编译：微科盟蓝胖儿，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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1 添加杏鲍菇粉饲养对C26荷瘤小鼠存活率的影响

每天用分析天平检查小鼠的体重，通过触诊监测肿瘤生长（表3，肿瘤生长延迟）。如表3所示，在实验组中，恶病质发作有轻微但不显著的延迟（以天为单位）。与对照组相比，添加杏鲍菇粉饲养的小鼠存活率显著增加（p = 0.0495，图1）。对照组接种肿瘤后的平均存活时间为35.5天，添加杏鲍菇粉饲养组的平均存活时间延长至41.5天。

图1 C26荷瘤小鼠存活率。Log-rank检验表明，与对照组相比，添加杏鲍菇粉饲养可提高C26小鼠的存活率（p = 0.0495，n = 15/组）。

表3 小鼠存活参数 

2 C26肿瘤的宏观和微观评价

取10只C26荷瘤小鼠（n = 5添加杏鲍菇粉，n = 5正常饮食），在绘制存活率结果后进行处理，用于形态学和分子检测。这些动物的体重、脾脏重量和肿瘤重量有轻微但不明显的下降（表4）。宏观上看，肿瘤呈结节状，半透明，被包膜，易于与周围组织分离（图2a）。用苏木精和伊红染色对其进行组织学评价显示高度细胞新生，由小的、圆形或椭圆形细胞组成，细胞质极少，细胞核有核仁。观察到罕见的假腺结构（图2b）和一些有丝分裂图（黄色箭头，图2c）。

表4 用于器官取样的小鼠参数

图2 C26肿瘤的形态学和组织学特征。（a）新鲜切除肿瘤的代表性图像显示为结节状，半透明，有包膜，容易与周围组织分离。（b）苏木精和伊红染色的代表性图像。可见浸没在间变性细胞中的假腺结构。（c）苏木精和伊红染色的代表性图像。黄色箭头表示存在一些有丝分裂像，表明即使在添加杏鲍菇粉饲养后肿瘤仍有增殖活性。

3 添加杏鲍菇粉饲养对JNK及其相关分子的影响

JNK蛋白及其相关分子在正常饮食饲养小鼠和添加杏鲍菇粉饲养小鼠肿瘤肿块中的表达。JNK染色在两个组中均升高，并在细胞质和细胞核中观察到。阳性细胞的平均百分比在正常饮食饲养组为89.5%，在添加杏鲍菇粉饲养组为87.1%，无显著差异（图3a和b）。p-JNK免疫组化分析显示有核信号，阳性细胞的平均百分比在正常饮食饲养组为18.2%，在添加杏鲍菇粉饲养组为38.5%。统计学分析显示添加杏鲍菇粉饲养组p-JNK表达明显高于正常饮食饲养组（p < 0.05）（图3c和d）。Bcl-xL信号是细胞质信号。Bcl-xL染色阳性细胞的百分比在正常饮食饲养组为69.5%，在组为38.4%，差异显著（p < 0.001）（图4a和b）。此外，Survivin染色为细胞质染色，阳性细胞的平均百分比在正常饮食饲养组为29.9%，在添加杏鲍菇粉饲养组为9.6%，差异显著（p < 0.001)（图4c和d）。最后，进一步分析肿瘤中是否存在Atg7作为自噬的标记物。如图3e和f所示，与正常饮食饲养组相比添加杏鲍菇粉饲养组Atg7表达显著增加（阳性细胞的平均百分比分别为9.9%和3.6%，p < 0.0001）。Atg7呈细胞质免疫阳性。

图3 JNK、p-JNK和Atg7的免疫组织化学结果。（a）JNK（c）p-JNK和（e）Atg7在在正常饮食饲养小鼠和添加杏鲍菇粉饲养小鼠肿瘤组织中的代表性图像。黄色箭头表示存在一些有丝分裂像，表明即使在添加杏鲍菇粉饲养后肿瘤仍有增殖活性。（b）JNK的免疫阳性百分比、（d）p-JNK的核阳性百分比和（f）Atg7的细胞质阳性百分比。

图4 Bcl-xL和survivin免疫组化结果。（a）Bcl-xL和（b）Survivin在正常饮食饲养小鼠和添加杏鲍菇粉饲养小鼠肿瘤组织中的代表性图像。（c）Bcl-xL免疫阳性百分比和（d）Survivin细胞质阳性百分比。

4 添加杏鲍菇粉饲养对肿瘤中Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp27蛋白水平的影响

蛋白质印迹分析和免疫荧光法用于测定Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp27蛋白水平。如图5a所示，添加杏鲍菇粉饲养显著增加了肿瘤中的Hsp90和Hsp27蛋白水平（分别为p = 0.0350和p = 0.0400），而Hsp60蛋白水平显著降低（p =0.0159）。相反，两组间关于Hsp70蛋白水平的差异并不显著。使用免疫荧光进行的观察证实了添加杏鲍菇粉饲养影响Hsp90、Hsp60和Hsp27蛋白水平（图5b）。关于这些蛋白质的细胞位置，在各组之间没有观察到差异。Hsp90和Hsp27的优先位置似乎是细胞质，而Hsp60位于类似线粒体的小点上。

图5 C26肿瘤中Hsp90、Hsp70、Hsp60和Hsp27蛋白表达水平。（a）在添加杏鲍菇饲养的小鼠的肿瘤中，诱导了Hsp90和Hsp27蛋白水平的升高和Hsp60蛋白水平的降低。β-肌动蛋白用作内参。（b）使用免疫荧光检测Hsp90、Hsp60和Hsp27时采集的代表性图像。细胞核用Hoechst 33342复染。使用共聚焦显微镜的观察证实了通过蛋白质印迹分析获得的数据。

5 添加杏鲍菇粉饲养对肿瘤组织中IL-6、IL-1和TNFα mRNA表达水平的影响

为了更好地评价添加杏鲍菇粉饲养对肿瘤的影响，采用qRT-PCR检测IL-6、IL-1和TNFα的mRNA表达水平。如图6所示，添加杏鲍菇粉饲养导致IL-6和IL-1表达水平显著下调（p = 0.0001和p = 0.0100），而TNFα表达水平没有改变。

图6 C26肿瘤中IL-6、IL-1和TNFα基因表达水平。添加杏鲍菇粉饲养小鼠C26肿瘤中IL-6和IL-1基因表达水平的下调。条形图显示IL-6、IL-1和TNFα基因表达水平归一化到参照基因（GAPDH），根据Livak方法（2^-ΔΔCT）。

在本研究中，使用结肠癌和癌症恶病质的异位模型研究了添加杏鲍菇粉饲养的效果。异位肿瘤模型（皮下肿瘤）在文献中被大量使用，因为它们具有易于监测肿瘤进展和评估治疗干预方面具有优势。结果显示，添加杏鲍菇粉饲养的C26结肠癌小鼠比喂食正常饮食的小鼠存活时间更长。此外，这些动物的恶病质发病没有明显的延迟，肿瘤重量也没有明显的减少。对移植肿瘤的分子和组织学分析显示，Hsp90、Hsp60和Hsp27蛋白水平发生了显著的改变。这些蛋白在所有组织中都有生理表达，但它们可以被应激信号机制诱导，从而触发细胞凋亡、肿瘤增殖和化学抗性。

在添加杏鲍菇粉饲养的C26荷瘤小鼠的肿瘤中，观察到Hsp90和Hsp27蛋白水平增加，同时Hsp60水平降低。Hsp90的表达增加与肺癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤和白血病的预后不良有关。关于结肠癌， Hsp90的高水平反映了较低的恶性潜能。肿瘤Hsp90高水平的患者比阴性或低表达肿瘤的患者具有更好的存活率。这一发现可以部分解释添加杏鲍菇分别饲养的C26荷瘤小鼠比用正常饮食喂养的小鼠存活时间长。Hsp27在胃癌、前列腺癌、胰腺癌和预后不良的多种肿瘤中均有高水平的组成性表达。在本研究的模型中，Hsp27水平的增加应该被认为是癌细胞试图克服可能由饮食中添加杏鲍菇分粉引起的代谢改变所引起的应激。添加杏鲍菇粉饲养的小鼠肿瘤中Hsp60水平的降低是通过补充杏鲍菇中所含的微量营养素对恶性肿瘤的保护作用的结果。

在移植的肿瘤中观察到的IL-6和IL-1基因表达水平的显著降低。IL-1和IL-6是参与维持肿瘤生长所需的细胞因子，特别是在肿瘤微环境中驱动炎症。IL-1和IL-6与促进血管生成、癌细胞的存活、转移和治疗抗性有关。这些细胞因子是包括结肠癌在内的不同类型癌症发生的标志。这些数据导致了一种假说，即它们在添加杏鲍菇粉饲养小鼠的肿瘤中表达的下调，由杏鲍菇诱导的一种强大的抗炎作用信号，这种作用同时对抗了癌症的侵袭性，有利于实验动物的生存。

为了确定添加杏鲍菇粉饲养观察到的效应中涉及的可能机制，分析了JNK转导通路，因为它涉及不同的生理机制，包括细胞存活和死亡。添加杏鲍菇粉饲养小鼠的肿瘤显示对p-JNK的免疫反应性增加，对生存素和BcL-xL的免疫反应性降低。在提出的工作假设（图7）中，补充维生素、微量元素和矿物质后，饮食中的杏鲍菇粉通过磷酸化诱导JNK激活。

图7 工作假设。在饮食中添加杏鲍菇粉可诱导JNK途径的激活，以响应维生素、微量营养素和矿物质的补充（图中的灰点）。通过磷酸化激活JNK（p-JNK）可能诱导HSF1激活，引发热休克反应。Hsp90和Hsp27水平的增加可以被认为是癌细胞克服由代谢变化引起的压力的一种尝试。Hsp60蛋白水平显著降低，Hsp60蛋白水平降低也可能与survivin的降低有关。Survivin的减少与Atg7的升高有关，Atg 7是自噬的标志。另一方面，p-JNK最常见的活性是诱导c-Jun磷酸化，这可以抑制促炎细胞因子IL-6和IL-1的转录（Hsp60也在这种抑制中起作用）。IL-6和IL-1表达的下调可能与它们在癌症微环境中水平的降低平行。这种情况与营养摄入可能导致的代谢转换有关，可能有助于提高实验动物的癌症生存率。C-Jun可激活抗凋亡因子Bcl-xL的降解，Bcl-Xl是凋亡和自噬之间相互作用的调节剂。Atg7的升高和survivin水平的不稳定以及Bcl-xL的降低导致了自噬的恢复，这可能是饮食改变的结果，最终干扰了小鼠的存活率。

本研究的结果表明，添加杏鲍菇粉饲养效应可能是由JNK激活驱动的多种细胞机制介导的。一方面，p-JNK触发热休克反应，survivin下调，上调Atg7。此外，p-JNK可诱导IL-6、IL-1、Bcl-xL下调，具有抗炎、促凋亡作用。Atg7的升高和survivin的不稳定以及Bcl-xL水平的降低有助于自噬的恢复，这可能是饮食改变的结果，最终干扰了实验小鼠的存活率。这可能是首次将杏鲍菇膳食补充剂、p-JNK、应激蛋白和炎症细胞因子之间建立了关系。从而影响癌症小鼠的生存。研究的分子可以作为有前途的生物标记物，用于进一步研究杏鲍菇作为膳食补充或作为抗癌治疗的辅助剂。

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