编译：微科盟小狮子，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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1 研究区与野外采样

本研究是在青藏高原多年冻土影响区进行的。青藏高原多年冻土区与季节冻土区的面积分别为1.06×10⁶和1.46×10⁶km²。高原上年平均气温变化范围为-4.9-6.1 ℃，年平均降水量为84.3-593.9mm。高寒草原、高寒草甸和沼泽草甸是青藏高原三种典型的植被类型，土壤有机碳密度在沼泽草甸最高，高寒草甸较低，高寒草原中最低。根据世界土壤资源参考数据库，青藏高原主要土壤类型为雏形土。多年冻土根据其空间分布的连续性，可分为连续多年冻土、不连续多年冻土、片状多年冻土及零星岛状多年冻土。大部分形成于晚更新世末次冰期最大期，但在全新世最暖期经历了大范围的退化。最后在新冰期形成了一个新的多年冻土层。这些区域下的冻土几乎属于共生多年冻土，土壤内部的平均温度为-1.5 ℃。整个高原的平均活动层厚度约为1.9 m。年平均增长率为1.3 cmyr^-1。

图1 青藏高原野外采样点分布图

2016年，我们在青藏高原中部和北部选择了24个点（图1），每个点在10 m×10 m的样地内采集了5个土芯样品。具体来说，使用直径为10cm的钻孔机取土壤样品。将融化前部的样品放入聚乙烯袋中，用冷却箱运输，保存在-20℃冰箱中直到制样。24个样点共收集了120个土壤样品。所有样点中，由于观测到的活动层厚度（ALT）在0.7-2.9 m范围内，所以采样深度在1.5-3.5 m之间变化。在进行实验分析之前，将从每个样点获得的5个重复样品切割成段，然后以相同质量混合以形成复合样品。混合样品再分成两部分，一部分储存在-80 ℃用于DNA提取，另一部分储存在-20 ℃用于培养实验。

2 土壤DNA提取

为了探索微生物群落对多年冻土融化的响应，我们从多年冻土土壤中提取DNA.根据说明书使用PowerMax®土壤DNA提取试剂盒进行土壤DNA提取。通过NanoDropND-2000分光光度计，测定在230 nm、260 nm和280 nm吸收值，基于260和280 nm吸收值的比值（1.8）以及260和230 nm吸收值的比值（＞1.7）对DNA质量进行检测，并用FLUOstarOPTIMA荧光平板阅读器与PicoGreen 进行评估。提取的DNA用于测序文库制备和基因芯片标记。同时，与之前研究相同，土壤DNA浓度被用来反映融化和原始多年冻土中的微生物生物量。

3 IlluminaMiSeq测序和数据处理

采用高通量测序来检测细菌和真菌的分类多样性。具体而言，扩增16srRNA的V4片段使用 引物 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') 和 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。循环条件设置如下：94 ℃预变性3分钟；35个循环（94℃45s，50℃60s,72℃60s)；随后72 ℃，10分钟。引物序列ITS3(5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’)/ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)被用来扩增真菌ITS2区。PCR条件包括：95 ℃预变性3分钟；随后35个循环（95℃ 45 s，55℃ 45 s,72℃ 30 s)；随后72℃，8分钟。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳显示，用QIAEXII凝胶提取试剂盒纯化，并用Quant-iTdsDNAHS检测试剂盒定量。最后将纯化的扩增子以等摩尔汇集，并在Miseq仪器山进行配对末端测序。

为了检测微生物分类信息，我们将16S和ITS序列按照以下步骤进行处理。根据条形码将原始读长分为不同的样品。修剪正向和反向引物以允许一个错配。基于FLASH软件，将配对末端读数组合为全长序列。使用Btrim程序去除质量差的读数，其平均质量得分大于20，窗口大小为5。删除碱基不明确或＜200bp的连接序列。使用UPARSE去除嵌合体，其余的高质量读长以97％的相似水平被划分为操作分类单元（OTUs）。核糖体数据库（RDP）分类器和Blast分别用于确定细菌和真菌序列的分类学同一性。过滤后的序列分别用SILVA128和UNITE7.2S数据库对16S和ITS序列进行分配。删除在16SOTU表中标识为非细菌的OTUs，以及在ITSOTU表中标识为非真菌的OTUs。所有样品均以每个样品的最小序列进行稀释。重采样的微生物OTU表用于进一步的统计分析。将原始读长上传到NCBISequenceReadArchive (SRA)数据库，细菌和真菌的登录号分别为SRR12846124和SRR12846161。

4 功能基因芯片杂交和数据处理

为了确定功能基因组成，利用GeoChip5.0对土壤微生物群落功能基因进行分析。该基因阵列在约400个基因家族中有约60,000个寡核苷酸探针，用于生物地球化学过程，包括碳、氮、磷、硫循环和其他五大类。简而言之，用Cy-3染料标记0.8 ug纯化的DNA,并用QIAquick试剂盒纯化。标记样品在67 ℃下杂交24小时。杂交后通过扫描仪进行扫描(Roche, Pleasanton, CA, USA)。然后使用Agilent数据提取软件对扫描图像数据进行处理并转换为信号强度。去除信噪比＜2，且信号强度小于背景值2倍的斑点。同时我们删除了那些只在一个重复中检测到的探针。利用相对丰度对每个点的信号强度进行归一化处理。归一化基因信号强度用于随后的生物统计分析。

值得注意的是与其他微生物参数相比，DNA分析与土壤生物化学过程之间存在差距。然而，RNA衍生的序列主要反映微生物过程中的瞬时变化，而蛋白质衍生的参数（例如酶活性）表现出高度的异质性。考虑到这方面，利用基于DNA的微生物功能潜力作为代用指标来阐明多年冻土融化过程中微生物响应与功能过程之间联系是一个很好的尝试。

5 培养实验

我们通过两个培养实验来探索微生物群落变化及其与土壤碳释放之间的关系。短期的一个实验是为了研究多年冻土融化11天后微生物群落的变化。具体来说，是将50 g冻土在5℃条件下培养11天。培养完后将土壤样品转移到聚乙烯袋中并用铝箔包裹，然后用液氮速冻以进行微生物群落分析。选择11天培养实验主要基于以下两点考虑：首先，多年冻土融化可以在数天内（7、11和19天）改变微生物群落和功能基因。其次，除多年冻土融化影响外，土壤基质和微环境也会随着培养时间的增加而改变，这会影响微生物群落。因此，为了与以往研究进行比较且避免其他因素的干扰，我们选择11天的培养实验来检测微生物对多年冻土融化的响应。

另外五个月的培养实验是为了探究冻土融化、原始土壤中微生物分类和功能群落变化与土壤二氧化碳-碳释放之间的关系。在培养之前，将约30-50 g冻土土壤样品放在250 ml琥珀色玻璃广口瓶中在5 ℃条件下预培养11天以释放滞留的气体。将土壤水分调节至持水能力的60%，并在5个月的培养过程中添加无菌水使土壤水分保持恒定。培养第一个月每两天测定一次二氧化碳浓度，第二个月每周测两次，随后三个月每周测一次。在每次测定之前，用合成空气（20％O₂和80％N₂）冲洗广口瓶，然后在5 ℃黑暗环境中培养24小时。在24小时间隔前后，用注射器从广口瓶中收集15 ml顶空气体，使用便携式红外气体分析仪测定二氧化碳浓度。二氧化碳的释放速率为一天内的二氧化碳浓度除以土壤有机碳的含量。土壤有机碳含量是从总碳中减去土壤无机碳获得。土壤无机碳用碳酸盐含量分析仪测定，总碳用元素分析仪测定。

6 统计分析

我们通过以下三个步骤分析了微生物与碳释放数据。首先，使用成对样本t检验来检验融化土壤和原始土壤中微生物α多样性，微生物分类群的相对丰度和功能基因信号强度的差异。通过计算丰富度和Shannon-Weiner指数来估算微生物分类和功能α多样性。其次，采用三种非参数多元统计方法分析了多年冻土融化对微生物分类和功能群落结构的影响。这三种方法分别为置换多元方差分析（Adonis）、相似性分析(ANOSIM)和多反应置换法(MRPP)。采用主坐标分析(PCoA)方法对融化土壤和原始土壤微生物分类和功能群落结构进行了可视化分析。第三，通过普通最小二乘（OLS）回归分析确定了土壤碳释放与微生物特性变化之间的联系。其中，微生物群落结构的变化以群落间的Bray-Curtis距离为特征。

所有的统计分析均在R3.6.2中进行。具体来说，使用基本函数t.test和lm分别进行成对样本t检验和OLS回归分析。利用vegan包的多样性函数确定微生物的分类和功能α多样性。采用vegan包的adonis，mrpp和anosim函数进行三种非参数多元统计分析。主坐标分析（PCoA）通过apc包的pcoa函数进行。

1 多年冻土融化对微生物分类、功能基因多样性和群落结构的影响

融化土壤和原始土壤中微生物量没有显著差异。而16SrRNA和ITS序列显示的微生物α多样性、微生物门和群落结构在多年冻土融化后发生了显著变化。细菌和真菌序列总数为3,952,590和4,799,826,基于97%的相似性水平，分别聚类为10,384和2,510个操作分类单元（OTUs）。多年冻土融化后，24个采样点的细菌和真菌α多样性均下降（图2）。具体而言，在融化土壤中观察到的细菌丰富度和Shannon多样性指数均显著低于原始土壤（P＜0.001;图2a-b）。融化土壤中的真菌丰富度也低于原始土壤（P＜0.01;图2c），而真菌的Shannon多样性指数在融化土壤和原始土壤之间没有显著差异（P=0.151；图2d）。

图2 16SrRNA和ITS序列揭示了融化和原始土壤中细菌(a-b)和真菌(c-d)的丰富度和Shannon指数。小提琴曲线图中的胡须值表示第5和第95四分位数，方框末端表示第25和第75四分位数(四分位区间)。方框中的直线和正方形分别代表数据(n = 24)的中位数和平均值。**P < 0.01，***P < 0.001。

对细菌分类鉴定，将检测到的OTUs分为14个原核门。融化土壤和原始土壤中的优势菌门是变形菌（Proteobacteria ）（分别为44.9％和25.2％），放线菌（Actinobacteria ）（分别为21.1％和10.0％）和拟杆菌（Bacteroidetes ）（分别为18.3％和20.3％）（图3a），尤其是融化土壤中的变形菌（Proteobacteria）、放线菌（Actinobacteria ）和厚壁菌（Firmicutes）丰度均高于原始土壤，而融化土壤中的绿弯菌（Chloroflexi）、酸杆菌（Acidobacteria）、疣微菌（Verrucomicrobia）、Patescibacteria、浮霉菌（Planctomycetes）、蓝藻（Cyanobacteria）、Caldiserica、硝化螺旋菌（Nitrospirae ）的相对丰度显著低于原始土壤（P＜0.01；图3a）。

图3 融化和原始土壤中的细菌(a)和真菌(b)群落组成。融化土壤和原始土壤在分类组成上的显著差异用星号表示(*)(n = 24; P<0.05)

对于真菌组成，融化土壤与原始土壤中的优势门是子囊菌（Ascomycota）(分别为50.6% 和63.5%)和担子菌（Basidiomycota)(分别为33.5% 和17.6%)(图3b)。尤其是在融化土壤中，担子菌（Basidiomycota)和接合菌（Zygomycota）的相对丰度高于原始土壤（P<0.05）。PCoA表明，融化土壤土和原始土壤之间细菌和真菌的群落结构分离良好。另外，非参数多元统计分析结果表明原始土壤和融化土壤中的微生物群落结果存在显著差异。

多年冻土融化后，24个采样点的功能基因α多样性均显著增加（P<0.001；图4）。具体来说，融化土壤的功能基因丰富度和Shannon多样性指数均显著高于原始土壤(P<0.001; 图4a-b)。此外，碳降解基因α多样性与总功能基因表现出相似的模式(图4c-d)。根据归一化基因强度，所有碳降解基因的丰度在多年冻土融化后显著增加（P<0.01），如淀粉（amyA基因）、半纤维素（xyla和ara基因）、纤维素（纤维二糖酶基因）、几丁质（几丁质酶基因）、果胶（pme和RgaE基因）、芳烃（linb和poba基因）木质素（酚氧化酶基因）（图4e）。此外，融化土壤和原始土壤的微生物功能群落结构在总功能基因和碳降解基因方面也存在显著差异。

图4 通过GeoChip检测融化土壤和原始土壤之间的微生物功能多样性和相关的碳降解基因丰度的变化。a-b表示融化和原始土壤之间功能基因的丰富度和Shannon指数的比较，c-d表示融化和原始土壤之间碳降解基因的比较（n = 24）。小提琴曲线图中的胡须值表示第5和第95四分位数，方框末端表示第25和第75四分位数(四分位数间范围)。方框中的直线和正方形分别代表数据(n = 24)的中值和平均值。e显示了多年冻土融化在基因水平和亚类水平上对参与碳降解功能基因的影响(柱状图内)。基因顺序从不稳定碳排列到难降解碳。GeoChip数据表示融化土壤和原始土壤（融化-原始）之间的信号差。误差棒代表标准误差（n = 24）。*** P＜0.001。

2 多年冻土融化引起的微生物分类多样性和功能基因变化与二氧化碳-碳释放之间的关系

为了研究微生物群路在调节土壤碳分解中的潜在作用，我们分析了多年冻土融化前后土壤二氧化碳-碳释放与微生物分类和功能群落变化的联系。具体来说，我们研究了从11天和5个月培养实验中的土壤二氧化碳-碳释放与微生物多样性变化的关系，以验证培养期间微生物响应与土壤碳释放之间联系的稳定性。我们的研究结果表明，短期(11天，图S4e-h)和长期(5个月，图5e-h)的平均CO₂释放速率与微生物功能α多样性指数的变化呈显著相关(P<0.05)，但与微生物分类α多样性不相关。在培养期间，二氧化碳-碳的释放量与碳降解功能类别丰度的变化((P<0.05;图5i-p)及功能微生物群落结构变化(P<0.05;图S5e，f) 呈显著正相关，但与微生物群落结构的分类无关(P>0.05;图S5a-d)。

图5土壤碳释放速率和多年冻土融化引起的微生物多样性和相对基因丰度变化的关系。土壤碳释放速率表示5个月培养期间的平均值。实线表示拟合的普通最小二乘模型，灰色区域对应于95％的置信区间。*和**分别表示土壤二氧化碳-碳释放速率与相应变量之间的显着相关性，分别为P<0.05和P<0.01

1 多年冻土融化后，分类α多样性降低，功能α多样性增加

我们的研究结果表明多年冻土融化后，细菌和真菌α多样性降低(图2)，其群落结构也发生了显著变化，这支持了我们的第一个关于多年冻土融化对微生物群落有显著影响的假设。多年冻土融化引起的分类α多样性下降可能主要由于稀有微生物类群的消失。为了验证这一点，我们定义稀有类群的相对丰度阈值为0.01%，丰富类群的相对丰度阈值为1%，然后将所有OTU分类为稀有或丰富OTU。进一步分析表明，融化土壤和原始土壤中所有独特细菌和真菌OTUs都是稀有物种，说明在多年冻土融化过程中，稀有微生物类群的大量物种消失(细菌和真菌群落的OTUs分别为2452和372)。

微生物分类多样性降低有三个可能的原因。首先，稀有物种对生态位选择极其严格，它们在群落内丰度较低，任何轻微的干扰都可能导致当地稀有微生物种群的大量灭绝。多年冻土融化引起相当大的干扰，如水文变化和土壤性质的变化可能会导致稀有物种的生态位选择发生变化，最终导致分类α多样性的减少。其次，鉴于稀有物种的竞争能力低于丰富物种，因此多年冻土融化引起的丰富物种大量增加（图3）也可能消除稀有物种，最终导致微生物分类法α多样性下降。第三，保存在原始土壤中的残留DNA可能进一步导致分类学α多样性降低，因为一旦多年冻土融化，失去了土壤矿物的保护，再加上温度降低，残留DNA可能会迅速分解。

我们的研究结果还表明，多年冻土融化后功能基因α多样性增加（图4），融化土壤和原始土壤的功能群落结构显著不同，这进一步支持了我们的第一个假设，即多年冻土融化对微生物功能基因影响很明显。我们还发现许多碳降解基因强度的富集，表明在多年冻土融化后微生物降解不稳定碳和难降解碳的功能潜力增加。微生物功能基因群落的变化主要是由于多年冻土融化后土壤资源可用性的变化。众所周知，土壤微生物是根据“自下而上”的生态力量由土壤资源构成的，资源利用率高，且伴随高微生物丰度和多样性。在原始的多年冻土中，由于冻结状态，大多数土壤资源无法被微生物利用，因此导致微生物功能多样性和基因表达强度较低。在多年冻土融化的情况下，土壤资源的可利用性显著提高使得基因多样性和表达强度急剧增加。除土壤资源外，融化土壤中较高的土壤温度和通气条件的改善也可以刺激微生物的活动，从而增加功能基因的丰度和多样性。

2 多年冻土融化后土壤碳释放与微生物功能基因变化有关，而微生物分类多样性对土壤碳释放的影响不大

我们的研究结果表明，微生物功能基因的丰度和多样性是决定冻土碳释放的重要因素，而微生物分类学的多样性对冻土碳释放的影响不大（图5）。土壤碳释放与微生物基因多样性和分类多样性的对比关系可能归因于这样一个事实:基因是微生物生化功能的基础以及同一微生物基因广泛分布在不同的微生物门中。从而使得土壤微生物群落在物种水平上表现出功能冗余特征。因此，微生物分类多样性的减少对多年冻土融化过程中碳释放的影响不大。

有趣的是，多年冻土融化导致微生物功能基因丰度和多样性增加促进了土壤碳的释放。微生物功能基因在土壤碳释放中的重要作用可以通过其在生态功能方面的表现来解释。众所周知，微生物的功能基因可以调控土壤酶的相应活性，胞外酶是土壤碳分解的直接驱动力。碳降解基因丰度越高，对应的碳分解酶活性越高，从而引起更强的微生物碳矿化作用。更重要的是，更高的功能基因多样性可能通过合成和分泌互补的胞外酶促进各种土壤生物之间的互补效应。由于土壤大分子有机质（例如由纤维素，半纤维素和木质素组成的木质纤维素）的完全降解依赖于一系列酶（包括纤维二糖水解酶，酚氧化酶等）的协同作用，因此这种互补效应可以加速土壤碳的分解。预计多年冻土融化过程中土壤碳的释放将随着功能基因多样性而增加。

尽管本研究全面探究了微生物分类和功能群落对多年冻土融化的响应及其与土壤碳释放的联系，但本研究仍存在一些不足。首先，该研究主要集中在微生物群落对多年冻土融化的短期响应。对多年冻土融化过程中微生物动态及其与土壤碳释放关系的长期观测仍需加强来加深我们对这一问题的理解。其次，土壤碳释放是通过实验室培养实验测定的。还应进行大量的野外检测实验，以增加我们对生态系统功能与微生物群落之间联系的认识。第三，土壤碳释放由许多复杂的过程组成，这些过程涉及到不同的代谢途径，在确定总碳释放量时具有不同的权重。因此，对不稳定或稳定碳库中的碳释放源进行分区，并探讨其与碳降解基因的联系可能是值得进一步研究的重要问题。

本研究提供了以下实验证据：多年冻土融化改变了微生物的分类组成和功能群落，多年冻土碳释放随着多年冻土融化过程中微生物功能α多样性和碳降解基因丰度的变化而增加。这些研究结果对理解多年冻土碳-气候反馈有两个重要的意义。首先，我们的结果表明，多年冻土融化降低了细菌和真菌α多样性，但增加了功能基因α多样性。这一发现表明分类和功能α多样性对多年冻土融化的响应具有明显差异，这意味着多年冻土融化过程中微生物的变化比以前观测到的更为复杂。因此，需要结合多种微生物检测技术以提高我们对微生物在多年冻土融化情景下命运的认识。第二，我们的研究结果表明多年冻土融化后，功能基因而不是分类多样性的变化在二氧化碳-碳释放中起主要作用。这一发现表明，与微生物分类组成相比，微生物功能基因是评估土壤碳释放的较好指标。因此，除了分类组成外，今后的研究还应更多地关注微生物群落的功能，这将有助于我们进一步了解气候变暖背景下微生物对多年冻土碳循环的调控。

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