文章信息

期刊名称：Grassland Research（草地研究）
中文标题：CRISPR/CAS9技术在牧草中的应用
第一作者：包琴燕（兰州大学/青岛农业大学）
通讯作者：王增裕（青岛农业大学）

编译者：侯蒙京 兰州大学草学博士

说明：该文仅代表编译者对论文的理解，如需参考和引用相关内容，请查阅原文。

摘要

基因组编辑是一种先进的基因改良工具，可在生物体基因组中移除、插入或替换核苷酸以诱导突变。CRISPR/Cas9（成簇的规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关联的蛋白9）是应用最广泛的基因组编辑工具，可精确修改基因组的特定序列。当前，利用CRISPR/Cas9对粮食作物遗传改良方面已经取得了重大进展。然而，在饲用作物中，CRISPR/Cas9的应用仍处于起步阶段，人们对它的了解和应用还很有限。本文回顾了目前在紫花苜蓿中建立和应用CRISPR/Cas9体系的研究进展；总结了CRISPR/Cas9在其他几种饲用豆科和禾本科作物中的应用，并探讨了CRISPR/Cas9在饲用作物遗传改良中的应用前景。

关键词：苜蓿，CRISPR/Cas9，牧草，牧草改良，豆科牧草，基因组编辑

引言

CRISPR/Cas9（成簇的规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关联的蛋白9）存在于细菌和古菌基因组的适应性免疫系统中，目前已发展成为一种高效的位点特异性基因组编辑技术。自2013年在拟南芥和本氏拟南芥中成功应用以来(Jiang et al., 2013; Mao et al., 2013)，CRISPR/Cas9引起了广泛的关注。相比于前两代基因组编辑技术—锌指核酸酶（ZFN）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs），CRISPR/Cas9的最大优势是简单、灵活、低成本且易于组装（(Wade, 2015; H. Zhu et al., 2020）。CRISPR/Cas9基因组编辑系统已广泛应用于粮食作物（如水稻、玉米、小麦）用以促进基础研究和改善农业成果。尽管基因组编辑技术在牧草中开展了一些应用，但相关进展仍然有限。

牧草和豆类作物在畜牧业和环境保护中发挥着重要作用。一些饲料品种也可以用作草坪草或生物能源作物。转基因技术已被用于改善多种牧草的农艺性状（Brummer & Wang, 2020; Gou et al., 2019; Liu, Aung, et al., 2018; Z. Y. Wang & Brummer, 2012）。通常来说，转基因技术需要将转基因稳定整合到植物基因组中，而基因组编辑不同于转基因技术，它允许产生靶向突变，安全性问题较少。本文总结了基因组编辑技术在牧草中的开发与利用，并讨论了利用该技术进行牧草改良的挑战和前景。

CRISPR/CAS9技术在牧草中的应用

CRISPR/CAS9体系在豆类饲草中的应用

CRISPR/Cas9系在苜蓿中的建立与应用

苜蓿（Medicago sativa L.）被誉为“牧草之王”，是世界上最重要的饲料作物之一（Du et al., 2021)。由于苜蓿是一种具有复杂基因组的专性异交（自交不亲和性）和同源四倍体物种，产生同源突变体一直是一项具有挑战性的任务，它限制了稳定优良品系的发展（Fu et al., 2015; Stritzler et al., 2022; Wolabu, Cong, et al., 2020）。因此，与其他主要作物相比，对四倍体苜蓿的生物技术研究受到限制。因此，有必要在紫花苜蓿中建立优化的CRISPR/Cas9介导的诱变体系。

本研究最初尝试利用单个gRNA-CRISPR/Cas9系统编辑苜蓿八氢番茄红素去饱和酶（MsPDS）基因。我们构建了两种载体，其中gRNA由MsU6启动子驱动，Cas9由双CaMV35S启动子驱动。经农杆菌介导的转化后，共再生出 962 株幼苗。在培养阶段，一个胼胝体和两个再生芽表现出白化表型。然而，随后的测序分析表明，愈伤组织和再生芽没有任何突变事件（缺失改变）。结果表明，单个gRNA-CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿无效。

我们推测了这一结果的两个主要原因。首先，苜蓿基因组很复杂，因为苜蓿中的大多数基因有多个等位基因（四个复制）。因此，单个gRNA构建体可能很难同时敲除所有等位基因。其次，驱动Cas9的启动子可能不够强，其他因素也可能影响CRISPR/Cas9的效率。基于上述分析，基于上述分析，我们通过多聚核tRNA-gRNA方法组装了三种不同的多重gRNA-CRISPR/Cas9载体（图1）（Wolabu, Cong, et al.，2020）。

在载体I中，CaMV35S启动子用于驱动Cas9的表达；在载体II中，gRNA支架区域通过点突变进行修改；在载体III中，Cas9由拟南芥泛素启动子（AtUBQ10）驱动而非CaMV35S启动子驱动。载体I、II和III靶向苜蓿持绿性状（MsSGR）基因，在黑暗诱导或自然衰老过程中，MsSGR 下调的紫花苜蓿叶绿素有明显的滞留（Zhou et al.，2011）。我们发现，载体 III 的诱变效率可达 49%（图2）。值得注意的是，在黑暗/遮光处理下，可以清楚地观察到突变体表型。此外，与先前开发的RNAi-SGR转基因系相比，CRISPR/Cas9介导的突变系（MsSGR-21，MsSGR-53，MsSGR-18和MsSGR-36）在黑暗处理10天后具有更一致的深绿色外观和更多的叶绿素滞留（图2、3）。为了进一步验证苜蓿中多重gRNA-CRISPR/Cas9系统稳定的诱变效率，我们靶向了紫花苜蓿中的其他基因。载体III的基因型效率在44~75%之间，比单一gRNA系的效率高18~30倍。更重要的是，在 T0 代获得了四个等位基因复制完全敲除的突变体，表型效率在37~68%之间。对于自交不亲和的多年生牧草来说，在T0代产生完全基因敲除突变体可以避免杂交和近交抑制 (Wolabu, Cong, et al., 2020)。

其他研究也在苜蓿中测试了CRISPR/Cas9系。Gao 等人（2018）试图通过靶向鳞片状启动子结合蛋白样 9（SPL9）基因，测试CRISSPR/Cas9 在苜蓿基因组中的有效性。尽管液滴数字聚合酶链式反应（PCR）、内切酶消化和桑格测序等鉴定方法显示SPL9基因发生了突变，但总体基因型突变率仅为2.2%，且再生的SPL9植株未表现出明显的视觉表型。Chen等（2020）构建了pMs-CRISPR/Cas9载体，其中hSpCas9的表达受CaMV35S启动子控制，单导RNA（sgRNA）由MtU6聚合酶Ⅲ启动子驱动。本研究选择了MsPDS 基因来测试这种 CRISPR/Cas9系统的效率；两个突变体（0.23%）表现出预期的白化表型。之后，使用相同的载体构建物破坏了苜蓿的Cys(2)His(2)锌指转录因子基因PALM1（MsPAML1），该基因是参与复叶形态发生的关键基因。只有1.72%的突变体叶形变成了掌状五叶（Chen et al., 2020）。

CRISPR技术已被用于苜蓿的性状改造。Singer等人（2022）利用二元pKSE401载体验证了MsSPL8（Gou et al., 2018）在苜蓿中的功能。在该载体中，拟南芥U6聚合酶Ⅲ启动子驱动sgRNAs的表达，CaMV35S启动子驱动玉米密码子优化Cas9的表达。即使存在多达两个野生型 MsSPL8等位基因，所产生的基因型也会出现形态改变，包括提早开花、叶片变小、植株高度降低和生物量减少（Singer et al., 2022）。通过对紫花苜蓿的 MsGA3ox1基因进行CRISPR编辑，Zheng等人（2022）在 T0 代获得了三个携带全部四个等位基因突变的品系。突变体表现出半矮小和匍匐的表型。Ye 等人（2022）设计了两个sgRNAs，用于靶向 Medicago sativa No Pollen 1（MsNP1）基因。结果获得了四个等位基因都被编辑的植株，而且没有可见的花粉粒。最终，以雄性不育调节因子MsNP1为目标的反向遗传策略有效地在紫花苜蓿中建立了基因雄性不育系统。通过对 PHOSPHATE2（PHO2）基因的定向诱变，米勒等人（2022）培育出了磷酸盐高积累苜蓿植株。通过编辑NOD26基因，获得了在氮限制条件下具有异常结节、萎蔫和生长受损的苜蓿植株（Frare et al., 2022）。

Bottero等人（2022）利用胞苷碱基编辑器（CBEs）的碱基编辑系统编辑了紫花苜蓿中的乙酰乳酸合成酶（ALS1和ALS2）基因。利用含有CRISPR/Cas9介导的碱基编辑器和针对紫花苜蓿ALS1和ALS2基因的gRNA的pXSE901BG质粒，生成了150个独立的转基因品系。经过筛选，分别在ALS1和ALS2基因的核苷酸位点530和545发现了17个和9个具有预期的单C到T碱基转换的编辑事件。有趣的是，经过编辑的植株显示出对甲磺隆、碘钾磺隆钠盐和甲咪唑烟酸的耐受性。因此，碱基编辑器工具可以作为苜蓿基因组编辑的替代选择。

总之，CRISPR/Cas9系统已在紫花苜蓿中成功建立（表1）。通过使用AtUBQ10启动子而不是CaMV35S启动子来优化Cas9的表达，可以显著提高基因组编辑效率（Wolabu、Cong et al., 2020）。使用的gRNA数量也是影响CRISPR/Cas9效率的一个主要因素；多个 gRNA 的编辑效率高于单个gRNA（Wolabu、Cong et al., 2020）。检测方法也会影响突变效率的计算。苜蓿中提到的检测方法包括液滴数字PCR、限制性酶消化和测序。通过 CRISPR/Cas9在T0代获得同源突变体解决了自交不亲和的问题，并为快速鉴定基因的功能及其在苜蓿遗传改良中的应用提供了机会。

CRISPR/Cas9 体系在蒺藜苜蓿中的应用

蒺藜苜蓿因其生长周期短、基因组体积小、属二倍体基因组、为自交繁殖性质、有完整的基因组序列以及是突变文库而被认为是豆科遗传学和基因组学的模式植物（Chai et al., 2021; Jozefkowicz et al., 2021; Tadege et al., 2008; C. Wang et al., 2022; Zhao et al., 2021; Zhou et al., 2019）。蒺藜苜蓿也在澳大利亚作为饲料作物种植。Michno等人（2015）用大豆密码子优化的MDC32/GmCas9系统靶向GUS基因，并将其转化为毛根。GUS基因在PCR-酶消化试验中被破坏，证实了大豆密码子优化的Cas9可以在蒺藜苜蓿中产生突变。Meng等人（2017）使用二元载体PFGC5941-Cas9靶向MtPDS基因。他们报告说，在农杆菌介导的转化后，再生植物的突变效率为10.35%。Curtin等人（2017）使用大豆GmUbi启动子驱动Cas9表达；PHO2样基因和PEN3样基因的突变效率达到50~70%。然而，当使用相同的构建体靶向小RNA加工基因（MtHen1）时，突变效率因可重复性问题而降低（Curtin et al., 2018）。这一结果表明，蒺藜苜蓿也需要可重复的基因组编辑工具。为了评估具有不同启动子（9S、EC35-1、AMGE2和UBQ3）的 CRISPR/Cas10体系在蒺藜苜蓿中的效率，我们使用一组 CRISPR/Cas9载体来靶向 MtPDS（Wolabu，Park et al., 2020）。结果表明，UBQ10驱动Cas9载体的编辑效率最高，在愈伤组织和再生植株中的诱变效率分别为36%和70%。通过载体优化提高了毛竹的突变效率，主要是通过改变驱动Cas9表达的启动子；结果为建立和优化其他饲料基因编辑系统提供了基本考虑因素（Wolabu, Park et al., 2020）。通过利用毛茸茸的根系，H. Zhang, Cao等人（2020）使用MtPDS基因生成纯合/双等位基因的蒺藜苜蓿幼苗。

基因组编辑已被用于研究蒺藜苜蓿的结瘤和代谢途径。呼吸爆发氧化酶同源物（Rboh）的敲除提供了宿主植物利用先天免疫调节根瘤菌在M. truncatula共生细胞中定植的直接证据（Yuet al., 2018）。对C端编码肽（CEP）基因家族成员的多基因编辑证实，MtCEP1、2 和 12 在控制侧根数量和结瘤中发挥冗余作用（F. Zhu et al., 2021）。通过敲除CYP93E2，证明了高价值化合物的代谢工程；突变体不会在植物组织中产生大豆苷元，而是将代谢通量转向生产有价值的溶血苷元（Confalonieri et al., 2021）。

红三叶草中异黄酮合酶基因的编辑
红三叶草（Trifolium pratense）是一种豆科饲草植物，营养价值高，适口性好。它适用于放牧和干草生产，也作为伴生作物播种。异黄酮合酶（IFS1）基因编码异黄酮生物合成中的关键酶，被CRISPR/Cas9敲除（Dinkins et al, 2021）。得到半合突变株并杂交以获得纯合IFS1突变株。突变植物中某些异黄酮（福莫诺丁，生物香素A和染料木黄酮）的水平显着降低。用根瘤菌接种野生型和突变植物表明，这些异黄酮在结瘤中没有重要作用（Dinkins et al.. 2021）。

百脉根共生固氮相关基因的编辑
百脉根是一种多年生草本植物，具有很高的饲用价值。它常被用作饲料，也可用于水土保持。通共生受体样蛋白激酶（SYMRK）基因通过使用载体靶向，其中LjU6-1启动子用于驱动gRNA，CaMV35S启动子用于驱动Cas9（L. Wang et al., 2016）。在 20 株T0转基因植株中约有35%的诱变效率，其中两株含有双倍同源突变。进一步设计了两个 sgRNA，分别针对三个同源的腿血红蛋白基因座（LjLb1、LjLb2 和 LjLb3）。在70株毛根转基因中，有20株表现出白色结瘤，每个转基因毛根中至少有两个LjLbs被破坏。与CaMV35S启动子相比，结瘤特异性百脉根Lb2 启动子也能有效驱动 Cas9 在毛细根结瘤基因编辑中的表达。通过使用两种sgRNA进行稳定转化，获得了LjLbs的三重突变基因敲除。对三种Lbs稳定突变体的分析表明，Lbs在结瘤中的作用是相加的，缺失Lbs会导致结瘤早期衰老（L. Wang et al., 2019）。

CRISPR/Cas9体系在草地中的应用

柳枝稷（Panicum virgatum）原产于北美，是一种公认的生物能源作物（Park et al., 2017）。它还可用于放牧、水土保持、防风固沙和盐碱地改良。柳枝稷是一种异型杂交C4物种，由低地生态型（四倍体）和高地生态型（八倍体）组成（Casler et al., 2011）。柳枝稷茎中的木质化会对其生物燃料生产和饲料质量产生负面影响（Fu et al., 2011; S. Liu et al., 2017）。4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）是合成木质素单体的关键酶；Pv4CL3 基因是低地栽培品种木质素含量改造的靶向基因（Park et al., 2017）。经CRISPR/Cas9 编辑的植株木质素含量显著降低，降幅在8~30%之间，而木质素聚合物结构未见变化。突变株产生了更多的葡萄糖和木糖。本研究在柳枝稷中成功建立了 CRISPR/Cas9 体系，使得突变效率达到10%（Park et al., 2017）。Liu, Merrick等人（2018）编辑了与柳枝稷生长发育有关的横向分支负调控因子（teosinte branched 1，tb1）基因和磷酸甘油酸突变酶（PGM）基因，进而得到使柳枝稷的分蘖数量增加、产量潜力更高的突变体。此外，Y. Liu 等人（2020）利用基因编辑系统验证了Pvtb1b负向调控开关草的分蘖。

黑麦草中LpDMC1突变的产生
多年生黑麦草（Lolium perenne）和多花黑麦草（Lolium multiflorum）广泛生长在温带气候，它们是异交、二倍体物种。Y. Zhang, Ran等人（2020）在黑麦草中建立了CRISPR/Cas9系统，并利用该技术编辑关键的减数分裂重组酶破坏减数分裂cDNA1（DMC1）基因。在多花黑麦草和多年生黑麦草中，获得了8株T0代LpDMC1的敲除突变体；LpDMC1基因的空突变体表现出完全雄性不育和严重的减数分裂紊乱，这表明 DMC1基因在黑麦草的减数分裂中起着关键作用。

CRISPR/Cas9在狗尾草中的优化
狗尾草（S. viridis）是一种二倍体、自花授粉的C4禾本科植物，其生长期短、基因组小，被用作C4物种和生物能源作物的单子叶模式植物。在自然系统中，炸荚对种子的传播和繁殖至关重要。然而，过度炸荚对作物生产是不利的，因为它会导致种子减产。Mamidi 等人（2020）利用 CRISPR/Cas9技术编辑了少炸荚1（Less Shattering1, Les1），并将腺嘌呤插入到编号 ME034v 的转录本的149位点。最终获得了种子炸荚率降低的Svles1突变体。Weiss 等人（2020）发现了一种基于原生质体的瞬时分析方法，用于快速测试和优化病毒核糖体中的CRISPR/Cas9系统。原生质体中的突变效率从46~82%不等。当Cas9与外切酶Trex2结合使用时，序列的缺失从 PAM的5ʹ端变为两侧对称分布，缺失片段的长度增加，几乎没有插入。进一步的研究发现，Trex2增加了微结构介导的末端连接的发生率。该研究表明，多重CRISPR/Cas9-Trex2系统可显著提高编辑效率，并可编辑两个紧密相连的基因。

挑战和展望

尽管CRISPR/Cas9体系已被迅速用于饲草物种的基因组编辑（表1），但与这些物种相关的特定挑战仍然存在。首先，许多广泛种植的牧草品种都会发生杂交，因此有必要在T0代获得完全的基因敲除，以便观察表型。否则，需要多轮杂交才能观察到表型。其次，除了杂交外，许多物种都是多倍体，因此要完全敲除目标基因的所有拷贝就更加复杂。使用多重gRNA和经优化的Cas9启动子可以部分解决上述两个难题，至少在苜蓿属是如此（Wolabu, Cong et al., 2020；Wolabu, Park, 2020）。第三，具有饲用价值的物种多达几十种，而高效、可重复的基因转化系统能只针对少数物种建立。如果没有高效、可重复的转化系统，就不可能通过CRISPR/Cas9产生足够数量的突变体。第四，设计或筛选编辑率高的gRNA可能是另一个挑战。虽然有很多网站可以设计gRNA，但特定gRNA的实际效果必须通过实验来检验；牧草的情况更为复杂，因为只有几个牧草物种的基因组序列信息可用。

通过基因组编辑植物，可以在杂交后代中分离转基因元件。与传统的转基因下调方法（如RNAi）相比，这具有极大的优势。分离后，突变可能只包含一个或几个核苷酸；这种突变与自然界中经常发生的突变非常相似。因此，基因组编辑不应像转基因技术那样受到严格的监管。

为充分发挥基因组编辑的潜力，应像监管传统品种一样监管基因组编辑衍生的品种。基因组编辑技术的监管对其成功应用至关重要。2016年4月，美国农业部公布了对 "监管物品调查函 "的答复，美国农业部表示不会对 CRISPR/Cas9生产的植物材料进行监管，从而为美国利用基因组编辑技术进行植物改良铺平了道路。而欧洲的情况有所不同。2018 年 7 月，欧洲最高法院裁定，基因编辑作物应受到与传统转基因生物同样严格的监管。对于基因组编辑材料的发布监管，许多国家尚未公布明确的政策。由于饲草是动物食用的，而不是人类直接食用的，因此，让基因组编辑饲草顺利进入市场是合理的。

总而言之，基因组编辑为快速改良牧草和豆科植物提供了一个非常强大的工具。通过与传统育种相结合，可在改良品种开发方面取得重大进展，为生产者提供新的农艺性状。

图表

图1 多重基因组编辑载体示意图。

(a) Cas9 由 CaMV35S 启动子驱动的多重载体I的图谱。(b) 多路载体Ⅱ的图谱，其中gRNA支架被修改；载体Ⅱ的gRNA 5′由TTTTT到TTGTT的点突变组成，以取消连续Ts的暂停效应。(c)Cas9由AtUBQ10启动子驱动的复用载体Ⅲ的图谱。

图2 紫花苜蓿保绿突变体（MsSGR）的突变效率和表型。

(a) 单个和多个gRNA-CRISPR/Cas9载体（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）在 MsSGR 基因编辑中的突变效率。(b) 黑暗处理诱导的苜蓿 MsSGR 基因敲除突变体（CRISPR）和基因敲除（RNAi）品系的表型。在黑暗处理试验中产生的CRISPR/Cas9突变体（MsSGR-18、MsSGR-21、MsSGR-36 和 MsSGR-53）表现出强烈的持绿表型。MsSGR-RNAi转基因品系在黑暗处理10天后叶片呈浅绿色。Null#02和Null#11是RNAi株系的空载体对照。CRISPR/Cas9，簇状规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9；RNAi，RNA干预。

图3 不同时间点（0、5、10 天）暗处理下苜蓿MsSGR突变体离体叶片的叶绿素含量（叶绿素a+b）。

图中，蓝色柱表示鲜叶收获时（黑暗处理0天）的总叶绿素含量，红色柱表示黑暗处理第5天的总叶绿素含量，绿色柱表示黑暗处理第10天的总叶绿素含量。EV2：空载体对照；MsSGR：紫花苜蓿持绿。

表1 CRISPR/Cas9对牧草基因组的编辑

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/glr2.12036
引用格式：Bao, Q., Wolabu, T. W., Zhang, Q., Zhang, T., Liu, Z., Sun, J., & Wang, Z.Y. (2022). Application of CRISPR/Cas9 technology in forages. Grassland Research, 1(4), 244–251.

排版：张莉
统筹：王新宇
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期刊介绍

Grassland Research是我国草业科学领域第一本国际学术期刊，季刊，由中国草学会和兰州大学共同主办。该刊受中国科技期刊卓越计划高起点新刊项目支持，由国际出版集团John Wiley & Sons Australia, Ltd.提供出版及宣传服务，于2022年正式出版。

Grassland Research论文刊发范围广，综合性强。从分子到全球变化层面，全维度聚焦草业科学及其在人类可持续发展中的作用。期刊将刊登天然草原，栽培草地、草坪和生物能源作物，以及草地生态系统三大板块的基础性和应用性研究成果、综述、论点等类型的文章。优先考虑发表青年学者优秀研究成果，期待成为青年科学家喜爱的国际学术交流主阵地。

在创刊前三年，Grassland Research将免收版面费，以OA形式通过全球化出版平台Wiley Online Library出版。