原名：Fecal Microbiota Nutrient Utilization Potential Suggests Mucins as Drivers for Initial Gut Colonization of Mother-Child-Shared Bacteria

译名：粪便微生物营养利用潜能表明粘蛋白可以作为母婴共享菌群在肠道定殖的驱动因素

期刊：Applied and Environmental Microbiology

IF：4.016

发表时间：2021.1.15

通讯作者：Knut Rudi

通讯作者单位：挪威生命科学大学化学与生物技术和食品科学学院

1 宏基因组多样性分析

研究者从500份粪便样本中共计获得了266800000个高质量的测序读数，每个样本的平均测序深度为533600个。在测序的基础上，研究者进一步使用VSEARCH对160万个独特的RMS片段进行了97 %的聚类分析。从RMS片段分布来看，母亲的平均宏基因组大小约为1.5亿bp，而新生儿(胎粪)的平均宏基因组大小约为2000万bp。同时，在婴儿从3个月到12个月的成长期间，其肠道中平均宏基因组从50到7000万bp逐渐递增(图1A)。

该研究发现在产妇之间共有的片段中位数为22%，而与其他任何年龄段的孩子相比，母亲与自己的孩子共享的测序片段并不具有显著差异(P>0.05，Kruskal-Wallis秩和检验)。然而，母婴之间分享的菌群测序片段总体水平随着婴儿年龄的增长而增加，分别从胎粪的5%，3个月和6个月的9 %，增加到12个月的11% (图1B)。而粪便样本中的宿主的DNA含量从胎粪中的高于10%下降至3个月、6个月和12个月时低于1% (图1C)。

图1.基于RMS测序数据的多样性分析。(A)根据特殊测序片段的数量估计的宏基因组大小(假设每个RMS测序片段为2000 bp)。(B)不同婴儿年龄段与母亲共享的测序片段比例。(C) 不同婴儿年龄组包含的宿主DNA片段。图中每个灰点代表一个样本，蓝点代表平均值，误差线代表95% 的置信区间。

此外，研究者通过对RMS片段的分布进行相关性分析，发现母亲样本之间存在明显的聚类情况，而3个月至12个月的婴儿之间的聚类模式则不太明显。同时，在胎粪样本中也未显示明显的聚类模式(图2)。

图2.基于RMS测序样本分布的关联网络分析。图中的每个点代表一个样本，而线条表示具有Spearman正相关性(P <0.05)的样本。样本分别取自新生儿(胎粪)和3/6/12个月的婴儿，而母亲的样本取自妊娠中期。

2 菌群组成分析和营养物质利用潜力分析

Kraken2使用标准的RefSeq数据库对所有样本的RMS片段进行了72%的分类分析，而通过定制的HumGut数据库对391个物种的RMS片段进行了82%的分类分析。研究发现，新生儿(胎粪)和3月龄的双歧杆菌相对增加，从6月龄到12月龄呈下降趋势(图3)。肠道中Bifidobacterium的相对丰度在新生儿(胎粪)到婴儿3个月龄之间逐渐增加，而从婴儿6个月到12个月龄过程中则呈下降趋势(图3)。此外，随着肠道中Bifidobacterium丰度的减少，Lachnospiraceae的相对丰度有所增加。此外，研究者发现肠道中Bacteroides的相对丰度在所有年龄组中均较高。

图3.母亲和不同年龄段婴儿肠道微生物的相对组成分析。不同年龄组：胎粪(新生儿)、3个月、6个月和12个月婴儿以及相应母亲样本的相对丰度用不同的颜色表示。

总体而言，细菌对单糖和复合糖的营养利用潜力最高，而对氨基酸的养分利用潜力最低。而婴儿从3月龄开始，肠道菌对复合糖的利用潜力呈上升趋势，而对黏液来源的糖份的利用潜力则呈下降趋势(图4)。

图4.母亲和不同年龄段婴儿的碳源利用分析。条形图表示来自VMH数据库的基于细菌种类的潜在碳源的相对丰度。其中，碳源分为五类：单糖、复合糖、假定粘液、氨基酸和混杂碳源，不同年龄段分别用不同颜色表示。

3 年龄因素相关分析

基于子代的年龄和母亲样本的分组可以解释细菌种类组成的6.9%的方差(analysis ofvariance-simultaneous component analysis, ASCA-ANOVA,P<0.0001)。上述分析共发现有3个主要影响因素，第一个因素与年龄增长有关(图5A)。而在物种水平上，肠道中Escherichia coli和Bifidobacterium longum的相对丰度与新生儿的关联性最强，而Coprococcus comes和Coprococcus catus的相对丰度则与婴儿的年龄和母亲样本量的增加显著相关。此外，在属水平上，肠道中Bifidobacterium, Enterobacter和Citrobacter的相对丰度与婴儿的年龄有关，而Ruminococcus 和Alistipes的相对丰度与与母亲的样本量有关(图5A)。第二个因素与12个月大的婴儿肠道中的细菌丰富有关，其中与Lachnospiraceae的相关性最为显著(图5B)。第三个因素表明Bifidobacterium的丰度与3个月至6个月大的婴儿样本量有关(图5C)。

图5.不同年龄段人群与肠道微生物的相关性分析。通过ASCA-ANOVA分析确定了年龄组和微生物之间关联性的前三个主成分。第一主成分(A)解释了64.8%的差异性，第二主成分(B)解释了23.8%的差异性，第三主成分(C)解释了8.4%的差异性。上图表示不同样本的得分，而相对应的下图则表示不同分类组的重要性。

此外，研究者发现细菌对营养物质利用的潜力存在显著的年龄相关差异，并确定了与碳源利用潜力相关的两个主要年龄相关的影响因素。第一个因素主要表现在婴儿在3个月龄时，其菌群负荷与糖和低聚糖摄入有关(图6A)。第二个因素主要与年龄构成有关，其中饮食多糖与年龄增加有关，而混合碳源、单糖和黏液液与年龄较低有关(图6B)。

图6.不同年龄段与碳源利用之间的关联。通过ASCA-ANOVA分析确定各年龄组与肠道微生物之间的关联性。两个首要主成分的分析结果分别显示在图A和图B中。对于上述两个主成分，上图表示样本的得分，而对应的下图则表示不同分类组之间具有最高和最低负荷的10个变量的重要性得分。

4 母婴关联分析

通过方差分析（ASCA-ANOVA），研究者发现来自同一对母婴(母亲，怀孕18周；婴儿胎粪，3个月，6个月和12个月)的样本可以解释所有年龄组细菌组成差异的21.1% (P=0.005)。而进一步通过Kruskal-Wallis秩和检验，发现有49种细菌具有显著的母婴之间关联性，其中33.3%属于Bacteroides。同时，有5种细菌(4种Bacteroides和1种Parabacteroides)在母婴之间有显著的共享性(P<0.05，卡方检验)，并且该显著性可以持续至婴儿6个月龄，而在12个月龄时则并没发现具有上述关联 (图7)。

图7.母婴之间关联细菌。橙色代表母亲样本呈阳性的婴儿的比例除以每个年龄段所有母婴关系样本数的总比例。蓝色代表每个年龄段的总体比例。星号表示卡方检验的显著性水平；*, P< 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001; ***, P < 0.0001。

与此同时，研究发现产妇的分娩方式可以解释样本总体微生物组成差异的1.7% (P=0.0001，ASCAANOVA)。其中，产妇肠道中Bacteroides fragilis的相对丰度与阴道分娩的相关性最强，其次是Bacteroides thetaiotaomicron和Bacteroides uniformis。而在与剖宫产相关的肠道细菌中，Enterococcus faecalis和Bifidobacterium breve的相关性最强。

母婴关系可以解释细菌对碳源利用潜力差异的30.6%，而分娩方式可以解释上述差异的3.1% (ASCA-ANOVA，P<0.001)。母婴相关性和阴道分娩方式的细菌负载量之间存在较强的正相关关系(Spearman rho=0.89，P<0.0005)，其中黏液蛋白是阴道分娩婴儿中母婴相关细菌最重要的影响因素(图8)。

图8. 对影响母婴关系和分娩方式之间重要的营养成分的相关性分析(x轴)。其中，营养成分利用的重要性通过ASCA-ANOVA分析确定。该图说明了不同营养素在y轴和母婴相关性(mother-child associations，MC)和分娩方式(delivery mode，DL)上的负荷。

5 饮食相关分析

基于母乳喂养和固体食品和乳制品的问卷资料，研究者调查了膳食摄入量与肠道微生物组成及细菌对营养物质利用潜力之间的关系。总体而言，在整个数据集中，该研究只发现Citrobacterfreundii的组成和与母乳喂养6个月之间存在显著的相关性 (P<0.05)。因此，研究者分别分析了婴儿6个月的粪便样本，以及6个月的母乳喂养信息。偏最小二乘判别分析(Partial least-squares discriminant analyses，PLSDA)对6个月龄的母乳喂养的婴儿肠道菌群物种组成的预测精度为0.69(交叉验证)，而对营养物质利用潜力的分类精度为0.66。回归分析显示，肠道中E. coli 和Bifidobacterium longum的丰度与母乳喂养的相关性最强，而B. uniformis和B. fragilis与婴儿在6个月时缺乏母乳喂养有关(图9A)。此外，在细菌对碳源利用潜力方面，母乳喂养与海藻糖的相关性最强，而缺乏母乳喂养与糖原的相关性最强。

图9.与婴儿在6个月时母乳喂养的偏最小二乘(partial least-squares，PLS)判别分析相关的回归系数。(A)物种组成和(B)碳源的协同效应，箭头表示关联的方向。

相关研究表明，在小鼠模型中Bacteroides可以诱导肠上皮细胞产生粘蛋白，作为其自身的营养来源。在本研究中，研究者发现肠道中的粘蛋白作为营养物质对于母婴相关肠道菌群之间的传播是十分重要的。因此，上述研究表明宿主的主动选择可能是确保母婴之间菌群传播的一种潜在机制。肠道中母婴之间的相关细菌主要有B. vulgatus，B. thetaiotaomicron以及 B. fragilis，而上述细菌均表现出对粘蛋白的降解能力。因此，母婴之间的直接传播结合宿主的主动选择可能是确保肠道特定细菌从母亲传播给婴儿的一种潜在机制。

研究发现日常摄入的果胶、菊粉和普鲁兰多糖等饮食成分是与儿童年龄相关的主要因素，这表明日常饮食是成年人肠道微生物态平衡形成的主要驱动因素。有趣的是，目前普鲁兰多糖通常用于可食性的薄膜添加剂中，但其在使用过程中对对宿主肠道菌群的影响尚不清楚。另一方面，众所周知果胶可以显著调节肠道微生物组成，而菊糖的摄入则能刺激Faecalibacterium prausnitzii的繁殖，而Faecalibacterium prausnitzii则是成人肠道中含量最丰富的细菌之一。

对于肠道菌群与宿主年龄相关的定殖模式，该研究发现，在婴儿12个月时肠道中Alistipes的丰度显著升高同时Lachnospiraceae的丰度则显著降低，而Alistipes和Ruminococcaceae与怀孕中期的孕妇之间有很强的相关性，这表明与Lachnospiraceae相比，上述细菌在婴儿肠道中的定殖时间相对延迟。与此同时，研究者发现在12个月大的婴儿和孕期中期的母亲之间，肠道中Alistipes的丰度差异最为显著。而相关研究证实，在儿童中，肠道中Alistipes的丰度与腹痛具有相关性，而在成年人中，肠道中Alistipes的丰度升高可以显著增强粘膜屏障，因此其被认为是对宿主有益的。

该研究与之前在TEDDY等研究和BBC等相关研究中发现的母婴相关Bacteroides及其与阴道分娩之间关系具有一致性。上述发现表明，母婴之间的菌群可以发生早期的传播，并且菌群在肠道中的定殖发生在第一次排出大便之前，很可能是发生在羊膜破裂之后。

在婴儿6个月大之前，来源于母亲的不同种类的Bacteroides可能会对婴儿后续的免疫发育产生显著影响。研究者在之前的研究中已经证实，B. fragilis在肠道中的定殖而非E. coli与IgE的致敏性有关。与此同时，在一项针对芬兰和爱沙尼亚儿童的研究中发现，肠道中Bacteroidesovatus的丰度与I型糖尿病之间具有显著的关联。而最近的一项研究表明，B. vulgatus可以预防Vibrio cholerae诱发的感染。此外，其他几项相关的研究也报道了Bacteroides对宿主免疫功能调节的重要特性。该研究报导的肠道中Bacteroides的丰度升高，尤其是B. vulgatus的丰度升高与最近对所有公开可获得的人类肠道微生物的测序文库进行的meta分析结果相一致。

在该研究中，肠道微生物组成和功能与研究涉及的问卷数据的关联性较弱。总体而言，研究者仅发现C. freundii的丰度与婴儿6个月时的母乳喂养有显著的关联。然而，当只使用婴儿6个月时的数据来预测母乳喂养时，研究者发现E. coli 和B. longum都具有正相关关系，而B. uniformis 和 B. fragilis则具有负相关。上述结果与之前发现母乳可以选择性促进Bifidobacteria，同时Bifidobacteria可以抑制Bacteroides的研究结果相一致。

就细菌对营养物质的利用潜力而言，海藻糖与婴儿6个月时母乳喂养的相关性最强。然而这种联系很难用现有的研究结果来解释。研究者推测其中一种可能的原因是海藻糖是条件致病性真菌的重要组成部分。因此，海藻糖的降解可能代表了母乳筛选细菌对真菌病原体感染的潜在保护作用。然而，上述推测还需要进一步的进行实验验证。

综上所述，该研究结果证实了一种母婴间菌群的传播模式，即宿主来源的碳源可以确保最初的母婴间的细菌传播，而膳食纤维选择了类似成人的肠道细菌。此外，膳食多糖与成人肠道菌群具有相关性的事实支持了上述结论，即饮食中膳食多糖的摄入可以通过驱动肠道微生物利用膳食中的碳源而不是黏膜中的碳源来保护肠道黏膜屏障。