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细胞不贴壁？原因可能在这！

首先，要给大家介绍一下细胞外基质！

细胞外基质(ECM)是组织中由细胞分泌的非细胞部分，是一个错综复杂的蛋白质 3D 网状结构，为细胞提供物理支撑并参与信号传递。

图 1.细胞外基质^[1]。

然而,一些细胞在体外培养时不容易分泌 ECM，因此很难粘附在培养载体表面，培养就很困难。

——通常会添加ECM 来帮助细胞有效贴附到培养皿或其他载体上，模拟细胞与 ECM 之间的相互作用，这些 ECM 就被称为附着因子。

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常用附着因子？看看这几种！

附着因子包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白等，它们通过与细胞表面的受体结合，构建起可提供结构支持并促进细胞通信的微环境，从而维持细胞的正常稳态与调控^[2]。

1. 纤连蛋白

纤连蛋白(Fibronectin, FN)是位于细胞表面和血浆的大分子蛋白质，它能与细胞外基质成分(如糖胺多糖、蛋白多糖和胶原蛋白)及细胞表面受体结合，在胚胎发育、伤口愈合等生理过程中起重要作用。

2. 层粘连蛋白

层粘连蛋白(Laminin)主要存在于基膜的透明层，紧贴细胞基底表面，在神经生物学领域应用广泛。

功能方面，层粘连蛋白不仅参与调控细胞粘附、伸展、迁移和增殖等基本生物学过程，还能促进细胞分化与功能修饰，并显著刺激神经突触生长^[3][4]。

3. 胶原蛋白

胶原蛋白(Collagen)是重要生物高分子，是动物结缔组织主要成分，也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的功能性蛋白质。

目前已发现 20 多种不同类型胶原蛋白，它们功能各异：纤维状胶原蛋白(如 I、II、III、V 和 XI 型)主要在结缔组织中；原纤维相关胶原蛋白(如 IX 和 XII 型)负责连接原纤维并介导其与细胞外基质相互作用；网络形成型胶原蛋白(如 IV 和 VII 型)是基底层主要部分^[5][6]。

在细胞培养领域，因其优异生物相容性，胶原蛋白被广泛用于内皮细胞、肌肉细胞、肝细胞等多种细胞的体外培养体系。

4. 明胶

明胶(Gelatin)是一种由胶原蛋白部分水解得到的大分子蛋白质，主要成分为甘氨酸、脯氨酸与羟脯氨酸^[7]。

它常被用作培养板或培养皿的包被材料，可显著提升胚胎干细胞、睾丸细胞等难贴壁细胞的附着效果，并为神经上皮样结构等复杂细胞模型提供理想的生长环境。

5. 玻连蛋白

玻连蛋白(Vitronectin, VN)是由 478 个氨基酸构成的糖蛋白，主要存在于血液和细胞外基质中。

玻连蛋白能与糖胺多糖及蛋白多糖相互作用，充当细胞黏附分子。同时作为细胞溶解补体途径的抑制剂，在凝血过程中发挥重要生理调节作用^[8]。

表1.不同附着因子适配的细胞类型。

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附着因子？有点好用！

有科研小伙伴在 FN-HAMA 的合成过程中，添加了购自 Med Chem Express 浓度为 50 μg/ml 的纤连蛋白(HY-P70593)，效果嘎嘎好！

检测 FN - HAMA 水凝胶对细胞黏附行为的调控作用，结果显示：与未添加 FN 的 HAMA 水凝胶、FN 物理掺入的 FN/HAMA 水凝胶相比，FN - HAMA 水凝胶可显著促进细胞黏附(图 2)，这与预期一致，原因在于 FN 对细胞黏附有优异支持作用^[9]。

图 2. ADSCs 细胞黏附的定量分析^[9]。

当然！纤连蛋白作为主要的细胞外基质蛋白之一，已被研究证实可显著影响干细胞的特性(如形态、黏附、分化)^[9]。

Patcharapa Tragoonlugkana 等的研究证实，采用纤连蛋白或玻连蛋白涂层的容器培养脂肪来源干细胞(ADSCs)，可显著优化培养效果^[10]。

相较于常规培养(对照组)，FN/VN 涂层能显著增强 ADSCs 的粘附与增殖能力：ADSCs 接种 12 小时后，FN 涂层组与 VN 涂层组的细胞粘附率均显著高于对照组(图 3A)，凸显了附着因子对细胞贴壁的强力促进作用；通过群体倍增时间(PDT)评估细胞周期活性发现，在 P5、P7 及 P10 连续传代过程中，FN 与 VN 涂层组的 PDT 值均明显低于对照组(图 3B)，进一步证实附着因子可通过加速细胞周期进程显著提升增殖效率。

图 3.FN 和 VN 涂层对 ADSCs 粘附与增殖的影响^[10]。

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实验指南？难不住的！

操作流程^[10]

『实验准备』

取一支附着因子储液缓慢解冻，使用无菌 PBS(pH 7.2–7.4)或无血清培养基将其稀释至最佳工作浓度。

『加液包被』

根据器皿规格加入足量包被液，确保其完全覆盖器皿底部。轻轻晃动器皿，使液体均匀分布且无气泡残留。

『孵育』

常规采用 4℃ 过夜孵育，吸附效果最均匀，适用于干细胞、原代细胞；若需快速实验，可选择 37℃ 培养箱孵育 1–2 小时。

『洗涤』

吸除包被液，用无菌 PBS 缓冲液轻柔洗涤 3 次，以去除未结合的残留蛋白。

『封闭』

加入 1% BSA，于 37℃ 孵育 1 小时进行封闭处理，随后用 PBS 洗涤 3 次，以阻断非特异性结合位点。

『接种细胞』

培养状态良好的细胞经胰酶消化后，用无血清培养基重悬，按适宜接种密度接种至已完成包被的孔板中。

『细胞培养』

37℃ 孵育至预设时间点，随后用 PBS 轻柔润洗 3 次，以去除未粘附的细胞。

结果检测

体外测定粘附细胞数量时，比色法与荧光法是两大主流技术选择，二者原理各异，且各有其适配的应用场景。

『比色法』

『原理』：结晶紫阳离子可与细胞 DNA 的磷酸基团发生静电结合，使细胞呈现紫色^[10]。

『操作』：采用4% 多聚甲醛固定 15 分钟→0.1% 结晶紫染色→Triton/SDS 裂解→通过酶标仪分别读取 550 nm或 595 nm处的吸光度值，吸光度越高，说明粘附的细胞数量越多。

『特点』：该方法成本较低、重复性良好，适用于批量样本的检测。

『荧光法』

『原理』：活细胞内的酯酶可将无荧光的钙黄绿素-AM 水解为发强绿光的钙黄绿素^[11]。

『操作』：洗去未粘附细胞→每孔加入 200 μL PBS →使用荧光显微镜或酶标仪检测荧光→计算“贴壁细胞荧光值/总细胞荧光值”的比值，以此确认粘附细胞的数量。

参考文献

[1] Surat P. Structure and Function of Proteoglycans. News-Medical (Life Sciences). 2019.

[2] Mogha P, et al. Extracellular matrix protein gelatin provides higher expansion, reduces size heterogeneity, and maintains cell stiffness in a long-term culture of mesenchymal stem cells. Tissue Cell. 2023;80:101969.

[3] Holmberg J, et al. Laminin-211 in skeletal muscle function. Cell Adh Migr. 2013;7(1):111-121.

[4] Singh B, et al. Human pathogens utilize host extracellular matrix proteins laminin and collagen for adhesion and invasion of the host. FEMS Microbiol Rev. 2012;36(6):1122-1180.

[5] Shahrajabian MH, et al. Mechanism of Action of Collagen and Epidermal Growth Factor: A Review on Theory and Research Methods. Mini Rev Med Chem. 2024;24(4):453-477.

[6] Holmes DF, et al. Collagen Fibril Assembly and Function. Curr Top Dev Biol. 2018;130:107-142.

[7] Ahmad MI, et al. Collagen and gelatin: Structure, properties, and applications in food industry. Int J Biol Macromol. 2024;254(Pt 3):128037.

[8] Pellegrini A, et al. Recruitment of Vitronectin by Bacterial Pathogens: A Comprehensive Overview. Microorganisms. 2024;12(7):1385. Published 2024 Jul 8.

[9] Wu X, et al. Stem cell niche-inspired microcarriers with ADSCs encapsulation for diabetic wound treatment. Bioact Mater. 2023 Mar 3;26:159-168.

[10] Lazarovici P, et al. Cell-Based Adhesion Assays for Isolation of Snake Venom's Integrin Antagonists. Methods Mol Biol. 2020;2068:205-223.

[11] Liu P, et al. Inflammatory Smooth Muscle Cells Induce Endothelial Cell Alterations to Influence Cerebral Aneurysm Progression via Regulation of Integrin and VEGF Expression. Cell Transplant. 2019;28(6):713-722.