编译：微科盟yl，编辑：微科盟木木夕、江舜尧。

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帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，不能完全治愈。近年来，肠道微生物群与中枢神经系统疾病的关系日益引起人们的关注。多项临床和动物研究显示PD与健康对照组肠道微生物区系具有差异。短链脂肪酸（SCFAs）是肠道微生物的主要代谢产物，它将肠道微生物群的信号传递给宿主。越来越多的数据显示，SCFAs对调节脑功能和血液组织屏障的完整性有积极的作用。然而，研究发现在PD模型中，SCFAs是加速神经炎症和 α-触核蛋白病的主要调节因子。因此，要寻找微生物群或微生物的衍生物，来治疗或改善PD。骨钙蛋白（OCN）是一种成骨细胞分泌的蛋白，它对脑功能有调节作用。OCN可穿透血脑屏障，老年小鼠外周注射OCN 2个月后，OCN与海马CA3区神经元直接结合，完全恢复小鼠认知功能。在骨重建过程中，肠道微生物区系对成骨细胞和破骨细胞的活性有调节作用。最近的一项发现表明，OCN的血清水平与克罗恩病患者的肠道菌群物种的Chao指数有关，这进一步表明，OCN可能会影响菌群的组成。因此，假设OCN可以通过调节PD小鼠的肠道微生物区系来预防运动损伤和多巴胺能神经元丢失。

1 OCN可预防6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的帕金森病小鼠的运动损伤和多巴胺能神经元丢失

我们首先观察了腹膜内注射OCN在6-羟基多巴胺诱导的PD小鼠模型中的作用。行为测试显示，旷场试验中帕金森病小鼠运动距离、饲养频率显著降低，圆筒试验中左肢接触频率的缺陷，而轮转试验中与对照组相比，6-OHDA诱导的PD小鼠潜伏期减少（图1b）。在PD小鼠的旷场试验和圆筒试验中，持续8周给予4μg/kgOCN可显著改善实验组运动障碍但不影响对照组（图1b）。同时实验检查了OCN是否也对黑质（SN）和纹状体中的多巴胺能神经元起保护作用。6-OHDA注射侧PD小鼠脑内用于识别黑质多巴胺能神经元的酪氨酸羟化酶（TH）免疫染色较对照组减少近70%，而OCN处理可显著阻止PD小鼠多巴胺能神经元的减少（图1c）。与此一致，纹状体的免疫染色和Western blotting也显示出纹状体注射侧的TH阳性纤维和TH蛋白水平显著低于OCN处理后恢复的对照组小鼠（图1d）。然而，给药OCN（40μg/kg）没有显著增加PD小鼠的SN和纹状体中的多巴胺能神经元数量（图1c，d）。4μg/kg OCN干预后，对照组小鼠的SN和纹状体中多巴胺能神经元未见变化。因此，该证据表明，给予4μg/kg的OCN可以预防6-OHDA诱导的PD小鼠的运动障碍和多巴胺能神经元丢失。

图1 OCN给药可预防6-OHDA诱导的帕金森病小鼠的运动损伤和多巴胺能神经元丢失。（a） OCN干预6-OHDA诱导PD小鼠的实验设计。（b）旷场试验、圆筒试验和轮转试验。（c）SN免疫染色TH阳性神经元。（d）纹状体免疫染色和western blotting TH阳性纤维和TH蛋白水平。

2 肠道菌群介导OCN对PD的神经保护作用

为了测试OCN对PD的神经保护作用是否取决于肠道菌群，我们在服用OCN前4周通过使用抗生素消除肠道菌群（图2a）。肠道微生物减少阻断了OCN诱导的运动功能改善，包括旷场试验中小鼠运动距离、饲养频率，圆筒试验中左肢接触频率，以及轮转试验中的潜伏期（图2b）。

此外，我们检查了肠道微生物的损失是否会影响6-OHDA和OCN对PD小鼠多巴胺能神经元损失的影响。SN中TH的免疫染色显示，6-OHDA诱导的多巴胺能神经元损伤不受肠道微生物减少的影响。但在6-OHDA诱导的PD小鼠中，肠道微生物损失阻止了OCN防止多巴胺能神经元丢失的作用（图2c）。纹状体中的免疫染色和蛋白质印迹结果证实了肠道菌群损失对OCN诱导的针对多巴胺能神经元丢失的保护作用有阻断作用（图2d）。

图2抗生素预处理（ABX）阻断了OCN诱导的6-OHDA帕金森病小鼠运动障碍和多巴胺能神经元丢失的改善。（a）6-OHDA诱导PD小鼠的抗生素治疗和4 μg/kg OCN给药的实验设计。（b）旷场试验、圆筒试验和轮转试验。（c）SN免疫染色TH阳性神经元。（d）纹状体免疫染色和westernblotting TH阳性纤维和TH蛋白水平。

为了进一步支持肠道菌群改变介导OCN对PD的神经保护作用的观点，将对照组，6-OHDA组和6-OHDA+ OCN组的粪便菌群移植到了进行了5周的抗生素预处理的小鼠中。粪便移植后两周，我们比较了不同组小鼠的运动功能（图3a）。与FMT_6-OHDA+ OCN相比，FMT_6-OHDA组在极点测试的总下降时间延长了，而轮转测试中延迟明显缩短（图3b）。而旷场试验中小鼠运动距离、饲养频率则没有变化（图3b）。与6-OHDA相比，接受6-OHDA+ OCN微生物菌群小鼠的运动能力改善，这表明肠道菌群可能介导OCN对于PD小鼠运动功能障碍改善（图3b）。因此，抗生素治疗和粪便微生物群移植实验均表明，肠道微生物群是OCN对PD的保护作用所必需的。

图3在肠道微生物区系缺失的小鼠中，PD的微生物区系诱导PD样运动障碍。（a）粪便微生物移植的实验设计。（b）旷场试验、极点测试和轮转试验。（c）在旷场试验中有代表性的痕迹。

3 6-OHDA诱导帕金森病小鼠和OCN治疗帕金森病小鼠肠道微生物区系的变化

通过16SrRNA测序，评估肠道微生物区系的组成。Simpson和Shannon指数在各组间无显著差异，表明6-OHDA或4μg/kgOCN处理对小鼠肠道微生物区系的多样性没有影响，而UniFrac主坐标分析显示6-OHDA诱导的PD小鼠肠道微生物组成与对照组和对照组有显著差异（P<0.05），而6-OHDA和4μg/kgOCN处理组小鼠肠道微生物区系多样性无显著差异（P>0.05）。UniFrac主坐标分析显示6-OHDA诱导的PD小鼠肠道微生物组成与对照组有显著差异（P<0.05），而OCN处理使帕金森病小鼠的微生物群落结构恢复到对照组的水平（图4a）。在热图和维恩图（图4b，c）中，我们发现6-OHDA组的6个分类群与对照组相比发生了显著变化。与对照组相比，6-羟基多巴胺诱导的帕金森病小鼠的Bacteroidetes、S24-7、Rikenellaceae、Erysipelotrichaceae相对丰度显著降低，而Firmicutes、Lachnospiraceae、unclassified Clostridiales 则显著升高。然而，OCN给药显著逆转了帕金森病小鼠的这种变化（图4d）。通过PICRUST功能分析发现，与对照组相比，由6-OHDA诱导的PD小鼠的肠道微生物组产生丙酸能力明显降低，这可以作为K01847 RA降低的证明（图5a）。此外，与丁酸盐生产相关的KO的RAs也发生了变化，K00634含量显著降低，K00074含量显著升高；而K01034和K01035含量没有明显变化（图5a）。与乙酸生产相关的主要KOs的RAs在对照组和6-OHDA组之间没有差异（图5a）。值得注意的是，OCN给药成功地逆转了帕金森病小鼠的这些变化。然而，对照组小鼠的KOs不受OCN给药的影响。因此，OCN的干预可以改变PD小鼠的微生物区系，并可能增加细菌产生丙酸的潜能。

图4 OCN给药对6-OHDA诱导的PD小鼠肠道微生物区系失调的调节作用。（a）一种基于unweighted UniFrac的主坐标分析(PCoA)图。（b）热图。（c）Venn 图。（d）Bacteroidetes 和Firmicutes在门水平及其科水平上的相对丰度。

4 OCN对6-OHDA诱导的帕金森病小鼠粪便丙酸水平的影响

为了进一步研究细菌SCFAs是否发生改变，我们用气相色谱/质谱（GC/MS）分析了粪便中SCFAs的含量。结果显示，6-OHDA诱导的帕金森病小鼠的粪丙酸含量显著低于对照组，而OCN治疗显著逆转了这一变化（图5b）。三组粪便中乙酸盐和丁酸水平没有显著差异（图5b）。OCN给药不影响对照组小鼠粪便中这三种SCFA的水平。此外，相关分析表明，粪便中丙酸水平与S24-7、Rikenellaceae呈正相关，而与Lachnosipraceae、unclassified Clostridiales呈负相关（图5c），而其他两种SCFAs与Pd缺乏的类群S24-7（r=0.4961，P=0.0010）和Rikenellaceae（r=0.5063，P=0.0098）的RAs呈正相关，提示这些微生物的变化可能与粪便丙酸水平的变化有关。更重要的是，粪便丙酸水平与旷场试验、圆柱体试验和转杆试验的运动功能参数呈正相关（图5d）。因此，OCN的肠道微生物介导的神经保护作用可能与其调节6-OHDA诱导的PD小鼠肠道微生物区系丙酸产生潜能有关。

图5 OCN给药可增加6-OHDA诱导的PD小鼠的粪便丙酸水平。（a）揭示了乙酸、丙酸和丁酸酯合成的代谢途径以及相应的KOs和基因以及K01847、K00634、K00929、K00074 相对丰度的条形图。（b）各组粪便中的乙酸、丙酸和丁酸水平的柱形图。（c）热图。（d）丙酸排泄量与运动功能的相关分析图。

5 丙酸和FFAR3激动剂预防6-羟基多巴胺诱导的帕金森病小鼠运动损伤和多巴胺能神经元丢失

为了进一步验证丙酸与帕金森病小鼠运动功能改善的关系，我们给6-OHDA诱导的帕金森病小鼠饮水中加入丙酸钠。与对照组相比，丙酸干预导致6-OHDA诱导的帕金森病小鼠粪便丙酸水平明显升高，但血清丙酸水平无明显变化（图6a）。重要的是，口服丙酸有效地改善旷场试验、圆筒试验中小鼠的运动功能而轮转试验没有得到改善（图6b）。同时，口服丙酸可以阻止帕金森病小鼠大脑注射6-羟基多巴胺侧近40%的多巴胺能神经元丢失（图6c）。丙酸诱导的纹状体TH蛋白水平也显示出类似的变化模式（图6d）。因此，我们推测丙酸可能是肠道微生物区系衍生的信号，有助于帕金森病的发展，并且可能是OCN的靶点。

FFAR3是介导丙酸保护作用的主要受体类型，给6-OHDA诱导的帕金森病小鼠灌胃FFAR3激动剂（AR420626，0.1mg/kg），每天一次，连续8周（图7a）。与丙酸对帕金森病小鼠的影响一样，AR420626的干预有效地增加了6-OHDA诱导的帕金森病小鼠在旷场试验中的饲养次数，但没有显著增加运动距离；显著改善了极点测试和轮转试验中的运动功能，但没有改善圆筒试验的运动功能（图7b）。同时，灌胃AR420626可阻止帕金森病小鼠脑内注射6-OHDA侧20%的多巴胺能神经元丢失（图7c），并恢复纹状体TH蛋白水平（图7d）。因此，FFAR3的激动剂AR420626模拟了丙酸的神经保护作用。我们推测肠道微生物修饰的丙酸可能部分作为FFAR3激动剂，将OCN的保护信号传递给神经系统，以防止PD的发生。

图6口服丙酸预防6-OHDA诱导的PD小鼠的运动障碍和多巴胺能神经元丢失。（a）丙酸盐干预PD小鼠的实验设计。（b）旷场试验、圆筒试验和轮转试验。（c）SN免疫染色TH阳性神经元。（d）纹状体免疫染色和westernblotting TH阳性纤维和TH蛋白水平。

图7在6-OHDA诱导的PD小鼠中，给药FFAR3激动剂防止运动障碍和多巴胺能神经元丢失。（a）FFAR3激动剂干预PD小鼠的实验设计。（b）旷场试验、圆筒试验和轮转试验。（c）SN免疫染色TH阳性神经元。（d）纹状体免疫染色和western blotting TH阳性纤维和TH蛋白水平。

6 肠神经系统可能介导丙酸对6-OHDA诱导的PD小鼠的神经保护作用

由于FFAR3激活改善了PD小鼠的运动缺陷，因此，我们测量了FFAR3在不同组织中的表达。我们发现FFAR3在空肠、回肠和结肠中的相对表达远高于在皮质、海马和大脑纹状体等神经器官中的相对表达（图8a）。由于丙酸通过刺激肠内分泌L细胞释放GLP-1或激活肠神经系统（ENS）将其信号传递到大脑来发挥其作用，我们首先在GLP-1对PD的神经保护作用的基础上测定了血清GLP-1的水平。然而，在帕金森病小鼠和对照组小鼠之间，或者在丙酸治疗的帕金森病小鼠和未治疗的帕金森病小鼠之间，都没有观察到明显的差异（图8b）。然后，为了测试丙酸能否作用于ENS，我们用3 mg/kg顺铂（一种已知的肠道神经毒素）灌胃 6-羟基多巴胺诱导的帕金森病小鼠，使其在服用丙酸前耗尽PGP9.5阳性的肠道细胞。在这些肠道细胞耗尽的小鼠中，我们发现丙酸对多巴胺能神经元丢失的保护作用不再显著（图8c，d）。因此，我们推测丙酸可以作为针对ENS的FFAR3激动剂，对6-OHDA诱导的帕金森病小鼠发挥神经保护作用。

图8肠神经系统介导了丙酸对6-OHDA诱导的PD小鼠的神经保护作用。（a）FFAR3在皮层、海马、纹状体、空肠、回肠和结肠中的相对表达。（b）不同组间血清Glp-1水平的柱形图。（c）SN免疫染色TH阳性神经元。（d）纹状体免疫染色和western blotting TH阳性纤维和TH蛋白水平。

研究结果表明，OCN可通过促进微生物丙酸的产生，激活肠神经元中的FFAR3，从而发挥其对帕金森病的保护作用。利用6-OHDA诱导的帕金森病小鼠模型，证实OCN可以预防帕金森病小鼠的运动损伤和多巴胺能神经元丢失。数据进一步表明，OCN可以通过调节SCFAs的微生物代谢和增加PD小鼠肠道微生物区系丙酸水平发挥保护作用。此外，口服丙酸对帕金森病有保护作用，提示丙酸是帕金森病干预的潜在靶点。数据证实丙酸主要作用于肠神经元中的FFAR3，发挥其对帕金森病的神经保护作用。

多项临床和动物研究调查肠道微生物群失调和帕金森病之间的相关性，结果显示与观察结果不一致。我们的研究在6-OHDA诱导的PD小鼠中发现的肠道微生物群的变化与在鱼藤酮诱导的PD小鼠模型中观察到的相似，而不同的干预和给药途径导致的肠道微生物的变化是不同的。OCN可逆转本研究中PD小鼠的上述微生物改变。此外，由于OCN改善帕金森病小鼠运动障碍和多巴胺能神经元丢失的作用在没有肠道微生物区系的小鼠中减弱，而帕金森病的表型可以通过粪便移植转移，因此认为OCN在6-OHDA诱导的帕金森病小鼠模型中依靠肠道微生物区系发挥神经保护作用。

微生物-肠脑轴最近引起了极大的研究关注，SCFAs可能是关键的信号传递体。最近的一项临床研究显示，与健康对照组相比，帕金森病患者粪便样本中的SCFAs显著降低。无菌帕金森病小鼠口服SCFAs促进了神经炎症和运动功能障碍。然而，尽管PD小鼠改变的KOs同时产生丁酸和丙酸，并被OCN恢复，但粪便中只有丙酸发生了显著变化，这表明在研究中，丙酸可能主导了OCN对PD的肠道微生物区系相关的影响。此外，口服丙酸盐补充研究挽救了帕金森病小鼠的运动损伤和多巴胺能神经元丢失，进一步表明，增加微生物丙酸产量可能在介导OCN在帕金森病肠道微生物区系相关效应中起主导作用。

据报道，丙酸主要由Bacteroidetes产生。我们的结果发现Bacteroidetes，特别是S247和Rikenellaceae与粪便丙酸水平呈显著正相关。此外，在产丙酸的琥珀酸途径中发现了一个变异的KO，与Bacteroidetes、S24-7和Rikenellaceae的RAs呈正相关，这表明这些肠道微生物可能携带编码甲基丙二酰辅酶A变位酶的基因，以调节琥珀酸途径。

我们认为丙酸的剂量和给药方式可能是决定丙酸疗效的重要因素。在这项研究中，我们给粪便丙酸水平降低的小鼠口服200 mM丙酸钠。干预后，6-OHDA诱导的帕金森病小鼠的粪便丙酸水平上升到对照组水平。

据报道，丙酸主要通过两种游离脂肪酸受体FFAR2或FFAR3中的一种发挥作用，广泛表达于多个器官，包括肠内分泌L细胞和外周神经系统。因此，丙酸可以通过刺激肠内分泌L细胞释放GLP-1或激活外周神经系统将其信号传递到大脑来发挥作用。据报道，GLP-1在治疗中度PD方面有临床益处，但在我们的研究中，各组之间血清GLP-1水平没有显著差异，因此排除了GLP-1相关作用的可能性。接下来，为了进一步证明ENS在丙酸对帕金森病影响的调节中的重要性，我们用肠神经毒素来消融肠神经元。消融肠神经元后，丙酸的神经保护作用减弱，提示ENS可能介导了丙酸对6-羟色胺诱导的帕金森病小鼠的保护作用。FFAR3是ENS中唯一的丙酸受体，它被丙酸激活，通过肠脑神经回路诱导IGN。FFAR3激动剂可以模拟丙酸对帕金森病小鼠的神经保护作用，因此FFAR3可能是ENS中丙酸的感受器，丙酸可能通过激活ENS中的FFAR3发挥其神经保护作用。

OCN可改善帕金森病小鼠的运动功能障碍和多巴胺能神经元的丢失，调节肠道菌群和提高丙酸水平可能是OCN对帕金森病神经保护作用的机制之一，神经内分泌的FFAR3可能介导了丙酸对帕金森病的神经保护作用。当然研究存在一些局限性，研究主要显示了OCN对帕金森病小鼠的保护而不是治疗作用。同时在MPTP诱导的PD模型和鱼藤酮诱导的PD模型中，未检测到OCN和丙酸对PD的保护作用。因此，人们需要更深入的研究和临床调查来检验OCN对PD的作用机制。

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