文章信息

期刊名称：Grassland Research（草地研究）
中文标题：植物基因组编辑：CRISPR、碱基编辑、先导编辑等
第一作者：谢宇杰（兰州大学）
通讯作者：邱全胜（兰州大学)

编译者：尤杨 兰州大学草地农业科技学院 在读博士生

说明：该文仅代表编译者对论文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。

摘要

规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统是一种快速发展的基因组编辑技术，在识别基因功能以及改善农业生产和作物育种方面具有广泛的应用。本文综述了基因组编辑技术在植物中的应用和发展。我们简要介绍了CRISPR/Cas9技术，并分析了由CRISPR技术发展起来的碱基编辑和先导编辑技术，并对一些新的先导编辑衍生技术进行了评估。

前言

规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（CRISPR -associated protein 9, Cas9）系统于2012年成为一种有效的基因组编辑工具（Cong et al., 2013; Jinek et al., 2012; Mali et al., 2013）。自2013年首次应用于植物基因组编辑以来，CRISPR/Cas9在基因功能研究和作物育种领域产生了革命性的影响（Tiwari et al., 2021; K. Zhang, Raboanatahiry, et al., 2017; H. Zhang, Zhang, et al., 2017; Y. Zhang et al., 2018）。CRISPR/Cas9技术是一种高效、精确、快速的植物基因组工程，已被应用于基础和应用植物科学中，用于多种植物的增产、调节代谢过程和提高抗逆性（Gao, 2021; Jinek et al., 2014; S. Li & Xia, 2020; Zheng et al., 2021）。近年来，一种基于CRISPR的碱基编辑和先导编辑技术的发展拓宽了基因组编辑的范围和应用（Anzalone et al., 2019; Gaudelli et al., 2017; Komor et al., 2016; Nishida et al., 2016）。碱基编辑是一种新颖的方法，可以在不破坏基因或不需要供体模板的情况下以可编程的方式进行精确的核苷酸替换（Komor et al., 2016）。与CRISPR/Cas9相比，该先导编辑系统提高了基因组编辑效率和产品纯度，已迅速应用于植物和农业研究（Butt et al., 2020; H. Li et al., 2020; Tang et al., 2020）。本文综述了基因组编辑技术在植物中的最新发展和应用。

CRISPR/CAS9

CRISPR/Cas9技术由两个核心部分组成：与所需靶基因匹配的单一向导RNA（sgRNA）和Cas9，以及产生双链DNA断裂的核酸内切酶（图1）。sgRNA在发挥作用时与Cas9结合形成sgRNA/Cas9复合物。然后，sgRNA/Cas9复合物识别基因组中与原间隔序列临近基序（PAM）相关的20个核苷酸（nt）的目标原间隔序列，导致特定的切除和形成双链断裂（DSBs）。针对DSB，两种不同的DNA修复机制被激活：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）（图1）（Symington & Gautier, 2011）。

图1：CRISPR/cas9介导的基因组编辑。

Cas9蛋白与sgRNA相互作用并在基因组DNA的PAM序列上形成DSB。DSB由NHEJ或HDR修复。在NHEJ过程中，基因组的随机插入或缺失被引入。在HDR中，与DSB位点具有同源臂的供体序列用于整合精确突变。Cas9，CRISPR相关蛋白9；CRISPR，规律成簇间隔短回文重复序列；DSB，双链断裂；HDR：同源定向修复；NHEJ：非同源末端连接；PAM：原间隔序列临近基序；sgRNA：单一向导RNA。

NHEJ在没有同源模板的情况下参与断裂DNA分子的直接同源，导致DSB位点的插入和缺失（indels）或替换（图1）。NHEJ编辑的缺点是缺乏精度（Hua et al., 2022）。另一方面，HDR在供体DNA序列存在的情况下引入新的等位基因，纠正现有的突变或以更精确的方式引入感兴趣的新序列（Hua et al., 2022）。植物实施HDR具有挑战性，因为它依赖于序列特异性核酸酶和DNA供体的同时递送（Steinert et al., 2016; Y. Zhang et al., 2019）。植物的细胞通过NHEJ途径而不是HDR途径修复DNA这一事实也给植物带来了挑战（Puchta, 2005; Qi et al., 2013）。此外，DSB可能导致意想不到的结果，如大片段缺失、染色体异常和意外的插入或缺失（Anzalone et al., 2019）。

碱基编辑

碱基编辑是一种在单碱基水平产生突变的新型基因组编辑方法（Molla & Yang, 2019）。利用胞嘧啶脱氨酶的CRISPR/Cas介导的碱基编辑技术可以在不需要双链DNA断裂或供体模板的情况下，在靶基因组位点精确、高效地插入点突变，在酵母、植物、哺乳动物和人类细胞的基因校正和遗传多样性方面具有重要的潜力（Bharat et al., 2020; Komor et al., 2016; Lu & Zhu, 2017; Nishida et al., 2016; Ren et al., 2017）。碱基编辑器融合了催化无活性的CRISPR/Cas9结构域（Cas9变异体、死亡Cas9或Cas9切口酶）和可将一个碱基转换为另一个碱基的胞嘧啶或腺苷脱氨酶结构域（Mishra et al., 2020）。

胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）和腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）是目前已开发的两大类碱基编辑器（Antoniou et al., 2021; Kantor et al., 2020）。这两种碱基编辑器可以在基因组中安装（Kantor et al, 2020）C→T、G→A、A→G和T→C这四种转换突变（Molla & Yang, 2019），而不会产生双链DNA断裂（Xu & Liu, 2021）。CBE和ABE碱基编辑器因其简单、高效而被广泛应用于包括植物在内的多种生物中，用于基因功能注释和基因校正。这两种方法都已被证明对植物细胞有效（Y. Chen et al., 2017; Hua et al., 2018, 2019; Kang et al., 2018, 2020; J. Li et al., 2017; Lu & Zhu, 2017; Ren et al., 2017; Shimatani et al., 2017; F. Yan et al., 2018; Zong et al., 2017, 2018）。

CBEs胞嘧啶碱基编辑器

碱基编辑工具箱中的第一个成员是由胞苷脱氨酶结构域与Streptococcus pyogenes Cas9切口酶[nSpCas9 (D10A)]或催化缺陷型Cas9（dSpCas9）融合而成的CBEs（Komor et al., 2016; Nishida et al., 2016）。CBEs可在包括植物在内的多种物种中有效诱导靶位点的胞嘧啶（C）突变为胸腺嘧啶（T）[或鸟嘌呤（G）突变为腺嘌呤（A）]（图2a）。

图2：碱基编辑原理图。

（a）C-to-T碱基编辑。CBE是nCas9（橙色）与胞苷脱氨酶（黄色）和UGI（灰色）融合。CBE与sgRNA（棕色）结合，靶向特定的DNA序列。胞苷脱氨酶使C变为U，nCas9使单链断裂。UGI阻碍U切除。最后，C-G通过DNA修复和复制转变为T-A。（b）A-to-G碱基编辑ABE是nCas9（橙色）与TadA-TadA*（黄色）融合。ABE结合sgRNA（棕色）靶向特定的DNA序列。TadA-TadA*将A变为I，nCas9将单链剪切。最后A–T通过DNA修复和复制转化为G–C。ABE，腺嘌呤碱基编辑器；CBE，胞嘧啶碱基编辑器；nCas9，Cas9切口酶；TadA，转移RNA腺嘌呤脱氨酶；TadA*，进化的TadA变体；UGI，尿嘧啶糖基化酶抑制剂。

在水稻中，CRISPR-Cas9胞苷脱氨酶融合碱基编辑通过除草剂选择的多重编辑诱导了多个抗除草剂点突变，而在番茄中，通过纯合子的可遗传DNA替换产生了无标记植物（Shimatani et al., 2017）。Zong等人（2017）利用nCas9胞苷脱氨酶融合技术，在原生质体和再生水稻、小麦和玉米植物中实现了胞嘧啶从第3位到第9位的胸腺嘧啶靶向转化，其频率高达43.48%。利用花浸法将胞苷脱氨酶Cas9n–UGI（CBE3）转化到拟南芥（Arabidopsis）中，改变乙酰乳酸合酶（ALS ）基因Pro197 的靶密码子CCT。结果表明，T1代C→T突变效率约为1.7%。在拟南芥中，ALS基因的靶向碱基编辑可以有效地产生可遗传的除草剂抗性（Y. Chen et al., 2017）nCas9与胞苷脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI）融合后，在水稻中产生了靶向点突变。

A3A-PBE（人类APOBEC3A）在小麦、水稻和马铃薯的17-nt脱氨基窗口内具有不同的序列，在广泛的内源性基因组位点上高效地产生C到T的转换（Zong et al., 2018）在C到T突变的西瓜植物中对ALS基因进行碱基编辑，在T0中效率为23%。利用CRISPR/Cas9介导的碱基编辑技术培育出一种非转基因抗除草剂西瓜品种（Tian et al., 2018）。利用胞苷脱氨酶结构域和nCas9和UGI融合，构建了一套高效、精确的GhBE3碱基编辑器，用于定位异源四倍体棉花的GhCLA和GhPEBP基因。在3个靶位点上实现了C•G→T•A的转换，编辑效率为26.67%–57.78%，并无脱靶效应（Qin et al., 2020）。

CBE在番茄和马铃薯中利用农杆菌（Agrobacterium）介导的转化技术靶向ALS基因，成功高效地编辑了目标胞苷碱基，获得了在番茄中精确碱基编辑效率高达71%的抗氯嘧磺隆植物。此外，在第一代番茄和土豆中分别产生了12.9%和10%的编辑过但无转基因植物（Veillet, Perrot, et al., 2019）。CBE在四倍体马铃薯中高效而精确地诱导KTGGL编码位点的DNA置换，导致氨基酸序列的离散变异，产生一个功能缺失的等位基因（Veillet, Chauvin, et al., 2019）。通过将Petromyzon marinus Cas9（SpCas9）的D10A切口酶与PmCDA1和UGI融合，获得了两个高效的基于胞嘧啶脱氨酶1（PmCDA1）的CBE（PBE），即SpCas9切口酶-PBE和VQR切口酶（VQRn）-PBE，扩大了基因组靶向水稻胞嘧啶向胸腺嘧啶（C-to-T）替代的范围。此外，sgRNA修饰后的VQRn-pBE的编辑效率进一步提高（Y. Wu et al., 2019）。

Jin等人（2020）开发了两个高效的CBE变异体，A3Bctd-VHM-BE3和A3Bctd-KKR-BE3。全基因组测序分析表明，这些新的CBE消除了水稻植物中不依赖sgRNA的DNA脱靶编辑。此外，这两个碱基编辑器变体在其目标位点产生的多次C编辑更少，CBEs也有望成为编辑顺式元件的工具（cis elements）用以微调基因表达。例如，最近用这种方法提高了草莓果实中的糖含量（Xing et al., 2020）。CBE系统通过精确编辑P197位点的BnALS 基因，有效地将C-to-T转换为目标sgRNAs，从而产生抗除草剂甘蓝型油菜（Brassica napus）。

2021年，Ren等比较了7个CBE_V01编辑器与3个iSpyMacCas9 CBE_V01编辑器、4g个CBE_V02编辑器、3个CBE_V03编辑器和4个CBE_V04编辑器。根据他们的研究，A3A/Y130F-CBE_V0是水稻和拟南芥中最有效的C-to-T编辑器，而由A3A/Y130F衍生的Cas9-NG和iSpyMacCas9分别在NAAR和NG PAM位点提供高效的碱基编辑，扩展了植物基因组中的目标范围。此外，A3A/Y130F-CBE_V04和PmCDA1-CBE_V04进一步提高了CBE的编辑活性和纯化。A3A/Y130F-CBE_V04和PmCDA1-CBE_V04由于其高效、高纯度和特异性，降低了sgRNA依赖的脱靶效应，成为植物基因组编辑的首选CBE（Ren et al., 2021）。利用hAID胞嘧啶脱氨酶的工程变体，具有不同活性窗口和靶范围的碱基编辑器工具包被开发，该碱基编辑器能够通过创建上游开放阅读框架和分析非编码基因（包括microRNA海绵）的功能缺失，有效下调植物中的靶基因活性（Xiong et al., 2022）。

ABEs腺嘌呤碱基编辑器

ABEs由来自大肠杆菌（Escherichia coli ）的Cas9q切口酶和工程转移RNA腺苷脱氨酶组成，已被开发用于诱导哺乳动物细胞中的A•T向G•C转化（图2b）（Gaudelli et al., 2017）。ABEs在作物育种和基因功能研究中具有很强的靶向基因校正、新种质的创建和功能突变体获得的能力（D. Yan et al., 2021）。与目前基于Cas9核酸酶的技术相比，ABEs诱导点突变更有效、更洁净，脱靶基因组修饰更少。ABE系统可以在不切割双链DNA的情况下直接引入所有4种转换突变（Gaudelli et al., 2017）。目前，ABEs已采用多种CRISPR系统，包括SpCas9、SpCas9-NG、ScCas9和SaCas9（Hua et al., 2019; Ren et al., 2019; M. Wang et al., 2020; F. Yan et al., 2018）。

X. Li等（2018）报道了一种利用与CRISPR/Cas9融合的进化转移RNA（tRNA）腺苷脱氨酶的新植物ABE，该酶在原生质体中高效地将A•T转化为G•C，在水稻和小麦再生植株中频率最高可达7.5%和59.1%。此外，还获得了OsACC中C2186R取代的水稻抗除草剂植株（X. Li et al., 2018）。利用Cas9n引导的TadA:TadA7.10异源二聚体，成功构建了一种荧光跟踪ABE，该ABE高效、清洁地在水稻中引入了A•T到G•C的转换（F. Yan et al., 2018）。ABE-P1（ABE plant version 1）是通过将重组蛋白（ecTadA*7.10）融合到SpCas9（D10A）切口酶的N端，并向其C端提供VirD2核定位信号而开发的。ABE-P1在水稻的OsSPL14位点进行了评估，发现其编辑效率为26%。ABE-P1以可编程的方式高效、特异地将目标A•T转换为G•C，可用在基于高效的多重编辑（Hua et al., 2018）。

植物亲和性ABE系统已成功应用于拟南芥（Arabidopsis thaliana）和甘蓝型油菜（B. napus）原生质体的瞬时转染和农杆菌介导的单株转化。通过FT蛋白的精确A-to-G替换或PDS3 RNA转录物的错误剪接，转基因植物获得了晚开花和白化表型。在植物中使用ABE可以诱导新功能化或改变信使RNA的剪接，为基因组工程和生物技术开辟了新的可能性（Kang et al., 2018）。Hua等人（2019）证明了含有SpCas9-NG的ABE可以在水稻的内源性NG PAM位点发挥作用，因此可以用于扩大ABEs在水稻中的目标范围。

合成了一个水稻密码子优化的ecTadA- XTEN-TadA*7.10，并将其连接到N端SpCas9（D10A）切口酶上。因此，构建了水稻密码子优化的ABE-nCas9工具，诱导重要农业基因关键单核苷酸多态性（SNP）位点的靶向A•T到G•C点突变。A•T到G•C的突变可能导致所需的氨基酸取代或可能干扰microRNA在目标区域的结合（Li et al., 2019）。Negishi等人（2019）报道了使用nSpCas9-NGv1（ABE7.10-nSpCas9-NGv1）开发的新型ABEs，并表明SpCas9-NGv1可以在水稻基因组中含有NG作为PAM的靶位点诱导A–G取代。

通过比较含TadA8e的ABE（ABE8e）与多顺反子tRNA-gRNA表达载体（PTG-ABE8e）和PTG-ABE7.10在异源四倍体班式烟草（Nicotiana benthamiana）中的瞬时转化和稳定转化，评价了ABE的A-G编辑效率。PTG-ABE8e的碱基编辑效率显著高于PTG-ABE7.10，表明ABE8e是N. benthamiana A-to-G转换的高效ABE，其高效的编辑效率可提高植物基因组修饰和遗传改良的精度（Z. Wang et al., 2021）。植物ABE系统极大地扩展了CRISPR-Cas9工具的应用，为植物基础研究和作物精准育种提供了可靠、高效的方法（R. Xu et al., 2016）。

先导编辑

先导编辑是一种尖端、精确的基因组编辑技术，它不需要供体DNA或DSBs，从而提高了效率，减少了意外编辑（图3a）（Anzalone et al., 2019, 2020; Gao, 2021; Zhu et al., 2020）。先导编辑由两部分组成：（1）Cas9（H840A）切口酶与工程逆转录酶（RT）融合的融合蛋白；（2）先导编辑向导RNA（pegRNA）是一种可编程RNA，与sgRNA融合到含有引物结合位点（PBS）上作为逆转录引物的逆转录模板。PE（先导编辑）融合酶与pegRNA连接，pegRNA指向目标DNA序列并编码所需的基因修饰。PE/pegRNA复合物结合到目标DNA并破坏含有PAM的链。得到的3'端与PBS杂交，然后使用pegRNA的RT模板启动包含所需编辑的新DNA的逆转录。具有所需编辑的单链将通过DNA修复侵入目标DNA并将编辑（图3a）。此外，PE2系统使用了RT并且PE3系统使用了额外的sgRNA来切割未编辑的链，这提高了编辑效率（Anzalone et al., 2019）。

图3：先导编辑和先导编辑衍生技术。

（a）先导编辑原理图。PE蛋白由nCas9结构域（橙色）和RT结构域（灰色）组成；PE蛋白和pegRNA（棕色）结合成PE/pegRNA复合物。PE/pegRNA复合物识别原间隔区和PAM，结合目标DNA，并在合成含有编辑的单链时去除PAM（红色）。含有编辑的3′-flap侵入目标DNA，而含有原始DNA的5′-fla被切除。DNA修复过程会产生编辑过的DNA。（b）PE与ePPE、pegRNA与epegRNA的结构差异。PE蛋白由nCas9结构域（橙色）和RT结构域（灰色）组成，而ePPE蛋白增加了一个VC蛋白（金色），并将RT优化为RTΔRNase H。pegRNA由间隔体、支架、RT模板和引物结合位点（RT + PBS）组成，而epegRNA在3'端添加了额外的结构化RNA，防止降解。（c）优化先导编辑：PE；PEE；PEmax；enpPE2和ePPE。enpPE2，增强型植物先导编辑；ePPE，工程植物先导编辑；nCas9，一种切口Cas9；PAM，原间隔序列临近基序；PE，先导编辑；pegRNA：先导编辑向导RNA；PPE，植物先导编辑；RT，逆转录酶。

与传统的依赖HDR的精确基因组编辑技术相比先导编辑具有优势，其提高了精确基因组编辑的效率和产品纯度（Anzalone et al., 2019）。先导编辑提高了编辑效率，同时减少了脱靶编辑、意外插入/删除突变和DNA损伤。该链通过逆转录直接合成；因此，它可以在没有任何供体DNA的情况下编辑基因。此外，新合成的链直接与缺口单链的一个位点形成3′-flap来侵入DNA，绕过DSB的形成。先导编辑是一种通用的基因编辑工具，能够整合4个碱基转移突变（A → G，G→A，C→T和T→C），8个碱基翻转突变（C→A，C→G，G→C，G→T，A→C，A→T，T→A和T→G），以及多达40个bp的插入和多达80个bp的缺失（Anzalone et al., 2019, 2022）。

植物先导编辑

植物先导编辑技术于2020年被开发出来，并应用于小麦和水稻的原生质体，证明了先导编辑技术可以应用于植物（Lin et al., 2020）。植物先导编辑通过密码子、启动子和编辑条件优化修饰植物的先导编辑器，从而实现水稻和小麦原生质体的点突变、插入和删除（图3c）。先导编辑水稻植株的再生率高达21.8%（Lin et al., 2020）。H. Li等人（2020）开发了一种可靠而有效的水稻基因组精确编辑方法，即使用先导编辑系统成功地产生了纯合和杂合稳定系，外源和内源基因都进行了所需的编辑。Tang等人（2020）开发了三种版本的植物先导编辑，用于精确编辑水稻中众多内源基因。使用PE2和PE3策略，SNPs和插入/删除突变已经成功地引入到这些位点。
植物先导编辑已经成功编辑了一些对作物育种有益的基因座，包括ALS、IPA和TB1（Butt et al., 2020）。先导编辑成功地在目标位点编辑了磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂ALS酶的OsALS，且效率为0.26%–2%。此外，通过先导编辑编辑OsTB1和OsIPA这两个控制侧分枝和减少非生产性分蘖数量的转录因子，从而获得产量性状（Butt et al., 2020）。

除了在水稻和小麦上，植物先导编辑还在其它植物上有应用。密码子和启动子的改变显著提高了番茄先导编辑的效率，达到了与水稻相当的水平（Lu et al., 2021）。Y. Y. Jiang等（2020）构建了ZmALS1和ZmALS2中W542L和S621I双突变pegRNA变体的先导编辑载体，展示了先导编辑在玉米中的应用。类似地，Biswas等人（2022）成功地在水稻、花生、鹰嘴豆和豇豆原生质体中编辑了一个突变GFP。

H. Li等人（2022）开发了三种替代先导编辑器（分别基于hygromycin Y46*、OsALSS627I和联合双代理系统），用于对内源基因（OsSPL14， OsDHDPS 和 OsNR2）进行先导编辑，显著提高了水稻稳定系的编辑效率。代理先导编辑系统使水稻先导编辑提高了编辑效率和多重精度。一种先导编辑文库介导的饱和诱变技术的建立，可用于植物筛选以增加氨基酸多样性。先导编辑结果显示，在OsACC1基因的6个保守位点，有16个氨基酸被取代，从而对芳基苯氧丙酸除草剂产生抗性（R. Xu et al., 2021）。

优化的先导编辑技术 工程pegRNA（epegRNA）策略

内切酶降解pegRNA 3′端，切除RT模板和PBS，降低编辑效率，可能对先导编辑系统产生影响。因此，为了提高它们的稳定性和防止3'端的降解，在pegRNAs的3′-末端引入了结构化的RNA基序，创建了epegRNA策略（图3b）（Nelson et al., 2022）。

epegRNAs在PBS的3'端有一个结构化的RNA基序，这可以防止pegRNA延伸部分的降解，以及随后形成的不具备编辑能力的PE复合物，从而竞争目标基因组位点。epegRNA在不增加脱靶编辑活性的情况下，将先导编辑效率提高了3–4倍（图3b）（Nelson et al., 2022）。Zou等人（2022）通过在pegRNAs的3'端添加8-bp连接子的两个结构不同的RNA基序（evopreQ1和mpknot），获得两个epegRNAs，并将其与nCas9-M-MLV和切口sgRNA结合，得到PPE3-evopreQ1和PPE3-mpknot系统，开发了一种优化的先导编辑系统。结果表明，在适当的高温处理下，PPE3-evopreQ1系统提高了水稻先导编辑效率（Zou et al., 2022）。

PE4, PE5, 和 PEmax

先导编辑受到DNA错配修复（MMR）的阻碍，它会促进意想不到的插入/删除突变副产物（P. J. Chen et al., 2021）。MutSα（MutSH2-MutSH6）或MutSβ（MutSH2-MutSH3）识别初始MMR中不匹配的碱基对，并与该区域结合。然后，MutLα（PMS2-MLH1）被MSH2招募，MSH2切断包含缺口的链。最后，参与MMR的外切核酸酶（称为EXO1）切除复合物，聚合酶δ生成一条新链以补偿切除，而密封缺口的DNA连接酶LIG1形成完整的DNA双链（P. J. Chen et al., 2021）。
通过在PE2和PE3系统中融合一个显性负性MMR蛋白（MLH1dn）来抑制MM从而建立PE4和PE5系统。与PE2和PE3相比，PE44和PE5的效率分别平均提高了7.7倍和2.0倍。此外，通过密码子优化的RT、SpCas9突变、核定位信号序列以及nCas9与RT之间的连接子来开发PEmax，进一步加强先导编辑（图3c）。
优化后的先导编辑系统PEmax架构（ePE3max和ePE5max）和epegRNA极大地提高了先导编辑效率，高效地生成了携带纯合子TAP-IVS突变EPSPS的抗草甘膦水稻植株（Y. Jiang et al., 2022）。

Dual-pegRNA策略

先前的研究表明，pegRNA的设计显著影响先导编辑器的效率（Anzalone et al., 2019; Lin et al., 2020; Liu et al., 2020）。双pegRNA策略被开发以用来优化先导编辑，该策略使用反式pegRNAs来编码每条DNA链同时正向和反向的相同编辑（NGG-pegRNA和CCN-pegRNA）（图4b）。植物中的双pegRNA策略可以通过优化PBS的熔融温度（Tm）来提高PE效率。此外，通过Tm定向的PBS长度设计与双pegRNA策略相结合，显著提高了先导编辑效率（Lin et al., 2021）。

增强型植物先导编辑2（enpPE2）

enpPE2系统含有多种优化策略，包括将PE结构更新为PEmax结构，以及在复合启动子的控制下用结构化基序表达epegRNA（图3c）。enpPE2在T0水稻中的编辑频率为64.58%–77.08%，远高于未修饰的pPE2。enpPE2系统是一个强大而可靠的工具，可以对植物基因组进行精确修饰（J. Li, Chen, et al.， 2022）。

TwinPE

TwinPE是先导编辑的一种修饰，在相似的编辑位点产生两个部分互补的pegRNAs（图4a）（Anzalone et al., 2022）。因此，靶基因将直接被具有所需编辑的双链取代，避免了单链入侵和MMR的DNA修复。TwinPE具有灵活的编辑姿态，既可以进行大尺度的基因删除，也可以进行小尺度的基因替换。用新合成的双链代替原有的双链进行删除和替换。TwinPE比先导编辑更有效，包含更少的意外插入/删除突变，并且由于pegRNA部分补体而略微延长含有edits的链（图4a）（Anzalone et al., 2022）。

图4：TwinPE系统和双pegRNA策略。

（a）在TwinPE策略中，反式的pegRNA在相似的编辑位点生成，它们与PE蛋白结合形成PE/pegRNA复合物。PE/pegRNA复合物切开靶DNA并合成互补3′-flap。含有edits的3′-flap侵入目标基因，含有原始DNA的5′-flap被切除。最后，通过DNA修复，edits被安装到目标DNA中。（b）设计和编辑TwinPE和dual-pegRN策略。edits用红线标出。TwinPE系统使用含有编辑的互补3′-flaps与目标DNA杂交，消除被切除的区域（虚线框），然后由DNA修复，产生编辑的DNA。双pegRNA策略包括一个含有小edits的3′-flap，该小edits侵入目标基因并通过DNA修复安装小edits。PE，先导编辑；pegRNA，先导编辑向导RNA。

噬菌体来源的整合酶Bxb1通过识别attB和attP在特定位点重组DNA，在重组区域的两个位点形成attL和attR。由于其强大的基因组编辑能力和低误差，TwinPE可以与Bxb1产生协同作用。在这种策略中，TwinPE在目标DNA中安装了一个38 bp的attB序列。然后，将带有attP序列的供体DNA通过Bxb1整合到目标DNA中，导致一个大的DNA序列插入（Anzalone et al., 2022）。

工程植物先导编辑（ePPE）

在RNA–DNA异源双链中，RT的核糖核酸酶H（RNase H）结构域可切割RNA链。RNase H的抑制或失活可减少pegRNA的降解，提高PE复合物的稳定性。病毒NC蛋白是一种影响许多RT相关功能的核酸伴侣蛋白。因此，Zong等人（2022）发现，删除RT RNase H结构域并添加病毒NC蛋白可使先导编辑效率显著提高约1.8–3.4倍（图3b，c）。这两种修饰协同地提高了细胞培养中不同内源性位点的碱基替换、缺失和插入效率，当耦合在ePPE中时，与原始PPE相比，平均提高了5.8倍。ePPE产生的水稻植株对除草剂磺酰脲和吡唑啉酮具有抗性，同时观察到编辑频率为11.3%，而使用PPE的编辑频率为2.1%（图3b,c）（Zong et al., 2022）。

结论

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑已成为植物基因功能分析和作物改良的有力工具。CBE、ABE、先导编辑等基因组编辑平台的发展，引领我们进入了植物基因组精确编辑的新时代。碱基编辑技术为创建点突变提供了一种非常高效和有效的方法，将在CRISPR衍生的基础研究和作物改良技术的发展中发挥关键作用。然而，目标碱基与PAM基序之间的距离限制了碱基编辑，无法安装预定义的翻转突变或插入/删除突变。先导编辑系统在提高植物基因组编辑精度方面具有巨大的潜力。先导编辑增加了CRISPR/Cas9对植物基因组进行精确修饰的范围和能力，以获得目标基因/等位基因替换和碱基转移/翻转。然而，先导编辑技术在应用中还存在编辑效率低、编辑窗口短等问题，这些需要进一步研究。通过改进引入的插入/删除突变的大小和减少副产物的编辑，先导编辑技术可以变得更加通用。植物先导编辑系统可以进一步优化，以用户定义的、具有成本效益的方式改善作物，而不会损害其他优良农艺性状。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/glr2.12034
引用格式：Xie, Y., Haq, S. I. U., Jiang, X., Zheng, D., Feng, N., Wang, W., He, J.-S., & Qiu, Q.-S. (2022). Plant genome editing: CRISPR, base editing, prime editing, and beyond. Grassland Research, 1(4), 234–243.
排版：张莉
统筹：王新宇
声明：该编译文章仅代表编译者对原文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。编译文章由GR团队制作仅供学术交流，转载须注明转载自Grassland Research微信公众号及编译作者信息。

期刊介绍

Grassland Research是我国草业科学领域第一本国际学术期刊，季刊，由中国草学会和兰州大学共同主办。该刊受中国科技期刊卓越计划高起点新刊项目支持，由国际出版集团John Wiley & Sons Australia, Ltd.提供出版及宣传服务，于2022年正式出版。

Grassland Research论文刊发范围广，综合性强。从分子到全球变化层面，全维度聚焦草业科学及其在人类可持续发展中的作用。期刊将刊登天然草原，栽培草地、草坪和生物能源作物，以及草地生态系统三大板块的基础性和应用性研究成果、综述、论点等类型的文章。优先考虑发表青年学者优秀研究成果，期待成为青年科学家喜爱的国际学术交流主阵地。

在创刊前三年，Grassland Research将免收版面费，以OA形式通过全球化出版平台Wiley Online Library出版。