原创  元素和同位素地球化学 2024-04-25 06:38 甘肃

2024年4月23日，国际权威期刊《自然·协议》（Nature·Protocol）上发布了——“电喷雾离子化-Orbitrap质谱（Electrospray Ionization-Orbitrap Mass Spectrometry，ESI-Orbitrap MS）精确测定同位素丰度的指南”。来自美国科罗拉多大学博尔德分校Neubauer​等利用ESI-Orbitrap MS技术，实现了对碳、氢、氮、氧和硫等元素稳定同位素在分子内部丰度的前所未有的精准与准确测定，为环境生物学、代谢研究、食品及药物溯源以及气候历史等领域提供了深度洞察。长期以来，尽管自然界中广泛存在这些元素的稳定同位素，但其相对丰度并非处处相同。这种差异源于酶催化的动力学同位素效应以及其他物理原理，如热力学平衡过程。同位素比值的变化犹如生物地球化学过程的指纹，揭示了环境污染、生态食物网关系、代谢紊乱乃至地球历史包括气候变化的独特信息。然而，传统的同位素比质谱法（IRMS）技术在获取诸如位点特异性同位素丰度等分子内信息时仍面临挑战。文章介绍了两种操作流程。第一种方法为初学者提供了一步到位的指导，通过直接注入方式对未标记极性溶质进行多元素、分子内及位点特异性稳定同位素分析（Position specific isotope analysis，PSIA）。研究人员使用一种广泛应用的标准溶液，定量分析了三氟乙酸和模型肽MRFA产生的离子化中间体（immonium ions）的“同位素复合体”（isotopocules）。第二种方法则以硝酸盐作为简单模型，采用流动注射程序，使得对无机氧酸根中天然存在的多样同位素特征得以便捷访问。每种方法耗时2至3小时，仅需具备通用质谱技术的专业知识即可完成。​a至d分别代表：丙氨酸(a)、精氨酸(b)、甲硫氨酸(c)和苯丙氨酸(d)。这些图表显示了分析过程中相对标准误差的下降趋势(以点状表示)，该趋势遵循理论上的散射噪声极限(以线条表示)。各个同位素复合体之间的偏移量基于它们的相对丰度，其中(13C/12C)具有最高的同位素丰度比，而(2H/1H)具有最低的同位素丰度比。通过开发并优化了适用于ESI-Orbitrap MS的同位素比质谱数据提取与处理软件，确保了工作流程的高效与可靠性。这一协议不仅适用于易于软离子化的多种分析物，如代谢物、多肽、药物及环境污染物，而且有望推动生物学众多领域内的分子内同位素研究。为了验证方法的有效性和精确度，展示了三氟乙酸（TFA）和MRFA肽衍生的immonium离子同位素簇的shot-noise图。这些图表对比了不同自动增益控制（AGC）目标设置和轨道阱分辨率下的实验数据与理论散粒噪声（shot-noise）极限，揭示了最优参数设置下同位素比测量的高精度。在相同时间内，采用最优设置的数据点（相对标准误差）显著低于次优设置，且其趋势紧密跟随理论极限曲线。这项ESI-Orbitrap MS同位素分析指南的发布，无疑为科研人员提供了一个权威操作指南，助力他们利用优化的Orbitrap IRMS数据处理工具开展精确的同位素丰度研究。随着该方法的广泛应用，科学家们将能以前所未有的精细度揭示自然界中稳定同位素分布的微妙变化，深化对生物地球化学过程、生命代谢机制、环境污染源追溯以及地球气候演变等复杂问题的理解，为相关领域的科学研究开启新的篇章。

图1. 利用ESI-Orbitrap M技术质谱图与同位素比值的精确度。(A) 硫酸盐(HSO4−)、硝酸盐(NO3−)和磷酸盐离子(H2PO4−)的代表性质谱。对应A+1(绿色)、A+2(蓝色)的质量区域被放大。通过四极杆剔除基峰来收集低丰度硫酸盐A+4离子的数据。(B)来自代表性数据集的硫酸盐34SHSO4同分异构体与基峰的比值（Neubauer 等 2020）

（文章伦理声明和利益冲突：文章作者们声明存在以下竞争性财务利益关系。A.H. 和 D.J. 是赛默飞世尔科技德国公司的员工，该公司生产orbitrap质谱仪以及气体（源）同位素比质谱仪。N.K. 是明斯特大学的一名博士研究生，并且以博士生及研发科学家的身份在赛默飞世尔科技德国公司从事基于Orbitrap的同位素比测量工作，为其撰写博士学位论文。C.N. 是赛默飞世尔科技公司聘请的独立科学顾问，针对基于电喷雾离子源-Orbitrap质谱仪进行的同位素比测量提供咨询并获取报酬。）

更多请阅读原文：

Kantnerová, K., Kuhlbusch, N., Juchelka, D., Hilkert, A., Kopf, S., & Neubauer, C. (2024). A guide to precise measurements of isotope abundance by ESI-Orbitrap MS. Nature Protocols.https://doi.org/10.1038/s41596-024-00981-5

 “揭秘Orbitrap质谱仪：从离子化到同位素比值计算的全流程解析”

 图1：Cross-section of the C-trap and Orbitrap analyzer（https://doi.org/10.1021/ac4001223）

Orbitrap质谱仪是一种利用电场来捕获和分析离子的设备。其核心部分是一个由中心电极和两个半圆形外电极组成的质量分析器。在操作过程中，会在中心电极上逐渐增加直流高压，从而在Orbitrap内部产生一个特殊的几何结构静电场。这个电场会使得离子沿着类似于电子轨道的路径绕中心电极旋转。离子的旋转频率与其质荷比（m/z）有关，即离子的质量与电荷的比值。通过精确控制电场和测量离子的旋转周期或频率，可以确定离子的质荷比，进而推断出其质量。在同位素分析中，Orbitrap质谱仪能够分辨和测量不同同位素的质量差异。这是因为它具有高分辨率和质量精度，能够区分非常接近的质量值。这对于分析化学领域来说是非常重要的，因为同位素之间的质量差异往往很小，而且同位素模式（isotopic pattern）可以为化合物的识别和定量提供关键信息。其测试同位素比值的基本原理可以概述为以下几个关键步骤：

1. 离子化：同位素比值分析通常始于样品的离子化过程。在进行同位素比值测试时，样品（如有机分子、无机盐等）首先通过一个合适的离子源被转化为气态离子。常用的离子源包括电喷雾电离（ESI）、基质辅助激光解吸电离（MALDI）或化学电离（CI），具体取决于样品性质和实验需求。2. 离子传输与分离：生成的离子随后被引入到Orbitrap质谱仪的核心部分——Orbitrap分析器。这是一个由一对双曲面电极构成的超高真空腔室，其中心有一个环形电极。离子在射频电压作用下沿轨道阱内呈三维螺旋状轨道运动。3. Orbitrap分析： 在Orbitrap中，离子的运动轨迹不仅取决于它们的质量-to-charge ratio (m/z)，还受到其初始动能和电荷状态的影响。由于同位素离子具有几乎相同的动能和电荷状态，它们在磁场中的轨道周期主要由其m/z决定。不同同位素离子（例如，12C与13C的两种同位素形式的同一分子离子）会形成不同的轨道周期，从而实现基于m/z的分离。4. 检测与信号处理：当离子在轨道阱内振荡时，它们会在中心检测器上产生微弱的交变电流信号。这些信号经过数字化和傅里叶变换处理后，转化为质谱图。在质谱图上，每个离子的m/z值对应一个特定的峰，峰强度与该离子的相对丰度成正比。对于同位素分析，关注的是同一分子离子的不同同位素峰，其强度比例直接反映了样品中相应同位素的比值。5. 数据解析与比值计算：分析软件对获得的质谱数据进行解析，提取出目标分子离子及其同位素峰。通过比较同位素峰的强度，可以计算出同位素比值，如δ13C。这个比值是同位素地球化学、生物标志物研究、环境科学等领域的重要参数。总结来说，Orbitrap质谱仪利用其独特的离子存储和检测机制，通过精确测量离子在磁场中的轨道周期来区分同位素离子，并通过对同位素峰强度的定量分析，精确测定样品中的同位素比值。这种技术因其出色的分辨率和稳定性，成为同位素比值分析的理想工具之一。（完）

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