编译：Sunshine，编辑：小菌菌、江舜尧。

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1 持久性有机污染物对盲肠混合菌体外生理和群落结构的影响

使用流式细胞仪方法在体外评估POPs短期暴露后盲肠细菌的生理状态(图2)。在暴露于所有四种持久性有机污染物后，观察到高核酸(HNA)含量的细菌显著减少，且呈剂量依赖性(图2(a))。POPs的短期孵育对SybrGreen、碘化丙啶(PI)和双(1，3-二丁基巴比妥酸)三亚甲基氧醇(DiBAC4)染色的细胞没有显著影响，但显著减少了羧基荧光素二乙酸酯(CFDA)染色的细菌，并呈剂量依赖性(图2(a-b))，表明微生物代谢活性迅速下降，而没有明显的细胞损伤。此外，通过广义UniFrac分析观察到暴露于TCDD的盲肠群落结构的变化。短期接触TCDD显著增加了乳杆菌属、玫瑰花叶杆菌属和振荡杆菌属的细菌数量，但减少了类杆菌属的细菌数量。

图2 离体盲肠细菌对持久性有机污染物暴露的生理反应。(a)用流式细胞仪分析分离的盲肠细菌经载体或两剂持久性有机污染物暴露4小时后获得的SybrGreen、低核酸(LNA)和染色细胞的比例，(b)用流式细胞仪分析分离的盲肠细菌经载体或两剂持久性有机污染物暴露4小时后获得的、Pi和DiBAC4染色细胞的比例。

2 持久性有机污染物对盲肠混合菌体外代谢的影响

为进一步探讨POPs对盲肠细菌的影响，采用基于¹H NMR的代谢组学方法研究了POPs对盲肠细菌的亲水性代谢物和脂质的影响(图3)。主成分分析(PCA)曲线图显示，使用两种剂量持久性有机污染物的盲肠细菌获得的亲水性代谢物和脂质有明显的聚集性(图3(a)和3(c))。暴露于多氯联苯153(6μM)可显著降低盲肠细菌中核酸、醋酸盐、甲酸盐、蛋氨酸和天冬氨酸的水平，但显著提高葡萄糖、脂质、乳酸、丁酸、琥珀酸、丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和支链氨基酸(BCAA)的水平(图3(b))。相反，TCDF、TCDD和PCB126对微生物亲水性代谢物没有明显的影响(图3(b))。与其他持久性有机污染物相比，暴露于多氯联苯153(6微米)的脂肪酸代谢发生了显著变化(图3(d))。暴露于多氯联苯153(6μM)导致不饱和脂肪酸(UFA)和单不饱和脂肪酸(MUFA)显著降低，但饱和脂肪酸(SFA)和SFA/UFA比率升高；而暴露于其他持久性有机污染物(POPs)则导致SFA显著降低，但UFA和MUFA升高(图3(d))。UPLC-MS分析用于识别POP暴露后微生物脂质的改变。总之，这些结果表明，POPs的短期孵育直接和迅速地影响盲肠细菌的新陈代谢，这与微生物代谢活性的显著下降有关。

图3 基于¹H核磁共振的离体盲肠细菌对持久性有机污染物暴露反应的代谢组学分析。(a)带有载体或两个剂量的持久性有机污染物暴露4小时，从¹H核磁共振数据中获得的分离盲肠细菌亲水代谢物的主成分分析图。(b)经载体或两种剂量的持久性有机污染物暴露4小时后分离的盲肠细菌的亲水性代谢物相对含量的热图。红色阴影代表增加的代谢物，蓝色阴影代表减少的代谢物。（c）带有载体或两个剂量的持久性有机污染物暴露4小时，从¹H核磁共振数据中获得的分离的盲肠细菌脂质谱的主成分分析图。（d）通过载体或两次暴露于持久性有机污染物4 h，从分离的盲肠细菌中获得的代表性脂肪酸的相对水平。

图4 基于UPLC-质谱/质谱的代谢组学分析离体盲肠细菌对持久性有机污染物暴露的脂质谱。热图表示带有载体或两剂持久性有机污染物暴露4小时，从阳性(a)和阴性(b)模式中分离的盲肠细菌的脂质丰度。红色阴影代表增加的代谢物，蓝色阴影代表减少的代谢物。(每组n = 4)。

3 持久性有机污染物对盲肠混合菌体外转录的影响

    利用RNA-seq技术分析了TCDF(6μM)、TCDD(0.6μM)和PCBs(6μM)暴露的盲肠细菌的转录组，以研究POPs对细菌的功能反应。结果表明，在TCDF(6μM)、TCDD(0.6μM)和PCBs(6μM)的作用下，盲肠细菌对POPs的功能反应不同。主成分分析显示，使用载体和持久性有机污染物暴露的盲肠细菌之间有明显的分离，其中PCB153和其他持久性有机污染物之间的差异最大 (图5(a))。暴露于不同持久性有机污染物的样本之间差异表达基因同源基因的数量不同(图5(b))。对于TCDD(0.6μM)和PCB153暴露(6μM)，上调的基因同源数目从60到212个不等，而对于PCB 126(6μM)和TCDD暴露(0.6μM)，下调的基因同源数目从19到84个不等(图5(b))。在差异表达的基因同源基因中，大多数被发现只被一个POP特异性改变(图5(c))。本研究鉴定了5个基因同源基因，它们分别对应于磷酸丁酰基转移酶(Ptb)、小酸溶性孢子蛋白D(Sspd)、可能的嘧啶渗透酶rutG(RutG)、2-氧异戊酸脱氢酶E1组分(Bkda)和转座酶IS5家族(图5(d))，它们与丁酸代谢、21种支链氨基酸脱氢酶(21种支链氨基酸脱氢酶)、22种支链氨基酸脱氢酶和嘧啶相关。对KEGG模块和途径富集的分析证实并扩展了这些趋势。包括三羧酸(TCA)循环、糖酵解、氨基酸生物合成、核苷酸代谢和发酵途径在内的途径被整合，并利用代谢组学数据结合代谢组学数据进行可视化(图5(e-f))。虽然每个POP都诱导了特异的转录反应，但一些总体趋势是相同的，例如，暴露于大多数持久性有机污染物，特别是多氯联苯153(6μM)，显著丰富了三氯乙酸循环和糖酵解途径，并得到了途径中明显更高水平的基因直系物和中间体的支持(图5(e-f))。本研究将5种代表性细菌(包括类杆菌、梭状芽孢杆菌、乳杆菌、双歧杆菌和梭杆菌)映射到它们的参考序列。总共鉴定了125个在TCDF暴露(6μM)后差异表达的基因同源基因，96个在TCDD暴露后差异表达的基因同源基因(0.6μM)，98个在PCB 126暴露后差异表达的基因同源基因(6μM)，以及234个在TCDF暴露(6μM)后差异表达的基因同源基因。与盲肠分离细菌的结果一致，PCB153暴露在转录水平上对这五种细菌的影响比其他持久性有机污染物更大。

图5 离体盲肠细菌对持久性有机污染物暴露的转录反应。（a）接触媒介或持久性有机污染物4小时后盲肠细菌基因表达的主成分分析图。(b)经载体或持久性有机污染物暴露4小时后分离出的盲肠细菌的差异表达基因直系同源物的数量；(c)每种持久性有机污染物之间共有的污染物特异性基因直系同源物的数量。（d）基因同源物对所有四种持久性有机污染物都有显著的调节作用。（e）综合和可视化的三羧酸(TCA)循环，使用元翻译学数据和代谢组学数据相结合。（d）结合代谢组学数据的整合和可视化糖酵解途径。

4 持久性有机污染物对单个菌种的体外生理代谢效应

    在明确了特定细菌对POPs暴露的转录反应后，研究人员试图探索POPs对单个细菌的生理和代谢影响。为了探索POPs对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的特异性作用，将生长速率测量(OD600)和流式细胞术与UPLC-MS代谢组学相结合，研究了POPs对6种单个细菌的响应。使用了6种细菌，包括3种革兰氏阳性菌(副乳杆菌、长双歧杆菌和梭状芽孢杆菌)和3种革兰氏阴性菌(核梭杆菌、脆弱类杆菌和脆弱类杆菌，这些细菌在健康人的肠道中发现，它们在宿主代谢中起关键作用。将流式细胞术与光学技术相结合，发现在宿主代谢中起关键作用的是3种革兰氏阳性菌(副乳杆菌、双歧杆菌长双歧杆菌和分枝梭状芽孢杆菌)和3种革兰氏阴性菌。两种剂量的4种持久性有机污染物作用18h后，对大多数细菌的生长速度和生理状态没有显著影响，包括脆弱类杆菌、脆弱类杆菌、核梭杆菌和拉莫斯梭菌，表明持久性有机污染物暴露于这些细菌种后不会对细胞造成明显的损害。长双歧杆菌的生长在较高剂量的TCDF(6μM)和TCDD(0.6μM)以及两个剂量的PCB 126和PCB 153暴露下观察到显著的下降，而在较低剂量的TCDF(0.6μM)和TCDD(0.06μM)暴露下观察到轻微的下降(图6(a))。与OD600结果一致，两种剂量的PCB 153(0.6μM和6μM)以及更高剂量的PCB 126(6μM)暴露显著增加了受损细胞(PI和DiBAC4染色的细胞)的比例，减少了CFDA染色的细菌(图6(c))，这表明POPs暴露18小时后，长双歧杆菌的生理状态发生了戏剧性的变化。POPs暴露没有导致副乳杆菌的生长发生戏剧性变化，但副乳杆菌的生长略有增加，表现为POPs暴露使PI染色细菌的生长速度增加和显著减少(图6(b)和6(d))。在确定了暴露于持久性有机污染物的盲肠细菌中脂质谱的显著变化后，试图调查持久性有机污染物对这六种细菌脂质代谢的影响(图7)。使用自组织映射图(SOM)组装了从UPLC-MS获得的脂谱的log2倍变化值，并将其投影到超六角形景观上(图7)。这六种细菌在正负两种模式下对TCDD、TCDF或PCBs暴露显示出极大的脂质组成变化，POPs暴露的副乳杆菌中的大多数脂质增加，POPs暴露的梭状芽孢杆菌中的大多数脂质下降。两株脆弱杆菌对持久性有机污染物暴露也表现出不同的反应。有趣的是，在副乳杆菌和长双歧杆菌中暴露两种剂量的持久性有机污染物后，观察到对亲水性代谢物的显著影响有限。

图6 个别物种在体外对持久性有机污染物暴露的生长率和生理反应。(a-b)长双歧杆菌(a)和副干酪乳杆菌(b)的生长率。(c-d)流式细胞仪分析长双歧杆菌(c)和副干酪乳杆菌(d)的SybrGreen、Pi、和DiBAC4染色细胞与载体或两剂持久性有机污染物接触18小时的比例。

图7 基于UPLC-质谱/质谱的代谢组学分析显示，个体物种在体外暴露于持久性有机污染物时的脂质分布情况。接触持久性有机污染物18小时(每组n = 4)后，根据长双歧杆菌、副干酪乳杆菌、分枝梭状芽孢杆菌、具核梭状芽孢杆菌、脆弱细菌(ATCC 25282TM)和脆弱细菌(638 R)的UPLC-质谱/质谱阳性(a)和阴性(b)模式得出的脂质谱图。

本研究中，使用体外系统研究了四种持久性有机污染物在生理、代谢和转录水平上对肠道微生物群的直接影响。在体外观察了盲肠细菌对短期持久性有机污染物暴露的直接代谢和生理反应。探讨了持久性有机污染物和肠道微生物群之间的直接相互作用，并提供了持久性有机污染物毒性的新观点。

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