

氮利用效率:

与纯草地相比，草三叶草地的能量(NEL)含量较低，且CP水平较低(但DVE相似)。一般来说，三叶草比草含有更丰富的蛋白质(Laidlaw & Frame, 2013)。因此，与我们的研究结果相反，De Vliegher等人(2018)的研究(同样在比利时的草地上进行)表明，草-三叶草地的CP含量高于单作黑麦草地，而NEL没有差异。Sturludóttir等人(2014)没有将草-豆科混合物与纯草的CP结果进行对比阐述。然而，CP含量也会受到施氮的影响，施氮每增加100 kg ha^-1, CP含量会增加50-90 g kg^-1DM (Elgersma et al., 2006)。因此，草地肥料的高氮输入可能是其高CP含量的潜在原因。此外，CP与DVE含量呈曲线关系，而CP含量的增加会增加OEB含量(van Vuuren, 1993)。这可能解释了为什么DVE含量在草地上没有差异，但CP在数值上高于草三叶草地。草料中增加的CP仅占DVE的一小部分，而大部分是可溶的，瘤胃可高度降解的，这有助于提高OEB。将这些青贮类型与OEB呈阴性的饲料相结合是使其通过微生物蛋白的合成转化为定性蛋白(DVE)的必要条件，以防止其在瘤胃中丢失。

一般来说，与三叶草品种相比，高产草品种(如多年生黑麦草和意大利黑麦草)在肥料中高氮投入的支持下进行单一栽培，可产生更高的干物质产量(Laidlaw & Frame, 2013; Lüscher et al., 2014)。在我们的研究中，施用的肥料投入一定范围内，草三叶草田的DM产量往往高于多年生单作田或意大利黑麦草田。首先，与单一栽培相比，草原的多样性已被证明对牧草产量有积极影响(Sturludóttir et al., 2014)。包括豆科植物在内的物种丰富的草原可以高产，因为它们(i)可以从对可用资源的互补吸收中受益，(ii)更有可能显示出积极的种间相互作用，(iii)可能包含主导群落的高产物种(Lüscher et al., 2014; Sturludóttir et al., 2014; Weggler et al., 2019)。其次，多年生黑麦草和白三叶草在非常干燥和温暖的条件下都不能很好地生长(Laidlaw & Frame, 2013)。然而，人们常说三叶草在夏季生长得最好，而草在春季生长得更好(Carlier, 2010; Harris,1993)。

实验年份的特殊天气条件(见图2)可能有利于三叶草的生长。与多年生黑麦草(14-20°C)相比，白三叶的最佳生长温度(24°C)更高(Karsten & MacAdam, 2001;Schils et al., 1997)。此外，白三叶草植物比多年生黑麦草更容易克服干旱。随着早期干旱，多年生黑麦草的可用性降低，而白三叶草由于其自身的氮供应似乎能够长得更长(Karsten & MacAdam, 2001;Schils et al., 2020;Tapia et al., 2013)。此外，在水分胁迫下，牧草更容易降低叶片导电性，而三叶草则会枯萎死亡，从而减少叶面积和蒸腾作用。白三叶草的匍匐茎通过渗透调节得以保存，使植物能够在再次获得水分时从匍匐茎中生长(Karsten & MacAdam, 2001;Tapia et al., 2013)。总体而言，可以认为草三叶草田的植物生长受到正多样性效应和试验当年(2020年)特定天气条件的影响，比纯草生长更有利，从而趋向于更高的DM产量。此外，在本试验中确定DM产量的实际方法没有考虑田间损失，这在草田和草三叶草田之间可能有所不同。当然，在DM含量高的情况下，草三叶草田的损失明显高于普通草地(van Eekeren, 2000)。

豆科植物，如白三叶草和红三叶草，具有通过承载根瘤菌共生固定大气中N2的卓越能力，从而减少了对额外氮肥的需求(Harris & Ratnieks, 2022;Laidlaw & Frame, 2013)。然而，固氮的程度可能变化很大。例如，Carlsson和Huss-Danell (2003)提出，红三叶草(T. pratense L.)的地上植物组织的氮固定率从8到373 kg N ha⁻¹年⁻¹，白三叶草(T. repens L.)从10到545 kg N ha⁻¹年⁻¹。在草三叶草田，施肥管理的有效调整至关重要，因为高氮施肥会对三叶草产生负面影响，降低豆科植物在田间的比例。我们的研究发现，草三叶草田的氮素投入较低，这证明大多数农民已经调整了肥料的使用。然而，重要的是要注意，这种适应并不是在所有领域都一致的。值得注意的是，与传统农场相比，专门经营草三叶草田的有机农场施用的氮肥明显更少。这些发现强调了人工氮肥规定对有机农场的影响，促进了他们适应氮肥并最大限度地发挥三叶草的潜力(Laidlaw & Frame, 2013)。混合使用草和三叶草的田地产生了更高的总氮和净氮利用效率，这主要是由于DM产量倾向于较高，同时通过肥料输入的氮量显著降低。Egan 等人(2019)的长期研究表明，未施肥草地的氮肥利用率更高。此外，在没有额外施氮的情况下，植物种类数量较多，与物种多样性呈显著正相关。令人惊讶的是，特定植物功能群的组成，如草或豆科植物，对田地的氮肥利用效率没有显著影响。这可能是由于草类在草地上占主导地位，在研究的试验田中贡献了超过70%的植物群落生物量。

在我们的研究中，对于草和草三叶草田，DM产量、DVE产量和N产量都随着肥料中植物速效氮的增加而增加。然而，与草田相比，草田和三叶草田达到了DM的平均产量(11 t N ha⁻¹年⁻¹，2020)，化肥施氮量减少了71%(75对265 kg N ha⁻¹年⁻¹)。与草田相比，草田和三叶草田的平均DVE产量(759 kg N ha⁻¹年⁻¹，2020年)和氮素产量(272 kg N ha⁻¹年⁻¹，2020年)分别减少60%(100比250 kg N ha⁻¹年⁻¹)和44%(110比250 kg N ha⁻¹年⁻¹)。在Nyfeler等人(2011)的研究中，草-三叶草混合物中含有40%-60%的三叶草，并从肥料中获得50或150 kg N ha⁻¹year⁻¹的产量与施肥450 kg N ha⁻¹year⁻¹的草单一栽培的产量相同。这与我们的发现一致;然而，在我们的实验中，三叶草在种子混合物中的比例较低(7%-40%)。此外，欧洲对28个国家的一项分析表明，在低氮投入水平下生长的平衡良好的草-豆科植物的DM产量与高氮投入的单一草栽培相当(Lüscher et al., 2008)。

青贮牧草的蛋白质品质:

结果表明，草青贮的蛋白质品质受DM、糖、粗灰分和OM消化率4个参数的影响。值得注意的是，这些影响都是在比较草青贮DVE与预枯萎草时观察到的，除了糖，与草青贮相比仅呈显著相关。

预枯草的DM、粗灰分、OM消化率和CP含量综合考虑，可作为青贮牧草DVE含量的预测指标。预枯草样品中DM含量变化较大，变化范围为188 ~ 917 g kg^-1，平均为536 g kg^-1。DM含量在300-450 g kg ^-1之间的青贮被认为是最佳的(Kung et al., 2003;Muck, 2010)，表明本试验生产的青贮用预枯草普遍具有较高的干物质含量。这可能与实验年份(2020年)比利时非常温暖和干燥有关(见图2)(KMI, 2021年)，这加强了当时的欲枯萎性。预枯草中DM含量最高(917 g kg^-1)与制干草有关。部分预枯草样品中DM含量较低(≤300 g kg^-1 DM)与秋季(10月20日以后)收获的草有关。在此期间，湿割条件使收获的草难以有效地枯萎并获得足够的DM含量(Hurley et al., 2021; Larsen et al., 2016)。总体而言，低于25% DM的青贮料有液体损失和发酵不良的风险，而超过45% DM的青贮料在适当压实方面面临挑战，导致氧气存在增加和潜在的霉菌和酵母发育(Kung et al., 2003; Muck,°2010)。

预枯草DM含量与青贮DVE呈显著正相关。这可以通过预萎蔫导致料仓中较少的蛋白质降解的事实来解释，以较低的NH₃数值和较高的RUP水平为特征，突出了充分的预萎蔫对于优化蛋白质质量的重要性。已知较高的DM含量和萎蔫强度会提高渗透压，抑制蛋白水解酶活性，减少可溶性CP，同时增加潜在的可降解不溶CP (RUP)，最终改善蛋白质质量(DVE) (Franco & Rinne, 2023;Hartinger et al., 2019;Rupp et al., 2021)。这一机制也解释了青贮牧草DVE与NH3-N分数呈负相关，而DVE与pH呈正相关。这两种相关性分别是预枯草DM与青贮牧草NH3-N分数呈负相关和预枯草DM与青贮牧草pH呈正相关的混淆效应。较高的DM含量可导致水溶性碳水化合物(WSCs)微生物发酵减少和pH升高，这解释了预枯草DM和草青贮DVE与青贮pH呈正相关，而与发酵产物负相关的原因(Franco & Rinne, 2023;Hartinger et al., 2019;Rupp et al., 2021)。温带牧草中的水溶性碳水化合物，包括葡萄糖、果糖、蔗糖和果聚糖，在促进青贮发酵中起着至关重要的作用(Downing et al., 2008; Kagan,2022)。

预蔫草样品的糖含量变化范围为32 ~ 253 g kg^-1 DM，平均为134 g kg^-1DM。青贮草样品中较高的糖含量与青贮DVE呈正相关，说明较高的糖含量有助于提高蛋白质品质。草的最佳割草时间可以最大限度地提高植物中水溶性碳水化合物的浓度，因为它在一天中变化，并且在有光的情况下增加。在早上，水溶性碳水化合物浓度通常较低，因为在夜间没有发生光合作用时，呼吸作用利用了碳水化合物。多云的环境会进一步减少光合作用，导致水溶性碳水化合物浓度的日变化更小。因此，最好的割草时间是在下午，特别是在晴朗的天气条件下(Kagan, 2022;Mitrik, 2021)。水溶性碳水化合物含量受温度和季节的影响。在温带地区，多年生黑麦草的水溶性碳水化合物含量高于相同降水条件下较高温度的地区。在春天，阳光充足的日子和升高的白天温度有助于光合作用。然而，寒冷的夜晚会抑制呼吸(碳水化合物的利用)，阻止糖在一夜之间分解，导致水溶性碳水化合物水平升高。秋天也会发生这种情况，但由于光照强度和白天温度较低，总体光合作用比春天低。另一方面，夏季较高的整体温度有利于草的生长，可能会消耗水溶性碳水化合物的含量(Kagan, 2022;Lemaire & Belanger, 2020;Visscher, 2010)。目前的实验结果证实了这一点，其中预枯草的含糖量随着时间的推移而下降，春季(第一次切割)含糖量最高，秋季(第4和第5次切割)最低。

青贮饲料粗灰分水平越低，DVE含量越高，表明粗灰分水平升高对蛋白质品质有负面影响。饲料中的灰分含量包括内源和外源矿物质。内源性矿物质自然存在于植物中，是可取的，而外源性矿物质则来自外部，如土壤二氧化硅。总灰分分析不区分内源灰分和外源灰分;然而，减少土壤污染是保持牧草质量的关键。这是因为来自土壤污染的灰不含任何能量或蛋白质价值，因此只会稀释每千克DM草的饲料价值(Hoffman, 2005;Mitrík, 2021)。通常，豆科牧草的灰分含量约为9.0%，较高的灰分含量表明土壤受到污染(Hoffman, 2005)。

在本实验中，预蔫草样品的粗灰分含量在62 ~ 238 g kg^-1DM之间，平均为115 g kg^-1DM，表明灰分含量相对较高。事实上，在不同的刈割日期，五分之一的预枯草样品具有高粗灰分水平(>125 g kg^-1DM)。由于各种因素，包括天气条件和管理，可能会出现高粗灰分水平。例如，在割草、搬运和拾取过程中，鼹鼠丘和不平整的地面等因素会导致土壤混入作物中，从而提高青贮饲料中的灰分含量。在填充和包装过程中，土壤也可能被包装拖拉机和卡车无意中引入掩体和青贮桩中(Mitrík, 2021)。进一步的雨水可以通过泥浆引入土壤颗粒，因此高降雨量和湿割条件(主要在秋季)有助于这些因素，导致该季节粗灰分水平增加，正如本研究中发现的那样(Hurley et al., 2021; Larsen et al., 2016)。预枯草样品OM消化率变化范围为63.3% ~ 83.5%，平均为77%。与DM和糖含量相似，牧草青贮OM消化率与DVE呈正相关，说明消化率越高，蛋白质品质越好。这主要是由于可发酵OM的含量较高，导致瘤胃中微生物蛋白含量增加，内源蛋白损失减少。随着牧草年龄的增长，牧草的消化率呈下降趋势，因此早期刈割对保持牧草的营养价值更为有利。随着植物生长和质量积累，粗蛋白质浓度和消化率趋于降低，在收获的饲料质量和营养价值之间形成权衡(Lemaire & Belanger, 2020;Mayel et al., 2021)。在草的初级春季生长期间，可消化的OM含量的日减量通常在5 g kg-1DM左右(Kuoppalaet al., 2008)。随着时间的推移，较低的消化率和CP与营养期(主要是叶和茎的生长，具有高氮浓度的高消化代谢组织)向生殖期(主要是繁殖，以纤维含量较高、氮含量较低、消化率较低的植物结构组织的快速生长为特征)的转变有关(Hermansen et al., 2017; Lemaire & Belanger,°2020)。

在我们的实验中也发现了后者，因为OM消化率随着时间的推移而下降，在第一次切割时达到最高值。此外，青贮样品的蛋白质质量在传统管理的农场也高于有机管理的农场，在有草的农场比有三叶草的农场更高。采用有机管理方法的农场只播种草和三叶草的混合物，因此这强调了这两个方面之间的相互作用。然而，这些发现与预期结果有所不同，因为与纯草青贮相比，草-三叶草青贮通常显示CP和DVE含量升高(见上文)(Laidlaw & Frame, 2013;Van Straalen et al., 1993)。此外，在本试验中，添加青贮添加剂对草青贮的蛋白质品质没有影响。这一观察结果与Oliveira等人(2017)进行的荟萃分析得出的预期形成鲜明对比。他们的研究表明，同发酵和兼性异发酵乳酸菌接种剂通常会导致乳酸浓度的增加和NH₃-N浓度的降低，这可能表明蛋白质质量的提高。值得注意的是，农场的数量相对较少(n = 10)，这给准确描述管理效果带来了挑战。此外，有机农场的子集(n = 2)很低，因此与大多数传统农场(n = 8)相比，代表性较小。

 结   论 

禾草和三叶草混合种田(7% ~ 40%)的总氮肥利用效率和净氮肥利用效率均高于纯草地，这主要是由于氮肥输入量显著降低所致。两种类型田的DM产量均随肥料有效氮的增加而增加，但草和三叶草田的DM平均产量比纯草地少71%。因此，本实践研究表明，至少在适当调整氮肥施用量的情况下，草三叶草是一种适当的策略，可以对农田氮肥利用效率产生积极影响。此外，青贮牧草的蛋白质质量(DVE)可根据实际建议进行优化，如在阳光充足的下午、生长早期割草、尽可能避免土壤污染、确保充分的预蔫。季节变化也影响这些参数，春季糖和有机质消化率较高，秋季干物质消化率较低，粗灰分消化率较高。通过预枯草的DM、CP、粗灰分和OM消化率来估算草青贮DVE的含量。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/glr2.12070

引用格式：Van den Bossche, T., De Boever, J. L., Haesaert, G., Cougnon, M., Debevere, S., Vandaele, L., & Goossens, K. (2024). Management strategies to improve the nitrogen use efficiency in grasslands and the protein quality in grass silages: Lessons from a practical study on dairy farms in Flanders. Grassland Research, 3(1), 18–32. https://doi.org/10.1002/glr2.12070

排版：徐萌蔚

统筹：秦泽平 沈瑾慧

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