Section.01

思路 1：以药找靶

——天然药物的靶点确定

以药找靶，即已知药物具有活性，寻找药物作用靶点，其核心思路是利用已知的药物或活性分子作为探针，从复杂的生物体系中钓取其直接作用的蛋白质靶点。这种方法在阐明老药新用机制、探索天然产物作用靶点等研究领域中至关重要。

计算机预测

计算机预测通常利用数据挖掘、药效团模型匹配、正反分子对接技术和药物-靶标相似性算法等，识别小分子可能作用的靶点。下面是一些常用的靶标预测网站，有需可参考喔~

表 1. 常用的靶标预测网站。

『分子对接 + 药-靶相似性』

反向分子对接 (Reverse Docking)：将小分子药物对一个包含数千甚至数万个蛋白质结构的数据库进行全局“对接”，根据计算出的结合亲和力排序，预测最可能的结合靶点。

• 早期的方法主要依靠结构相似性匹配，而最新的进展是利用如 HelixFold3 或 AlphaFold3 等结构预测模型，在统一的框架内同时模拟蛋白折叠和小分子对接，显著提升了预测的准确性。

例如，研究者通过设置对接及相似性比较两条平行路径共同实现 B. pinnatum 提取物化合物 1 (槲皮素糖苷) 的潜在靶点确定^[1]。

在对接路径上，研究者通过 PDB 数据库构建了一个超过 9K 个蛋白的靶点配体数据库，使用 MarvinSketch 构建槲皮素糖苷的三维结构。为简化筛选流程，首先使用槲皮素糖苷的母核槲皮素与超过 9000 个蛋白靶点的配体数据库进行粗筛，以快速得到能足够容纳槲皮素糖苷口的潜在蛋白。随后选取粗筛 Top50 的潜在作用靶点与槲皮素糖苷进行逐一对接筛选，发现其中 TOP5 的靶点中有两个与抗炎抗氧化相关的关键 PDE 家族成员 PDE10A2 和 PDE4B，其中 PDE4B 抑制剂因其抗炎作用而广为人知。

表 2. 计算机反向找靶排名前五的靶点信息^[1]。

实验找靶

实验找靶常用的方法主要有 DARTS、SPR 和 Pulldown 技术等，详见往期：以药找靶: 探索活性分子发挥效应的 "神秘" 机制。二者结合使用往往能取得最佳效果。

Section.02

思路 2：基于疾病临床样本

——BACE1 靶点的发现

道理很简单，对比疾病人群的临床样本与正常对照，筛选出疾病发生发展过程中表达水平或功能发生显著改变的关键生物分子，如蛋白质、差异基因等。这些生物分子可以作为后续药物研究的潜在疾病靶点。

下面我们结合发表于 Science Translational Medicine，题为 “A genome-wide in vivo CRISPR activation screen identifies BACE1 as a therapeutic vulnerability of lung cancer brain metastasis” 的文献，一起来感受下该方法在科研中的实际应用^[2]。

Step 1. 样本处理：疾病模型的建立

临床样本并不是拿过来就能直接用的！

拿癌症举例，通常是采集患者的原代瘤体样本，也就是从患者体内直接切除下来的新鲜组织，接着提取出肿瘤细胞，种植到免疫缺陷的小鼠体内，让肿瘤在小鼠体内繁衍生长。——即：患者来源异种移植瘤 (PDX) 。然后再从小鼠体内的肿瘤中提取细胞，在实验室的器皿中培养，最终形成了用来做科研实验的稳定细胞系。该细胞系能够高度还原患者原本的肿瘤特征，是科研研究和测试新药的宝贵材料^[3]。

图 1. 肺癌 TRACERx 研究中 PDX 模型构建和扩增的研究方案示意图^[4]。

Step 2. CRISPR 全基因组筛选

CRISPR 全基因组筛选是一种高通量功能基因组学技术，利用 CRISPR/Cas 系统 (通常为 CRISPR-Cas9) 的基因编辑功能实现基因敲除、敲入、激活和干扰。将CRISPR系统应用于构建基因组文库——构建全基因组 CRISPR 敲除 (CRISPRko)、干扰 (CRISPRi) 和激活 (CRISPRa) 文库——进行高通量筛选，是疾病 (尤其是肿瘤) 靶基因研究的主要策略，广泛应用于包括细胞系、小鼠和斑马鱼在内的多种模型中。

CRISPR 文库多使用混合文库形式进行高通量筛选。其操作流程主要包括设计合成 sgRNA 文库、Cas9 细胞系的构建、表型选择、高通量测序、生物信息学分析、候选基因和脱靶效应的验证等 (图 3)^[4]。

图 2. CRISPR/Cas9 高通量筛选流程^[4]。

CRISPR/Cas9 技术可实现全基因组范围的高通量筛选，其针对每个基因设计 3~10 条 sgRNA，利用芯片一次合成数万条覆盖整个基因组的 sgRNA 库，经慢病毒包装后以低感染复数感染宿主细胞，在适当的筛选条件下测试筛选前后 sgRNA 的丰度变化，进而找出候选基因。

『sgRNA 文库的设计与合成』

该文献案例中，作者使用的是“人 Calabrese 全基因组 CRISPRa 文库”，筛选能够增强原位肺腺癌 (LUAD) 肿瘤脑转移的基因。

——肿瘤转移通常不是因为某个基因丢失了，而是因为某些原本不该表达的基因被异常激活、高表达，从而赋予了癌细胞侵袭和跨越屏障的能力。

• Calabrese 文库通过 CRISPRa 技术，强行上调人体 18,000 多个编码基因的表达。赋予癌细胞“新的超能力”： 比如，某个肺癌细胞平时不具备穿透血脑屏障的能力，但文库恰好激活了它体内的某个基质金属蛋白酶基因，该细胞就突然获得了“通关”能力。

『Cas9 细胞系的构建』

dCas9-VP64 融合蛋白，需要细胞系预表达。该文献案例中，作者将 CRUK0748-XCL 细胞系改造为 CRUK0748-XCL-GLD 细胞，使其表达催化失活的 dCas9 与 VP64 融合的蛋白 (用于激活基因转录) 、GFP 和荧光素酶 (用于体内追踪)。

『慢病毒载体的构建及感染』

作者将 CRUK0748-XCL-GLD 细胞以 0.3 的 MOI 进行转染，并筛选至最终文库覆盖度为 500 倍。随后经开胸手术，将转染文库的细胞直接接种到 30 只 NSG 小鼠的肺部 (图 3) 。

图 3. 体内 CRISPR 激活筛选示意图^[5]。

『高通量测序及分析』

通过生物发光成像追踪肿瘤负荷，终点对肺和脑组织进行 sgRNA 测序并比较其富集程度，结合 TCGA 与 DepMap 数据库筛选出 12 个候选基因，其中 BACE1 的 sgRNA 在大脑中富集超过 150 倍。

『验证候选基因』

随后通过独立 sgRNA 验证、组织微阵列及临床样本分析发现，BACE1 表达增加会增强 LUAD 的骨髓转移 (图 4) 。此外，在 BACE1 过表达的肺肿瘤小鼠的肝脏和骨骼中，转移负荷均有所增加。

图 4. 使用两种独立的 sgRNA 激活 BACE1 表达可增加脑转移肿瘤负荷^[5]。

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思路 3：老药新用

——基于化合物库筛选

【文献案例】Targeting ATR signaling in sarcoma with homologous recombination deficiency

【使用文库】MCE 定制库，包含 71 种药物，涵盖用于探索性研究和临床批准的靶向药物，以及临床上用于肉瘤患者治疗的一线和二线化疗药物^[6]。

通过构建包含 71 种靶向及化疗药物的化合物库，在患者来源的肉瘤 3D 细胞模型中开展中通量药物筛选 (基于 AUC 与 IC₅₀ 综合评估) ，成功鉴定出以 ATR、CHK1、WEE1 抑制剂为代表的 DNA 损伤应答 (DDR) 通路关键活性化合物。进一步通过联合用药筛选发现 ATR 抑制剂 (如 Camonsertib) 与 PARP 抑制剂或化疗药物 (如 Doxorubicin) 具有显著协同效应。

产品推荐

计算机反向找靶

反向找靶，也被称为靶点筛选、反向找靶、靶点垂钓等，是新药研发和老药新用的关键环节，目的是识别药物发挥调控作用的核心生物靶点，为新药开发和现有药物的再利用提供重要方向。

分子动力学模拟

一种计算机模拟方法，用于研究分子体系的运动和相互作用、预测分子体系的行为和结构性质。通过计算机分子模拟，能够在分子水平上理解生物大分子的运动与生物功能、蛋白-小分子之间相互作用机理。

分子对接

一种基于计算模拟的药物分子与生物大分子（如蛋白质、核酸等）相互作用预测技术。其核心原理包括锁钥模型和诱导契合学说，分别描述配体-受体的刚性匹配和动态构象调整过程。

虚拟筛选

虚拟筛选是基于小分子数据库开展的活性化合物筛选。利用小分子化合物与药物靶标间的分子对接运算，虚拟筛选可快速从几十至上百万分子中，遴选出具有成药性的活性化合物，大大降低实验筛选化合物数量，缩短研究周期，降低药物研发的成本。

AI 药物筛选

人工智能药物筛选是一种结合 AI 技术与计算化学的高通量筛选方法，广泛应用于蛋白结构预测、新药研发和分子设计与优化等领域。

参考文献

[1] Lourenço E M G, et al. Identification of a selective PDE4B inhibitor from Bryophyllum pinnatum by target fishing study and in vitro evaluation of quercetin 3-O-α-L-arabinopyranosyl-(1→ 2)-O-α-L-rhamnopyranoside[J]. Frontiers in pharmacology, 2020, 10: 1582.

[2] Chafe S C, et al. A genome-wide in vivo CRISPR activation screen identifies BACE1 as a therapeutic vulnerability of lung cancer brain metastasis[J]. Science translational medicine, 2025, 17(805): eadu2459.

[3] Olson B, et al. Mouse Models for Cancer Immunotherapy Research. Cancer Discov. 2018 Nov;8(11):1358-1365.

[4] Hynds RE, et al. Representation of genomic intratumor heterogeneity in multi-region non-small cell lung cancer patient-derived xenograft models. Nat Commun. 2024 May 31;15(1):4653.

[5] Lei T, et al. [Development and applications of CRISPR/Cas9 library screening technology in cancer research]. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2019 Nov 30;39(11):1381-1386. Chinese. 

[6] Planas-Paz L, et al. Targeting ATR signaling in sarcoma with homologous recombination deficiency. Cancer Lett. 2026 Apr 1;642:218300. 

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