1 物理化学性质

测定了6个采样点镉(Cd)、铅(Pb)、砷(As)、铬(Cr)、锌(Zn)和铜(Cu)的含量。平均浓度分别为0.69 mg/kg(Cd)、164.72 mg/kg(Pb)、302.73 mg/kg(As)、283.80 mg/kg(Cr)、220.42 mg/kg(Zn)、1075.97 mg/kg(Cu)。根据《中国土壤环境质量标准》，Cd、Pb、As、Cr、Zn、Cu的环境质量标准分别为0.20 mg/kg、35.00 mg/kg，15.00 mg/kg，90.00 mg/kg，100.00 mg/kg和35.00 mg/kg。因此，该尾矿中6种重金属浓度均高于我国的土壤环境质量标准。此外，重金属含量也因场地而异。基于6种重金属浓度的聚类分析表明，Z108、Z118、Z119与Z109、Z110、Z111在不同的分支上聚类(图2)。

图2 (A) 6个样品的重金属浓度。(B) 基于重金属浓度对6个样品进行聚类分析。

2 宏基因组测序、编译和基因预测

宏基因组测序产率≥4.55×10⁷，每个样品碱基对≥6.84G。对保留长度>500 bp的片段进行进一步分析。每个样品序列组合一共为366946 (Z108)、100238 (Z109)、72483 (Z110)、69650 (Z111)、295580 (Z118)和759 (Z119)。预测编码序列(CDS)，共发现1.777×10⁷条长度≥100 bp的功能基因。这些功能基因的总长度为1087.1 Mb。本研究获得的序列提交到NCBI数据库中，登录号为SRP149954。

3 微生物群落组成

宏基因组数据预测的功能基因划分为7个分类级别，来揭示微生物群落组成。其中有些功能基因不能归类到已知的微生物中。这种情况的原因可能是由于大量的微生物还不能被培养。所以，这些未培养的微生物的基因组数据在分类注释的数据库中不存在。在门的水平上，铜矿尾矿中的微生物主要为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、广古菌门(Euryarchaeota)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)。虽然所有的样品中都能看到这种优势门，但每个样品中最丰富的门的数量都有所不同。比如，6个样本中，其中的3个(Z118、Z110和Z111)，变形菌门似乎是数量最多的门。但是，在样品Z108和Z119中，变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度略低于放线菌(Actinobacteria)。而对于样品Z109，优势门似乎是广古菌门(Euryarchaeota)，为了进一步阐明6个样品微生物组成的差异，采用Bray-Curtis方法进行聚类分析。根据门类水平上前20种已知微生物的相对丰度，可以将6个样品可以聚类为两组(图3A)。

图3 6个样品的聚类分析(A)基于门水平微生物组成的相对丰度。(B) 基于KEGG Orthology (KO)条目。

4 功能组成

6个样本的基因功能通过KEGG数据库进行注释。KEGG同源性分析(KO)最丰富的条目是K00059，定义为3-氧酰基-[酰基载体蛋白]还原酶。3-氧酰基[酰基载体蛋白]还原酶参与脂肪酸的生物合成途径，还与灵菌红素(prodigiosin)、生物素(biotin)等次生代谢产物的合成和代谢有关。在数量最多的20个KO条目中，发现了和ABC转运系统相关的基因macB (K05685)、livK (K01999)和livG(K01995)。这些与转运系统相关的蛋白可以调控重金属和抗菌药物等不同类型化合物的导入和输出。为了评价6个样本的基因功能差异，对六个样本的前20个丰富的KO条目进行层次聚类。六个样本全部被分为两组(图3B)。同样，基于功能成分的样品的聚类模式与理化性质和微生物组成的聚类模式一致。

5 HMRGs和ARGs概述

在本研究中，利用基于高通量测序的宏基因组学方法来分析这个铜矿尾矿中的HMRGs和ARGs。所有2.104×10⁶个编码序列(CDS)中的预测氨基酸序列，与BacMet和CARD数据库中的蛋白序列进行比对。通过对BacMet数据库的比对，在6个样本中共识别出76个HMRGs(图4)。在这些基因中，merA丰富度最高，其次是actP。汞还原酶是一种由merA基因编码的酶，代表细菌对汞的抗性。除actP基因外，该尾矿宏基因组中还发现了copA、ctpV、cueA、cusR等多种类型的铜抗性基因，这些基因都参与了铜的转运。此外，本研究还观察到尾矿中与它重金属抗性相关的HMRGs。比如耐锌基因baeS、mdtB、mdtC，耐镉基因arsB、arsM、pstB、pstC，耐铬基因ruvB、chrF，耐铅基因pbrA，与镉、锌抗性均相关的基因actR、zntA。和CARD数据库对比时，根据宏基因组学数据一共预测了194个ARGs(图5)。ARGs丰富度最高的(194个中有35个，18.04%)是RNA聚合酶的抗利福霉素β亚基(rpoB2)。在AMR基因科水平中，耐结核细胞分裂(RND)抗生素外排泵是最常见的类型。63个RND抗生素外排泵基因可进一步分为13种不同类型，其中muxB最多，其次是mtrA和mdtC。对药物类别来说，所有194种ARGs均显示出对十种不同药物的抗性，包括利福霉素(rifamycin)，糖肽(glycopeptide)，氨基香豆素(aminocoumarin)，大环内酯(macrolide)，氟喹诺酮(fluoroquinolone)，氨基糖苷(aminoglycoside)，四环素(tetracycline)，头孢菌素(cephalosporin)，肽(peptide)和磺酰胺(sulfonamide)(图5B)。其次是糖肽(glycopeptide)耐药基因(48个)，其次是氨基香豆素(aminocoumarin)耐药基因(38个)和大环内酯(macrolide)耐药基因(31个)。同时本研究还观察到与一些临床重要抗菌素耐药相关的ARGs，比如四环素抗性基因tet(C)和otr(A)，这两个基因分别编码MFS抗生素外排泵和四环素耐药核糖体的保护蛋白。arr-1、rpoB2、rbpA、rphA和rphB等54个耐药基因总数高于其他抗菌素(图5B)。从机理来看，在尾矿中抗生素外排是最主要的类型(图5C)。

图4 6个铜尾矿样品中重金属抗性基因(HMRGs)。用Circos软件画出圆形可视化图。当在某个样品中发现某个HMRG时，就会绘出链接。

图5 铜矿尾矿中微生物抗性基因(ARGs)。(A)不同ARGs类型的数量。(B)针对不同药物类别的ARGs数目。(C)不同抗性机制的ARGs数量。

1 尾矿中重金属浓度

尾矿污染是对环境的严重威胁。矿山尾矿对周围环境的负面影响主要是由于重金属污染，如铜、镉、铅、锌等。暴露在这些有毒重金属当中会影响当地居民的健康。本研究中从铜矿尾矿中提取的样品中，几种重金属的浓度都超过了国家土壤环境质量标准。六个样品的砷(As)浓度均超过国家三级标准水平3 ~ 16倍左右。六个样品中铜的含量均超过国家三级标准，Z118和Z119两个样品的镉含量超过国家三级级标准，铬和铅都超过国家一级标准，其中Z108 和Z118的铬样品以及Z119的铅样品超过国家三级标准。Z108、Z118和Z119样品的Zn含量高于二级标准。应注意的是，本研究尾矿中Cu (129.17 ~ 2125.28 mg/kg)和Zn (75.56 ~ 486.39 mg/kg)的浓度高于其它铜矿尾矿。根据前期研究，中国北方某铜矿尾矿中Cu和Zn的浓度分别为122.10—338.00 mg/kg和33.44—89.23 mg/kg。罗马尼亚废弃铜矿尾矿中Cu和Zn含量分别为34.11—1048.17 mg/kg和61.35—141.23 mg/kg。高浓度的重金属含量加重了附近环境和暴露在尾矿中生物的负面影响。所以，急需探索出一个可持续的解决方案来减少尾矿影响及恢复该地区生态系统平衡。

2 尾矿中的ARGs

前人对矿山尾矿的研究主要集中在重金属污染上，但是另一种新兴污染物ARGs也应引起重视。ARGs对公众健康构成严重威胁，研究表明，每年抗菌素耐药性细菌感染可能导致数十万人死亡。虽然有人认为抗菌药物是耐药性发展的主要驱动力，但是有文献证明金属也可能对耐药性有促进作用。例如，对细菌LSJC7的研究表明，As、Cu和Zn的存在可以诱导其对四环素产生耐药性。矿山尾矿中的重金属可能是ARGs的储存库，所以对尾矿中ARGs进行分析对监督和监测新兴污染物具有重要意义。本研究采用宏基因组学方法，对德兴铜矿尾矿中ARGs的发现和多样性进行记录。一共有194个被标注为rpoB2的ARGs((图5A)。根据CARD数据库的注释，样本中所有的rpoB2基因都来自诺卡氏菌属(Nocardia)，诺卡氏菌属(Nocardia)是土壤中发现的革兰氏阳性环境细菌。rpoB2基因在诺卡菌种中的分布广泛说明它与利福霉素耐药性的表型相关。所以，样品中rpoB2基因的丰度高可能是因为诺卡氏菌的丰度高。根据世界卫生组织(WHO)所示，喹诺酮类(quinolones)、第三代和第四代头孢菌素(cephalosporins)、大环内酯(macrolides)、酮内酯(ketolides)以及糖肽(glycopeptides)是至关重要的抗菌素，应被给予重视。需要注意的是，ARGs对我们样品中的所有重要的抗菌剂表现出耐药性(图5B)。对于喹诺酮类药物(quinolones)，在矿尾中观察到几种ARGs如arlR、acrB、oqxB、mexF、ceoB和adeF，这些基因与抗生素外排泵或膜转运蛋白的合成有关，使细菌对喹诺酮类药物(quinolones)产生耐药性。该尾矿中还发现头孢菌素(Cephalosporin)抗性基因blaCTX-M-125。这个基因首次在食用动物分离的大肠杆菌中被鉴定，属于blaCTX-M类群。应注意的是，编码β-内酰胺酶的blaCTX-M组基因可以从自然宿主的染色体跳到质粒上。此外，本研究检测到四环素tetracycline耐药基因tet(C)，该基因通常存在于质粒中，编码四环素外排泵，使细菌对四环素产生耐药性。因此，这些移动的ARGs存在促使我们对尾矿进行进一步监视，来控制传播的可能性。

3 样品间的重金属含量、HMRGs、ARGs差异

本研究中，虽然所有样品都来自于一个铜矿尾矿，但样品之间的重金属含量存在差异((图2)。其中的原因可能与尾矿中采矿废弃物的长期堆积有关。记录显示，这个尾矿从1984年12月开始用于废石存储。不同地点存放的时间可能不同，导致金属成分不同。许多研究表明重金属含量会影响微生物组成和抗性基因的丰度。为了验证这一点，研究人员用聚类分析的方法比较了样本之间的重金属差异，结果表明这6个样本被聚类为两组(图2B)。其中Z109、Z110和Z111组的Cu含量显著高于Z108、Z118和Z119组(P=0.014)。而Z108、Z118、Z119的Zn (P=0.036)和Cd (P=0.040)含量均高于其它3个样品。根据已知的前20个微生物在门水平上的相对丰度，将6个样品分为两类(图3A)。基于微生物组成的聚类模式与基于重金属性质的聚类模式一致。另外，我们对两组(第1组包括样品Z108、Z118和Z119，第2组包括试样Z109、Z110、Z111)抗性基因的差异进行了评估。如图6所示，共发现7个HMRGs和5个ARGs在两组间存在显著性差异。在这些基因中，与Zn、Cd抗性相关的基因mdtB和actR在第1组中丰度较高。所以，第1组样品中Zn和Cd含量较高(图2A)。这些结果进一步说明金属对微生物群落组成和抗性基因的形成有影响。

图6 6个样品抗性基因比较。(A) HMRGs相对丰度的差异。(B) ARGs相对丰度的差异。第一组包括Z108、Z118、Z119样品。第2组样品包括Z109、Z110和Z111。只有P<0.05和LDA>2.0被出示。

本研究以中国最大露天铜矿尾矿为研究对象，对重金属含量、微生物组成和抗性基因进行了研究。镉、铅、砷、铬、锌、铜等重金属含量均高于我国土壤环境标准，并通过宏基因组学分析发现与6种重金属抗性相关的HMRGs。此外，还发现对几种重要的抗菌素产生耐药性的ARGs，比如喹诺酮类(quinolones)，头孢菌素类(cephalosporins)，大环内酯类(macrolide)，酮内酯类(ketolides)和糖肽(glycopeptide)。本研究对该铜矿尾矿中的微生物和耐药性进行了综述，为进一步监测和修复该铜矿尾矿奠定了基础。

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