1 资料说明

2015年4月至2016年2月，我们从太湖北岸收集了16个蓝藻群体颗粒(CAs)样品，在此期间，蓝细菌完成了一轮完整的消长（表1）。所有样品均进行16S测序、宏基因组测序（MG）、和宏转录组测序（MT），以检测细菌群落组成、功能潜力、以及基因的表达情况。Illumina MiSeq测序相应地生成了424 Mb的16S rRNA基因扩增子序列数据、122 Gb的高质量MG序列数据、和160 Gb的高质量MT序列数据。这是迄今为止获得有关CAs的最大数据集之一。这16个CAs样本覆盖三个时期，分别是：藻华爆发前期-3个样本、爆发中期-10个样本、以及爆发后期-3个样本（表S1）。鉴于三个时期的样本量不均衡，在后续分析中我们做了相应的校正。

图1.蓝藻群体颗粒CAs中微生物类群和功能结构的动态变化。

（A）基于16S、宏基因组MG和宏转录组MT测序的微生物在门水平的相对丰度。

（B）三个时期的微生物α多样性、平均rRNA拷贝数和总氮含量。

（C）三个时期基因和转录子的比较。

（D）三时期两两比较下，物种丰度差异显著的SEED功能子系统。

2 蓝藻群体颗粒CAs中微生物类群和功能结构的动态变化

在16S测序结果中发现的最丰富的细菌门为蓝细菌门（Cyanobacteria，47.6±5.8%）、变形菌门（Proteobacteria，26.8±5.2%）和拟杆菌门（Bacteroidetes，20.8±5.6%）。类似结果在MG和MT数据集中也可发现，其中16S和MG结果的相关系数为0.695、MG和MT结果的相关系数为0.854、16S和MT结果的相关系数为0.907，这表明所得数据集质量较优（图1A）。根据三个时期的OTUs丰度计算了α-多样性相关指标，结果表明爆发前期的α-多样性最高（图1B）。而爆发前期和中期样品的16S rRNA操纵子拷贝数和总氮水平相当。相比之下，爆发后期样品的α-多样性最低，但16S rRNA操纵子拷贝数和总氮水平最高，这与资源拷贝数理论（“更多资源，更多拷贝数”）和资源比率理论（“更多资源，更低多样性”）一致。

比较CAs的微生物组成发现，有50个OTUs，456个基因和37个转录子的丰度在三个时期达到差异显著（ANOVA，P <0.05）（表S2）。利用KEGG数据库对这些基因和转录子进行功能注释，结果表明，三个时期之间的差异主要由氮、磷的代谢和转运蛋白造成（图1 C）。基于SEED数据库的注释表明，与中期相比，爆发前期ABC转运蛋白、脂肪酸，烷基膦酸酯和单糖的表达上调（图1D）。而在爆发中期与光合作用相关的子系统相关基因表达上调，例如电子传递和光合磷酸化，NAD和NADP，光捕获复合体和四吡咯。在爆发后期限制性修饰系统相关基因表达上调。

图2.影响微生物类群和功能变化的环境驱动因子。与八大环境因子相关的分类单元(OTUS)和功能(基因和转录子)的组成（偏曼特尔分析）。右侧的颜色梯度表示Spearman的秩相关系数，正值(蓝色)越多，正相关性越强，负值(红色)越多，负相关性越强。星号表示Spearman秩相关系数的显著性水平(双尾检验)。** P <0.01和* P <0.05。通过ANOVA检验(FDR <0.05)分析三个阶段中丰度差异最显著的前30个OTU、基因和转录子，并使用Benjamini和Hochberg多重检验法校正P值。

3 微生物类群和功能结构变化的环境驱动因素

为了确定地理因素除外的CAs群落组成的环境驱动因素，我们通过偏曼特尔检验将校正地理距离后的微生物群落与主要环境因子进行了相关分析（图S1）。结果表明，水温（WT），总氮（TN），总磷（TP），化学耗氧量（COD），溶解氧（DO）和铵态氮（NH₄^+-N）与CAs的OTUs丰度相关（r > 0.25，P<0.05）；TN、TP和COD与CAs的基因丰度相关；TN，TP和DO与CAs的转录子丰度相关。结果得到了在三个时期中丰度差异最大的前30个OTUs、基因和转录子及其相关的环境驱动因素。在前30个OTUs中，有27个至少与8大环境因子其1有显著的相关性（校正后P <0.05），并且将近一半（58％）是正相关关系（图2 A）。值得注意的是，有11个噬纤维菌科（Cytophagaceae）的OTUs与TP和TN呈正相关。在前30个基因中，有18个至少与8大环境因子其1有显著的相关性（校正后P <0.05），并且几乎所有（96％）是正相关关系（图2 B）。参与膦酸酯转运的基因K02043（r= 0.747，校正后P <0.01）和参与磷酸酶生物合成的基因K06269（r= 0.679，校正后P <0.01）与TP密切相关。在前30个转录子中，有14个至少与8大环境因子其1有显著的相关性（校正后P <0.05），并且几乎所有（95％）是正相关关系（图2 C）。一些亚基核糖体蛋白相关基因（如K02866，K02938，K02297和K02921）与TN高度相关（校正P <0.01）。这些结果表明，TN和TP显著影响CAs细菌群落的类群和功能结构。

图3.基因组组装图(MAGs)。（A）78个非冗余MAGs的系统发育树。该树使用UBCG生成，Evolview绘制。标签显示带有样品名的MAGs的名称，颜色表示MAG所属的类别。19个MAGs被标记黄星，表示其丰度在三个时期差异显著。（B）MAG（151,222.71.fa）的代谢途径。其具多样化的膜转运蛋白（在膜上以椭圆形表示）和代谢途径，包括鞭毛生物合成途径（黄色），氮代谢-硝酸盐转化为氨途径（绿色），硫代谢-硫代硫酸盐转化为硫酸盐途径（红色），脂肪酸代谢-乙酰辅酶a转化为棕榈酸（橙色），氧化磷酸化放能途径-将ADP和无机磷酸Pi通过呼吸电子传递链合成ATP（蓝色）。

4 基因组组装图和蓝细菌菌株

我们构建了233个基因组组装图（MAGs），其完整性≥60%，污染度小于10%，其中161个是高质量基因组图，其完整性≥70%且污染度<5%。根据≥70%的FastANI值对高度相似的MAGs去重，最终合并成78个非冗余MAGs及其系统发育树（图3 A）。其完整性、污染程度、长度、注释和相对丰度在表S3展示。在三个时期中有19个MAGs的相对丰度差异达到显著（P <0.01）（图S2）。丰度最高的MAG是151222.71.fa，其代谢途径如图3B所示。MAG-151222.71.fa具有多种能量代谢系统，如氮代谢途径-将硝酸盐转化为氨，硫代谢途径-将硫代硫酸盐转化为硫酸盐，脂肪酸代谢途径-将乙酰辅酶A转化为棕榈酸，氧化磷酸化放能途径-通过呼吸电子传递链将ADP和无机磷酸合成ATP；其还有具有丰富的氨、磷酸盐、氨基酸、肽、糖和几种金属元素（如铁，镍，钴和镁）的转运蛋白；其还有鞭毛生物合成途径来合成鞭毛，以提高粘性环境中的运动能力。

我们通过分箱构建了22个高质量的蓝细菌MAGs。针对这些基因组以及NCBI中公开的蓝细菌基因组，最终构建了基于细菌核心基因集的系统发育树（图S3）。系统发育树中MAGs分为3组。组1由2个的MAGs构成，与铜绿微囊藻（Microcystis aeruginosa）靠近，中心基因组是与Microcystis aeruginosa.NIES-88相似的MAG150402.41.fa（核酸-核酸杂交DDH=12.9±2.7%）。组2与Dolichospermum flos-aquae靠近，中心基因组是与Dolichospermum flos-aquae.CHAB-1629相似的MAG150608.59.fa（DDH=18.4±2.4%）。组3与Pseudanabaena yagii靠近，中心基因组是与Pseudanabaena yagii GIHE-NHR1相似的MAGs 150514.75.fa（DDH=17.1±3.3%）。虽然组1中150402.41.fa和160119.54.fa两个菌株在系统发育树中接近，但它们的代谢却截然不同，包括能量通路（氮代谢，硫代谢和光合作用）、转运蛋白和原核生物防御系统（图4）。另外，它们都具有以下模块：M00145（NAD（P）H）、M00163（光系统I）、M00161（光系统II）和M00616（硫酸盐-硫同化）。但是，150402.41.fa具有额外的硫代谢模块（M00596：异化硫酸盐还原、M00176：同化硫酸盐还原），而160,119.54.fa具有额外的氮代谢模块（M00531：同化硝酸盐还原、M00615：硝酸盐同化）。与组1相比，组2和组3的能量通路的多样性则相对较低（图S4）。这三个组均具有原核生物防御系统，如三个CRISP相关蛋白（Csm1，Cmr3和Cmr4）。此外，三个蓝细菌MAGs的转运蛋白也大不相同（图4和图S4）。

图4.组1中的两个蓝细菌的基因组图。组1中150402.41.fa与160119.54.fa两个蓝细菌菌株在系统发育树中局距离较近，但其在能量通路(如氮代谢、硫代谢和光合作用)、膜转运和原核生物防御系统等代谢方面差异较大。

5 氮磷通过共通路驱动微生物变化

氮和磷酸盐与微生物的分类和功能变化密切相关。在三个时期的MG和MT数据中均得到了与磷酸盐和氮代谢的相关基因，其中爆发中期的基因丰度最高（图S5）。为了明确哪些微生物包含这些基因，我们对蓝藻群体颗粒（CAs）进行了功能分析，以捕获参与氮和磷循环的细菌。结果发现有18个物种参与了氮循环并形成了一个复杂的共通路（图5和表S4）。首先，除Bosea sp RAC05和Bosea_vaviloviae物种以外的主要蓝细菌将胞外亚硝酸盐和硝酸盐转运到细胞内。在爆发前期，主要物种是两个包含K15577基因的Bosea；在爆发中期，主要物种是四个包含K15578基因的Microcystis；在爆发后期，主要物种是包含K15576 的Dolichospermum compactum和Aphanizomenon flos aquae。许多物种如两个Bosea、三个Aeromonas和一个Betaproteobacterium还参与了硝酸盐异化还原为铵（DNRA）路径。其次，Dolichospermum compactum和两个变形杆菌属—Sulfuricurvum sp PD MW2和Aphanizomenon flos aquae可通过固氮路径将大气中的氮转化为氨。最后，蓝细菌及其附生细菌都可参与铵的转化路径。这些结果表明，蓝细菌及其附生细菌形成了一个共氮通路作为其不同功能交互的纽带。相似机制也出现在磷循环中（图S6）。参与磷代谢的主要物种是Microcystis、Aphanizomenon和Dolichospermum；此外，Sandarakinorhabdus、Betaproteobacterium AAP51、Porphyrobacter sp TH134和 Phenylobacterium spHYN0004也参与形成磷转化路径；它们共同构成与蓝细菌磷循环的功能纽带。

图5.参与共氮循环功能通路的细菌。椭圆表示蓝藻群体颗粒CAs中氮的形态。浅蓝色的长方形代表了CAs中与氮循环相关的功能基因，旁边的条形图表示参与此功能的细菌。

1 蓝藻群体颗粒(CAs)的微生物类群和功能发生较大改变

CAs微生物群落随季节明显变化，包括以往研究中蓝细菌属的演替以及CAs附生细菌的变异。我们的结果显示，藻华爆发前期和后期富集了四个Dolichospermum的OTUs，而中期则富集了Microcystis，这表明了蓝藻优势属随季节变化而出现交替。有50个蓝藻附生细菌OTUs的相对丰度也随季节发生变化，其中有16个OTUs是Cytophagaceae，以往报道称Cytophagaceae属于异养菌，可以消耗大分子如蓝细菌细胞分泌的多糖或蛋白质。三个时期转录子的相对丰度也发生变化，这些转录子与光系统和亚基核糖体蛋白有关。光系统与一天中白昼的长度有关，而核糖体亚基蛋白质与转录有关，因此转录子丰度越高，表明产生的蛋白质越多，生物量越大，生长速度也越快。在藻华爆发前期，蛋白质分泌系统和ABC转运蛋白相关基因的表达显著上调，这意味着前期微生物之间频繁物质交换和信号传导。光合子系统的表达在中期显著上调，这可能是由于中期藻华爆发而引起蓝细菌大量繁殖和快速生长所致。另外，与其他两个时期相比，中期的基因和转录子数量更多、功能多样性更高，这都是为了适应蓝藻藻华爆发。

2 蓝细菌的能量路径和转运蛋白表现出较高的多样性

在系统发生树中，蓝细菌基因组图（MAGs）可分为三组。第1组中的两个蓝细菌菌株均属于微囊藻（Microcystis），但其代谢却有很大不同。Microcystis的代谢多样性与其基因型和表型相关，并且在大量的插入因子、转座因子、限制性酶和可通过横向转移获得的基因存在的情况下更明显。第2组菌株与Dolichospermum相近，其可以运输维生素B12，这验证了蓝细菌从与其合成相关的细菌中获取维生素以及异养细菌可获得光合产物两点假设。第3组菌株接近Pseudanabaena，其具有三种与CRISPR相关的蛋白Csm1、Cmr3和Cmr4。我们的结果证明，光合蓝细菌缺乏普通细菌中与CASCADE复合物相关的Cas-蛋白的同源物，但拥有Cmr蛋白。此外，MAG-151222.71.fa可以合成鞭毛和大量转运蛋白，并且有氮、磷、硫多种能量路径。一方面，在蓝细菌的胞外多糖形成的粘性环境下，鞭毛可以助其移动。另一方面，丰富的转运蛋白使其可以与蓝细菌充分交换养分和有机物质。转运蛋白也可以运输某些金属元素，一定程度也表明了微量金属元素对细菌生长繁殖的重要性。此外，MAG-151222.71.fa同时具有氮代谢途径-将硝酸盐转化为氨、硫代谢途径-将硫代硫酸盐转化为硫酸盐，脂肪酸代谢途径-将乙酰辅酶A转化为棕榈酸、氧化磷酸化放能途径-通过呼吸电子传递链将ADP和无机磷酸合成ATP。这一发现证明了蓝细菌的附生细菌通常是高度进化的。

3 微生物参与共氮、共磷代谢通路

多种蓝细菌及其附生细菌参与了氮循环或者磷循环的共通路。微生物的这种功能联系一定程度可以解释氮、磷驱动的微生物类群和功能的动态变化的原因。我们的结果发现，Microcystis和 Dolichospermum分别在中期和后期利用不同的基因将胞外亚硝酸盐和硝酸盐转运到细胞内。另外，在后期，Dolichospermum固氮为氨。由于不同蓝细菌吸收和利用氮的能力不同，湖泊中总氮的变化也在一定程度上影响优势蓝细菌的更替。除了Danichospermum，固氮蓝细菌Aphanizomenon在后期也表现出较高的丰度；在藻华后期，这两种菌可能会释放大量氨到蓝藻群体颗粒中，为生态系统提供了可利用氮，也解释了这一时期水体总氮含量高的原因。此外，在后期，Aphanizomenon丰度也变高，其可限制其他浮游植物体内的磷酸盐含量，同时还通过释放柱孢藻毒素增加自身磷酸盐的利用率。在前期的磷循环通路中，我们中检测到了Comamonadaceae willems，其被证明是一种具有多样性表型的好氧菌，包括一些厌氧反硝化细菌、光自养细菌和光异养细菌。

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