近日，华中师范大学青年教师吴亚、徐旭东教授与华中科技大学余龙江教授团队在Synthetic and Systems Biotechnology发表了题为"Engineering ω-transaminase for efficient dihydroxyacetone transamination in serinol biosynthesis starting from methanol"的研究论文。该研究针对丝氨醇生物合成中ω-转氨酶催化效率低的核心瓶颈，构建了以甲醇为碳源的体外多酶级联体系（MSP），通过"ALF"扫描（利用不同体积的疏水氨基酸逐一替换关键位点残基）与结构导向工程策略，获得比活性提升6.3倍的三突变体M3，并结合热力学平衡驱动策略，最终实现7小时内由甲醇生成43.86 mM丝氨醇，碳原子收率达87.7%，为以 C1 底物为起点合成氨基醇类化合物提供了可借鉴的设计思路。

研究背景

丝氨醇（serinol，2-氨基-1,3-丙二醇）是医药与精细化学品领域重要的非手性含氮中间体，广泛用于抗生素、抗肿瘤药物和免疫抑制剂等的合成。然而，传统化学合成路线存在步骤复杂、能耗高、副产物多等问题，而微生物发酵法则受限于产物毒性与代谢调控网络，难以实现高效生产。近年来，体外多酶级联体系因其反应条件温和、副产物少、无需细胞生长维持等优势，逐渐成为高附加值化学品绿色合成的重要替代策略。甲醇作为最简单的C1底物，来源丰富、价格低廉，若能以甲醇为起始底物，通过多酶级联直接合成丝氨醇，将具有重要的应用前景。

然而，该路线的关键限速步骤——ω-转氨酶（ω-TA）催化二羟基丙酮（DHA）生成丝氨醇——存在催化效率低、高底物浓度抑制等问题。野生型ω-TA对DHA的比活性有限，且反应的热力学平衡不利于产物生成，严重制约了整个级联体系的效率。因此，如何通过蛋白质工程提升ω-TA对DHA的催化活性，并通过反应工程策略打破热力学限制，是实现甲醇到丝氨醇高效生物转化的关键挑战。

研究成果

1.体外级联体系设计与路径筛选

为实现从单碳底物高效合成丝氨醇，研究首先对DHA到丝氨醇的两条转化路径进行了比较：一种是传统的先磷酸化再转氨的多步级联途径，另一条是利用ω-转氨酶（ω-TA）直接一步胺化的路径。在相同DHA条件下，前者的最高转化率为28.1%，而后者可达54%，因此选用路径2构建体外级联模块。四种常用ω-TA（Cv-ωTA、Bm-ωTA、Mv-ωTA、Vf-ωTA）筛选结果显示Cv-ωTA对DHA具有最高胺化活性，L-Ala为最优氨基供体。进一步优化反应条件后确定最适温度为30℃、pH为8.0、L-Ala为150 mM。然而当DHA浓度升至100 mM时，Cv-ωTA转化率下降至33.1%，表明高底物浓度下的动力学瓶颈限制了体系催化效率（图1）。

图1. 甲醇起始的体外多酶级联体系（MSP）构建路线；模块1与模块2的总体设计示意；两条DHA生成丝氨醇转化路径的比较；ω-转氨酶筛选结果

图2. 分子动力学模拟揭示Cv-ωTA对DHA催化活性低下的机制：野生型酶活性口袋过于宽敞，底物结合松散，亲核进攻距离过远

2. ALF扫描与适应度景观解析揭示突变协同机制

为突破Cv-ωTA催化瓶颈，研究首先基于分子动力学模拟，揭示了野生型酶口袋过于宽敞，导致底物DHA结合松散、亲核进攻距离过远的机制缺陷（图2）。据此，团队应用“ALF”扫描策略，利用不同体积的疏水氨基酸对10个关键位点进行空间重塑，筛选出5个高活性突变。在此基础上，研究构建了涵盖所有32种可能组合的完整适应度景观，旨在探究突变间的相互影响并确定最优进化轨迹。分析结果揭示了突变间强烈的非加性相互作用：简单的五突变叠加反而导致活性下降。进化路径分析进一步证实，核心突变Y153F与Y168F之间存在典型的Reciprocal Sign Epistasis——即二者虽单独有益，但组合时会相互干扰导致活性受损；而C418F的引入产生了关键的补偿效应，成功“挽救”了活性。这一发现表明，只有遵循特定的突变引入顺序，才能避开进化路径上的“性能悬崖”。最终，三突变体M3（Y153F/Y168F/C418F）凭借这种独特的协同效应成功规避了“活性陷阱”，实现比活性较野生型提升至6.3倍的性能提升。

应用测试显示，在30–50 mM DHA条件下转化率均高于90%，在100 mM条件下仍达72.3%。机理分析表明，M3的活性腔体体积由野生型的353 Å3缩小至315 Å3，这种紧凑的空间构型有效限制了底物的随机热运动，并屏蔽了溶剂分子的不利干扰。这促使DHA在口袋内通过增强的疏水作用维持了3–4个稳定的氢键连接（野生型仅1–2个）。伞形采样进一步证实，M3显著缩短了PMP–DHA的进攻距离，并将Bürgi–Dunitz角调整至更接近理想取向（~109°），使预反应构象的占比大幅提高（图3-4）。

图3. Cv-ωTA关键位点ALF扫描所得单点突变体活性筛选；多点组合突变体的适应度景观分析；最优三突变体M3（Y153F/Y168F/C418F）的确定

图4. M3与野生型Cv-ωTA的活性腔体体积对比；伞形采样揭示的预反应构象自由能面与Bürgi–Dunitz角变化

3. 热力学平衡驱动与模块串联实现全流程转化

为突破ω-TA反应的热力学限制，研究引入丙酮酸去除/循环模块：一类为LDH模块，将丙酮酸转化为乳酸；另一类为AlaDH模块，通过胺化循环再生L-Ala。其中LDH/FDH模块对丝氨醇转化的驱动效果最显著，在100 mM DHA条件下转化率可达87.4%。在此基础上，研究进一步优化了各酶用量与辅因子浓度，确定了模块2的最优组合，使DHA在4 h内转化为96 mM丝氨醇（图5）。

图5. LDH/FDH与AlaDH/GDH丙酮酸去除/循环模块对转氨平衡的推动作用；不同丙酮酸去除/循环系统的丝氨醇转化率比较

模块1由Mr-AOX与甲醛缩合酶FLS-M9组成，通过优化酶比例与反应条件，在150 mM甲醇底物条件下4 h可获得46.2 mM DHA，达理论收率的92.3%。考虑到甲醇及甲醛对ω-TA具有抑制效应，研究采用两步模式实现模块串联：模块1独立反应至DHA充分生成后，经超滤去除酶蛋白，再加入模块2继续反应。最终，该串联体系在7 h内由150 mM甲醇生成43.86 mM丝氨醇，碳原子转化率87.7%（图6）。

图6. 模块1与模块2的优化结果；两模块串联实现甲醇→丝氨醇的全流程转化曲线

总结与展望

综上所述，本研究通过模块化体外级联体系设计、Cv-ωTA的结构导向工程以及热力学平衡驱动策略，成功构建了以甲醇为碳源的丝氨醇高效合成平台。通过分子动力学模拟与ALF扫描策略，团队筛选出比活性提升6.3倍的最优突变体M3，并借助适应度景观分析揭示了突变间的协同效应与进化规律。结合丙酮酸去除模块与两步串联反应策略，最终实现了87.7%的碳原子收率。该研究不仅为丝氨醇的绿色生物合成提供了高效途径，也为体外多酶级联体系的模块化设计与酶工程协同优化提供了方法论参考。

原文信息

Engineering ω-transaminase for efficient dihydroxyacetone transamination in serinol biosynthesis starting from methanol. 

Ya Wu, Chonghao Guo, Lizhen Deng, Derui Zhang, Yutong Bie, Yuxin He, Gen Lu, Shewei Hu, Ruiqi Zeng, Zeyang Li, Xudong Xu, Longjiang Yu

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.synbio.2025.11.004

Synthetic and Systems Biotechnology是高质量国际开放获取期刊，创刊2016年。期刊覆盖合成生物学、系统生物学以及生物医药等领域。期刊现已被SCIE、EMBASE、PubMed Central、Scopus、CSCD等重要数据库收录。

• 2025 Impact Factor: 4.8; 5-Year Impact Factor: 5.2

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