本文介绍的是华南师范大学生物光子学研究院覃欢副研究员课题组通过同时监测辐射和非辐射弛豫定量示踪生物探针的研究，发表在《Journal of Innovative Optical Health Sciences》期刊2023年第4期。

Quantitative tracing of bioprobes by simultaneously monitoring radiative and nonradiative relaxations

通过同时监测辐射和非辐射弛豫定量示踪生物探针

Hongjiang Chen, Xiaoyu Tang, Guangshuai Nie, Zhen Wang, Jia Hu, Jun Hu, and Huan Qin

研究背景

生物荧光探针具有高灵敏度和高光谱选择性的特点，被广泛应用于生物医学研究中。通过对生物荧光探针的示踪，科研人员在研究蛋白定位表达和动态变化、肿瘤诊断、神经元钙信号检测等方面取得了令人振奋的成果。目前，大部分活体荧光成像技术是通过监测荧光变化示踪生物探针。然而，由于荧光淬灭效应和生物组织对光子的吸收与散射，荧光的测量结果容易受到化学/生理环境（如 pH 值、离子、蛋白质、溶剂极性等）变化的影响。这些客观因素会对量化探针造成极大的不准确性。设计高量子效率且不受环境干扰的荧光探针是可能的解决方案。但这些先决条件也严重限制了生物荧光探针的选择。

生物荧光探针被光激发后主要有两个退激发途径：以荧光形式的辐射退激发和以热耗散形式的非辐射退激发。辐射与非辐射退激发同时发生，且两者之间存在竞争关系，此消彼长。鉴于这两种退激发途径的互补性，如果已知总的能量信号变化，则可以从一个途径推断出另一个途径的信号变化。反之，如果两个通道的能量都能被完全捕获，总的能量信号能更准确地反映探针的数量。因此，同时监测辐射和非辐射跃迁的探测系统与只监测其中退激发方式的系统相比，更能全面地评估探针的行为。此外，由于辐射跃迁和非辐射跃迁之间的平衡容易受到环境因素的影响，这种方法还可以提供有关探针所处生物微环境的信息。

由于技术上的困难，非辐射退激发的测量通常不会与荧光同时进行。当激发为短脉冲（如纳秒）激光时，非辐射退激发产生的热量可以通过热弹性膨胀产生超声波——这就是光声效应。本文技术方法的核心是采用同一脉冲激光激发，随后通过同时监测辐射弛豫（荧光）与非辐射弛豫（光声信号），从而实现更准确的生物探针定量追踪。

内容简介

生物探针的荧光测量容易受到生物组织吸收、散射以及生物体内化学/生理环境（如 pH 值、离子、蛋白质、溶剂极性等）的影响。本文针对生物荧光探针难以在体内准确定量的问题，提出了同时监测辐射弛豫（荧光）与非辐射弛豫（光声信号），实现对生物探针的定量表征的方法。这种方法可从更广泛的能量谱中捕捉信息，从而提高生物探针量化的准确度，还能提供探针所处微环境的额外信息。探针所处的微环境往往会影响两种能量转换形式之间的平衡。这项工作首先分析了假设的基本机制。然后，分别通过对非辐射能量过程的光声信号和辐射能量过程的荧光信号进行同步测量，检验了其实际可行性。结果表明，对探针能量去激发进行系统评估，可提高复杂环境中生物探针的定量精度。

图文导读

1.原理和方法

图1：（a）Jablonski图显示光声和荧光信号的互补性。（b）光声荧光互补成像系统示意图。可以同时检测在单个激发过程中产生的荧光和光声信号。PL成像：荧光成像；PA成像：光声成像

Alexander Jablonski于20世纪30年代首次提出的Jablonski图（图1（a））清晰地展示了在同一激发过程中非辐射跃迁和辐射跃迁的竞争机制。探针分子吸收光能后，电子从基态（S0）跃迁到激发态（S1），然后从激发态向基态进行辐射或非辐射跃迁。辐射跃迁过程包括荧光、延迟荧光或磷光发射。一般来说，延迟荧光和磷光所占的比例很小，可以忽略不计。非辐射跃迁过程包括振动弛豫、内部转换、系统间跨越，这些过程大多以热的形式释放能量，这是光声效应的能量来源。

当生物荧光探针被纳秒短脉冲激光激发后，检测到的探针荧光强度FI的计算公式（1）如下：

其中，A是荧光检测和总荧光能量之间的系统传递函数，同一系统中且设置相同时为常数。F是激光脉冲能量密度（J/cm2）。ε(λ)是探针在激发波长处的摩尔吸收系数。C是探针的浓度。η是探针的荧光量子产率。在本研究中，我们假设环境因素与探针相互作用不产生探针光吸收光谱的移动。

为了消除荧光量子产率η对探针浓度评估的影响，引入中间系数M，M=AFε(λ)。公式（1）变为FI=MCη，M可以从已知浓度C0和该浓度对应的荧光强度滴定得到。η0是探针在C0时的荧光量子产率。因此M的计算如下：

其中C0是已知浓度。η0是探针在已知浓度下的荧光量子产率，FI0是探针在已知浓度下的荧光强度。

如果激发光是一个纳秒脉冲，那么在非辐射跃迁过程中产生的热量就会通过热弹性膨胀产生超声热弹性波。光声振幅P的计算公式（2）如下：

这里，B是系统光声通道的传递函数。F是光通量（J/cm2）。ε(λ)是探针在激发波长处的摩尔吸收系数。Γ是Gruneisen系数（室温下为常数）。为了简化公式（2），引入了中间系数N，其定义为N=BFε(λ)Γ，因此公式（2）变为P=NC(1-η)。因此，N的计算如下：

其中C0是已知浓度。η0是探针在已知浓度下的荧光量子产率，P0是探针在已知浓度下的光声振幅。

鉴于探针的荧光和光声在同一激发过程中具有互补性，假设检测到的荧光和光声信号来自同一区域，且不存在其他物理和化学损耗，则可利用两个通道的能量之和对探针进行量化。根据公式（1）、（2），探针定量的计算为：

在理想情况下，同一种探针在同一次激发下产生的荧光和光声信号可用于探针的定量，而不受荧光量子产率波动的影响。

为了测试同时监测辐射和非辐射信号技术的可行性，我们开发了一套光声-荧光成像（PA-FLI）系统（图1（b））。纳秒脉冲激光被扩束后通过物镜重新聚焦到样品上。样品中产生的光声信号由物镜下方的超声换能器接收，而荧光则同时由物镜收集，并通过二向色镜和滤光片用光电倍增管（PMT）进行检测。硅光电二极管监测和校准激发光的强度。采集点位置和相应数据采集由PA-FLI系统控制。

2.结果

图2：用钙探针（Rhod-2）标记的神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）的光声（a）和荧光（b）图像

为了展示PA-FLI系统搭建成功，我们进行了测试实验。用钙探针（Rhod-2）标记神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）。然后用PA-FLI系统同时对标记的神经母细胞瘤细胞进行光声、荧光成像。实验结果表明，我们成功搭建了具有相同激励源的PA-FLI系统互补成像系统，可以同时获得光声、荧光图像，可用于实验研究（图2）。

图3：有干扰的动态实验验证定量测量的可靠性。研究了具有代表性的染料（Atto680）在不同环境因素(色氨酸为列)影响下的光声和荧光特性。（a）Atto 680在不同色氨酸浓度中的荧光光谱。光声-荧光成像（PA-FLI）系统在不同色氨酸浓度的水溶液中检测到的Atto 680荧光（b）和光声（c）信号强度。（d）根据同一激发过程（680 nm激发）中的荧光和光声信号强度，利用公式（3）计算的Atto 680浓度值。数据显示为平均值±SD（n=3）

在同一脉冲激光激发下，PA-FLI系统同时检测Atto 680的荧光和光声信号。结果显示，随着荧光淬灭剂色氨酸浓度的增加，Atto 680的荧光信号减少，而光声信号相应增加（图3（b）和3（c））。在这种特殊情况下，探针的荧光或光声强度因荧光淬灭而发生了急剧变化。显然，仅靠荧光或光声信号均无法准确反映探针的实际数量。然而，通过将同时获得的荧光和光声信号与公式（3）结合起来，可以实现更精确地对探针进行定量，而不受荧光淬灭效率的影响（图3（d））。

图4：（a）不同浓度Atto 680（0.25-8μM）的荧光（红点）和光声（蓝三角）信号。根据公式（3）对Atto 680进行量化（绿色方框）。误差条代表三次测量的标准偏差。（b）不同浓度Atto 680（0.25-8μM）的吸收光谱。（c）不同浓度Atto 680（0.25-8μM）在680 nm波长处的光学吸收值。数据为平均值±SD(n=3)

荧光淬灭通常发生在荧光探针浓度过高时。图4（a）显示，由于荧光淬灭现象，荧光强度与Atto 680浓度不再呈线性关系。光声信号强度与探针浓度之间不是线性关系。因此，当探针聚集到一定浓度并发生荧光淬灭时，单一的光声或荧光信号不能准确反映探针的浓度。由于光声信号和荧光信号之间存在互补关系，此消彼长。利用公式（3），结合光声信号和荧光信号强度，仍可对探针进行量化（图4（a），绿色方框）。如果荧光的淬灭效应不会导致探针的吸收光谱发生变化，那么就有可能通过测量探针的光吸收来对其进行量化（图4（a）和4（b））。然而，要准确、无创地测量研究对象在体内的光吸收量是非常困难的。PA-FLI系统可在同一激发过程中同时测量光声和荧光信号，有可能是量化体内探针浓度的一种更为精确的方法。

PA-FLI系统可同时测量生物探针的光声和荧光信号，具有定量追踪生物荧光探针的潜力。然而，目前我们的方法尚未考虑探针光谱移动，也没有考虑实际光传输或声传输损耗对测量精度的影响。我们希望在未来的研究中将光谱移动、传导过程中的损耗作为参数加入到模型中。本文介绍的方法目前只适用于点激发模式。点扫描模式限制了PA-FLI系统的成像速度。目前的系统仍采用机械扫描模式，成像速度仍相对较慢，难以实现对感兴趣区域的实时扫描。对快速移动或扩散的探针的追踪仍然存在限制。要将我们的方法应用于小动物成像，还需要进一步提高成像速度，并进一步考虑荧光和超声波传播损耗对测量结果的影响。

通讯作者简介

覃欢，华南师范大学生物光子学研究院副研究员，硕士生导师。致力于生物医学光声、微波热声成像技术与应用基础研究，以通讯/第一作者发表SCI论文33篇，其中国际1区期刊16篇。获授权光声、微波热声成像技术发明专利6项，工作被Nat. Rev. Clin. Oncol.等高度评价。主持国家自然基金委青年项目1项、面上项目2项，主持广东省自然科学基金2项、广州市科技项目2项；作为核心成员参与国家重大仪器项目1项。获广东省生物物理学会青年创新奖。