编译：小范儿，编辑：小菌菌、江舜尧。

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1 PiBAC:一种来自猪肠道的培养细菌资源

从猪肠道培养细菌一直较少，主要集中在病原体或益生菌菌株，很少努力在其他共生微生物。因此，我们从猪肠道中分离出约1100株细菌纯培养物。根据MALDI生物分型和16S rRNA基因序列，共选择代表40个科的110种的117个菌株，并提供9个门，以提供最大的物种水平覆盖率，由于不同的生长和代谢特征或分离来源，六种物种增加多个菌株。图1总结110个入选品种的多样性及其在猪肠道内的发生情况，补充数据1提供详细的元数据列表(如来源、登录号、基因组特征、培养条件等)。从1346份样本中检测出91种猪的16S rRNA基因扩增子，阳性率为10%，表明其存在于猪肠道菌群的优势菌群中。17种菌株的流行率>为50%，相对丰度>为0.5%，表明它们是猪肠道微生物组的关键成员(图1)。为所有117个菌株（包括两个封闭的基因组）生成基因组，用于分类学描述，功能分析（包括抗微生物抗性基因的出现），生物分子鉴定以及最小细菌菌群的预测（请参见下文）。所有菌株均保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ）。已创建链接到元数据数据库BacDive25的特定列表，允许用户快速查询集合（www.dsmz.de/pibac）。

图1 猪肠内细菌收集物种（PiBAC）。

2 收集的样品中发现新的物种

根据MALDI谱、16S rRNA基因分析和基因组分类，38株菌株代表 新分类群。在38个新分类群中，Sodaliphilus pleomorphus是新发现的Muribaculaceae(拟杆菌门，拟杆菌目)家族中的第一个猪分离株。基于16S rRNA基因的系统发育和系统基因组分析(图2a)均显示Sodaliphilus的分离状态，在严格的厌氧条件下，Sodaliphilus生长非常缓慢，可以形成长丝状细胞(图2a)。另一个有趣的分离物，Bullifex porci，是螺旋体门，螺旋体科的一个新属，虽然该门的成员通常呈螺旋状，但分离物的细胞形态为球形到球形(图2b)。在不同渗透压的介质中观察到生长，但球形细胞的形状没有明显变化。由于之前发表的四种球形Sphaerochaeta 的物种被报道有类似的特征(其中三种有可用的基因组)，我们搜索猪圆环菌科和螺旋体科的基因组，寻找涉及细胞形态和分裂、肽聚糖合成和细胞壁形成的基因，rodA和mreC基因在球形Sphaerochaeta中均不存在，Bullifex: RodA是一种肽聚糖聚合酶，当它被敲除时，会导致对细胞伸长和体直径失去控制，而细胞形状蛋白MreC是棒状细胞形成的关键(图2c)。有趣的是，只有B. porci andSphaerochaeta缺乏参与细胞骨架环形成的mreB基因，导致细胞坚硬。在细菌二次分裂中形成分裂体(或隔膜环)的保守蛋白之间，B. porci不存在ftsQ和ftsX(图2c)。据报道，这两个基因在具有异常细胞分裂模式的Planctomycetes 物种的基因组中也不存在。关于肽聚糖的生物合成，虽然murA-G、murJ和mraY基因存在于所有研究的基因组中，但Sphaerochaeta和B. porci中没有青霉素结合蛋白1a、2和C的同源基因(图2c)。总之，这些研究突出B.porci的特殊细胞结构。这一新物种的细胞生物学需要进一步的研究(如细胞分裂的机制)。

图2 收集的样品中发现新的物种。

3 追求新的细菌功能

由于特殊的细菌代谢产物对于微生物-微生物和微生物-宿主相互作用的重要性，通过生物信息学方法分析所有38个新型生物分类群的基因组，了解生物合成基因簇（BGC）的存在。38个菌株中的32株鉴定出64个推定的BGC，它们编码各种天然产物的生物合成系统，如萜烯，芳基聚酮，β-内酯，非核糖体肽（NRPs）以及核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPPs）（图3a）。对于原核生物而言，在这些新的类群中BGC的总数相当低，但与公开的基因组相比，类似半乳糖肽的BGC（32个阳性菌株中的24个）显着富集（BLAST搜索后细菌中的流行率<1％）使用下面提到的原型SCIFF序列基序针对NCBI nr数据库）。半乳糖形成具有特征性的分子内硫-α-碳硫醚键的一类RiPP。无论分离株的系统发育如何，相应前体肽的c端氨基酸序列高度保守：它们都具有最初在梭状芽孢杆菌中定义的SCIFF(45个残基中的6个半胱氨酸)序列基序。但是，该序列与之前鉴定为subtilosin A, thurincin H, sporulation killing factor A (Skf-A),thuricin CD (Trn-alpha and -beta), and ruminococcin (RumC) 的编码半乳糖的BGC的前体肽显着不同（图3b）。尽管前体肽具有高度的同源性(特别是在19-36位之间)，但与假定的sactipeptide BGCs接近的整体遗传组织在分离株之间存在显著差异(图3e)，排除物种间简单的水平基因转移。前体肽的系统发育分析显示，所有之前鉴定的代谢产物之间都有密切的关系，而本研究中鉴定的新序列被清晰地分离出来(图3d)。已知半乳糖肽的抗菌潜能以及独特的半乳糖肽样BGC在我们分离物中的广泛存在表明，编码的分子在塑造猪肠道菌群中的重要作用，现在可以对其进行研究。

然后，我们评估碳水化合物活性酶(CAZymes)，考虑它们对肠道生态相互作用和生物技术应用的重要性。对CAZy数据库(www.cazy.org)的基因组注释显示，所有分离株都编码酶，新物种Victivalislenta的酶多样性高达421个，而其他所有物种的平均酶数为106±67个(图3d)。特异性检测糖基转移酶(GTs)时，脆弱拟杆菌编码的数量最多(n = 126)。这两个物种和其他两个物种编码第10家族的GT，其中包括具有特殊生物技术意义的α-（1,3）-岩藻糖基转移酶（FucT）(图3d)。这些分离物中的一种是新型的猪Clostridium porci，它是猪肠道的一种普遍定殖者(见下一节)。其推定的FucT包含据报道在α-（1,3）-FucT中保守的FxxxFEN基序。结构建模确定与2NZW的最高结构相似性（同一性为30.8％；覆盖率为84.8％），这是一种已知的α-（1,3）-FucT。通过I-TASSER进行的基因本体分析预测，得分最高的分子功能为“岩藻糖基转移酶活性”（GO：0008417，得分= 0.37）。体外实验证实C. porci 外源表达并富集该蛋白。根据质谱分析(图3f中的b峰)，底物LacNAc type 2(峰a在图3f中)被转化为具有岩藻糖基化的LacNAc（LewisX）分子量的产物。岩藻糖苷酶测定证实该产物为Lewis X表位（岩藻糖以α-3-糖苷键连接到LacNAc的GlcNAc部分）。尽管该酶的详细生物化学需要额外的工作，但其鉴定仍是我们菌株收集物中功能细菌多样性的进一步证明。

图3 追求新的细菌功能。

4 PiBAC菌株的生态学揭示了宿主特异性

我们收集所有来自猪、小鼠和人类肠道的16S rRNA扩增子数据集，这些数据集在IMNGS47中具有>5000序列。对97%的PiBAC物种的序列定位显示，在猪肠道中培养的中位数比例为35.8%，而在人类和小鼠中分别为24.4%和10.5%（图4a）。38个新分类群的猪微生物群中位数培养比例(+2.6%)相对于通过Living Tree项目获得的整个分离菌多样性(n = 13,903)有适度但显著的增长。与国际收集的猪源分离株相比，PiBAC的贡献更高(+7.3%) （图4b）。与小鼠和人类相比，收集到的30种猪的流行率和相对丰度都有所增加，这表明宿主偏好性。其中包括本研究中描述的4个新分类群，在1346个测试样本中流行率为50%，尽管相对丰度较低：Floccifex porci，Clostridium porci，Kistiansenii和Peptostreptococcus porci（图4c）。使用在数千个扩增子数据集中确定的所有操作分类单位，确认了宿主特异性。OTU作图（97％的同一性）显示三种宿主物种之间只有很小的重叠（6.8％）（图4d）。

图4 16S rRNA扩增子的meta分析揭示宿主特异性。

以上基于扩增子的发现得到了宏基因组学分析的补充。使用新描述的工作流程，从以前发表的猪肠道元基因组中重构总共589个高质量（> 90％的完整性，<5％污染）的元基因组组装基因组（图5a）。这些hqMAG可以从https://github.com/strowig-lab/PIBAC获得。代表新培养的分类单元的38个分离株中有10个与MAG的匹配率≥95％，表明通过鸟枪测序，它们代表猪微生物群系中的优势细菌成员（图5a）：Holdemanella porci（流行率率18％ 在295个猪基因组中;平均相对丰度为0.16％±0.07％），Floccifex porci（13％; 0.14％±0.05％），Hallerella porci（5％;0.27％±0.30％），Hallerellasuccinigenes（27％; 0.21％±0.22％），Mogibacterium kristiansenii（12％; 0.13±0.03％），Oliverpabstia intestinalis（99％; 0.23±±0.80％），Selenomonasmontiformis (25%; 0.38±0.42%), Sharpea porci (1%; 0.28±0.21%)， Sodaliphilus pleomorphus（99％; 0.31±0.26％），Stecheria intestinalis（3％; 0.44±0.42％）。

与基因组分类数据库(GTDB)和最新的小鼠和人类肠道杂志库的比较表明，大多数来自猪的hqMAGs (n = 381;65%)代表未知类群(ANI值<95%)。突出以宏基因组为基础的物种目录的新丰富性，以及通过培养进一步探索猪微生物群系的实用性。这些尚未培养的细菌大多属于厚壁菌门，并列出10个“最受欢迎”的分类群(图5b)。从原始猪基因目录中可分配给基因组的序列中搜索发现，PiBAC分离物占蛋白质的18.4％，其中包含hqMAGs使其增加21.8％，总覆盖率为40.2％（图5c）。而且，来自分离物的另外69,360个蛋白和来自hqMAGs的114,643个蛋白无法分配给现有目录中的蛋白，表明所创建的资源不仅占基因目录的合理部分，而且对其进行了补充。综上所述，这些发现突出培养与宏基因组学相结合研究猪肠道微生物多样性的价值，需要扩大猪肠道微生物群的研究范围，并继续努力培养猪肠道细菌，以获得目前没有分离株代表的重要分类群。

图5 基于宏基因组的多样性和功能预测。

5 对原型类群的功能预测

肠道微生物群中微生物的高度多样性和仍然未知的部分，突显发展培养的微生物简化群落的有用性，该群落可用于研究受控实验条件下的分子机制。上述文献衍生的宏基因组被用作一个综合的数据库，以推断最能代表粪猪微生物群功能的最小分离菌群的组成。284个宏基因组在蛋白家族(PFAMs)水平上的二元(存在/缺失)分析表明，根据来源国的不同，存在明显的聚类（图5d）。来自中国的小猪不断喂食低剂量的抗生素，与其他两个猪群相距甚远。在所有PiBAC分离株中，PFAMs的分布覆盖了输入宏基因组中平均90%的PFAMs，使这一收集适合于菌株选择，以最好地模拟猪微生物群的原始功能潜力(图5e)。

对于每个宏基因组，我们基于一个迭代评分系统从PiBAC的110个物种中选择一组物种，该系统优化参考基因组和给定宏基因组之间的匹配数和不匹配数。然后绘制出在整个队列和每个国家中选择每种物种的最小群落的比例：共有23种物种在至少一个国家的流行率为50%(图5f)。它们涵盖4个门的13个细菌科，革兰氏阳性和-阴性以及兼性和严格的厌氧菌，包括本研究中描述的12个新类群，它们可以产生所有主要的短链脂肪酸(甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐)以及乳酸盐和琥珀酸。此外，其中三个具有胆汁盐水解酶（BSH）活性。该类群涵盖的其他功能包括：复杂的碳水化合物代谢；次级胆汁酸生产;反式氨氧化和厌氧谷氨酸发酵；从氨基酸生产丁酸。总之，该物种具有高度的系统发育和功能多样性，现在可以作为最小的细菌群用于实验和应用研究，例如，在养猪业中防止与肠道感染相关的抗生素使用。必须根据今后在分离和描述额外菌株方面的进展来修正最小菌群的组成。

6 猪分离株胆汁酸代谢特征

为了进一步鉴定分离菌株的功能，我们研究它们转化胆汁酸的能力，胆汁酸是微生物-宿主相互作用的关键介质。与众多的测序研究相比，培养胆汁酸代谢细菌的知识很少，阻碍了对次级胆汁酸代谢的靶向调节的应用。近一半的标本(来自6个门的50株)在体外显示可裂解胆汁酸中牛磺酸残基（图6a）。表明多种系统发育上多样化的物种能够解离胆汁酸，从而为以前的宏基因组学发现提供培养的分离物。相比之下，只有梭状芽胞杆菌属的一种菌株BL-389-WT-3D（= DSM 100975）能够通过7-α-脱羟基反应从胆酸（CA）产生次级胆汁酸脱氧胆酸（DCA）（图6b）。虽然Collinsellaaerofaciens已知能将初级胆汁酸脱氢，但在试验条件下，该品种的两个菌株对CA无活性。由于次级胆汁酸对病原菌的定植抗性，代谢健康以及肠道炎症和肿瘤发生的影响，因此对梭状芽孢杆菌DSM 100975进行进一步表征。

图6 胆汁酸代谢能力和功能宿主特异性特征。

在其封闭基因组中检测到3655个蛋白编码基因，与人类分离株C. scindens ATCC 35704T进行比较基因组学，共发现2966个基因(图6c)。猪分离株特有的689个基因中有很大一部分是功能未知的开放阅读框(ORFs)或可移动的遗传元素。事实上，几个大型基因簇(CS_BL389WT3D;p_00410-00671、p_00936-00958、p_01430-01477、p_02151-02499、p_02513-02560、p_02778-02828编码噬菌体相关基因。在人源菌株ATCC 35704T特有的662个基因中也进行类似的观察，表明在不同的宿主结肠环境中获得不同的可移动遗传元件和噬菌体。据报道人类菌株的一个独特特征是，皮质醇诱导的desABCD操纵子编码类固醇-17,20-碳链分解酶和20-羟基类固醇脱氢酶，参与皮质醇转化为11-氧雄激素。在两个菌株中，负责次级胆汁酸7-α-脱羟基化的胆汁酸诱导性操纵子的基因组织几乎相同（图6d）。在DSM 100975（猪分离株）中，编码单个胆汁酸7-α脱水酶的baiI基因位于baiH的下游，遵循一个未知功能的单个ORF（CS_BL389WT3Dp_00248）。

猪源菌株在最近报道的ATCC35704T的特定培养基中没有生长，表明生长所需的其他养分仍有待确定。然后，在不存在（PYF对照培养基）或存在胆汁酸（0.1μmMCA或0.1μmMDCA）的情况下，对DSM 100975菌株进行RNA-Seq分析。CA显着上调总共1393个基因（包括709个假定蛋白）（> 0.58 log2FC；FDR >> 0.05），而下调1336个基因（359个假定蛋白）（图6e）。baiBCDEAFGH基因的显着上调仅由CA诱导（图6f）。先前报道编码与bai途径的还原臂有关的flavin依赖性还原酶编码的baiN基因的表达被CA和DCA下调，这与ATCC35704T中的组成型表达不同。

总之，这些体外试验提供多种能够代谢胆汁酸的菌株，并突出猪和人分离株之间的差异。符合肠道细菌对特定宿主和相关环境条件的功能适应的概念，尽管需要更多的菌株进行全面分析。PiBAC现在可以作为体外和体内研究胆汁酸对微生物-微生物和微生物-宿主相互作用影响的工具箱。

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